Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Een vereenvoudigde en efficiënte methode om te isoleren van de primaire mens keratinocyten van volwassen huidweefsel

Published: August 25, 2018 doi: 10.3791/57784
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 3, 1, 1,2
1Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration and Laboratory for Tissue Engineering and Regeneration, School of Stomatology, Shandong University, 2Suzhou Institute of Shandong University, 3Department of Urology, Qilu Hospital of Shandong University

Summary

Hier presenteren we een protocol om efficiënt isoleren primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid weefsels. Deze methode vereenvoudigt de conventionele procedure met behulp van de Y-27632 van de Inhibitor van de omwenteling ROCK in het medium van de inoculatie spontaan epidermale cellen uit dermale cellen scheiden.

Abstract

Primaire menselijke keratinocyten van frisse huid weefsels en hun expansie in vitro geïsoleerd hebben wijd gebruikt voor laboratoriumonderzoek en klinische toepassingen. De isolatie van de conventionele methode van menselijke keratinocyten impliceert een sequentiële enzymatische spijsvertering-procedure in twee fasen, die heeft bewezen bij het genereren van primaire cellen van volwassen weefsels als gevolg van de lage cel terugvinding en de verminderde cel inefficiënt te zijn levensvatbaarheid. Onlangs meldden wij een geavanceerde methode om te isoleren van de menselijke primaire epidermale voorlopercellen van huid weefsels die gebruikmaakt van de Rho kinase inhibitor Y-27632 in het medium. Vergeleken met de traditionele protocol, deze nieuwe methode is eenvoudiger, makkelijker en minder tijdrovend, en verhoogt de cel van de stam van de epitheliale opbrengst en verbetert hun kenmerken van de cel van de stam. Bovendien, de nieuwe methodologie hoeft niet de scheiding van de epidermis van de dermis, en is daarom geschikt voor het isoleren van de cellen van verschillende types van volwassen weefsels. Deze nieuwe methode van de isolatie overwint de grote tekortkomingen van conventionele methoden en is meer geschikt voor de productie van grote aantallen epidermale cellen met hoge potentie zowel voor laboratorium klinische toepassingen. Hier beschrijven we de nieuwe methode in detail.

Introduction

Het doel was het ontwikkelen van een eenvoudige en efficiënte protocol om te isoleren van de primaire mens keratinocyten (HKCs) uit volwassen weefsel, met name voor klinische toepassingen. Huid epidermal stamcellen, gelokaliseerd in de basale laag van de huid, bezitten een groot potentieel om te vermenigvuldigen en te onderscheiden en te voorzien van keratinocyten om de functies van de huid1,2,3, 4. HKCs geïsoleerd uit de huid weefsels veel voor huid weefsel engineering en regeneratie doeleinden, vooral in het herstel van beschadigde huid en in de therapie van het gen voor klinische toepassingen5,6 gebruikt worden. Het hoofdthema voor HKC gebaseerde toepassingen is efficiënt isoleren en uitbreiden van grote aantallen HKCs met hoge potentiële in vitro7,8. Hoewel verschillende onderzoeksgroepen hebben methodes voor de productie van culturen van stam-achtige HKCs ontwikkeld, zijn deze methoden soms tijdrovend en ingewikkeld uit te voeren en hebben andere beperkingen, zoals lage cel opbrengsten en wordt beperkt door het type van huid specimen 9gebruikt. Bijvoorbeeld, impliceert de traditionele methode om te isoleren van de HKCs van de huid weefsels een tweestaps enzymatische spijsvertering met een scheiding van de epidermis van de dermis6. Deze methode werkt meestal goed voor neonatale weefsels, maar het zeer moeilijk zijn wanneer gebruikt voor het isoleren van cellen uit volwassen weefsel wordt.

Y-27632, een inhibitor van de omwenteling van Rho-geassocieerde proteïne kinase (ROCK), is gemeld aan het aanzienlijk verbeteren van de efficiëntie van de cel van de stam van de epidermale isolatie en kolonie groei10,11,12. In een eerdere studie ontdekten we dat Y-27632 de klonale groei van epidermale cellen vergemakkelijkt, maar het rendement van dermale cellen vermindert door het differentieel beheersen van de expressie van hechting moleculen13. Wij ook vastgesteld een nieuw geconditioneerde inoculatie medium, G-medium, ter ondersteuning van de groei en rendement van primaire epidermale cellen genoemd. Door het combineren van G-medium met Y-27632, kan deze nieuwe methode spontaan epidermale en dermale cellen scheiden na enzym spijsvertering, waardoor de stap van13,14van de scheiding van de epidermis-dermis. Op basis van eerdere verslagen, beschrijven we nu de gedetailleerde procedure voor deze nieuwe methode om te isoleren van de HKCs van volwassen huidweefsel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Menselijke weefsels gebruikt in dit protocol hebben behandeld volgens de richtlijnen van de instelling menselijke onderzoek ethische Commissie (NO.2015120401, datum: 12 mei 2015).

1. voorbereiding

  1. Verzamel verse volwassen buikhuid weefsels verwijderd van plastische chirurgie in het ziekenhuis in een tube van 50 mL met 10 mL ijskoud Dulbecco gewijzigd van Eagle medium (DMEM). Het model kan worden bewaard bij 4 ° C voor maximaal 72 uur zonder aanzienlijke invloed zijn op de levensvatbaarheid van de cellen.
  2. De reagentia en voedingsbodem voorbereiden zoals hieronder beschreven.
    1. Voeg 1 mL penicilline (100 U/mL) en streptomycine (100 mg/L) aan 50 mL fosfaatgebufferde oplossing (PBS) ter voorbereiding van de Supermarket-oplossing.
    2. Twee sets van enzym spijsvertering oplossingen voor te bereiden: (1) bereiden 50 mL dispase (2,5 mg/mL in DMEM) en 50 mL typ ik collagenase (2,5 mg/mL in DMEM) apart voor de conventionele methode; en (2) bereiden 50 mL van een mengsel van dispase en typ ik collagenase (Los 125 mg dispase poeder en 125 mg type ik collagenase poeder in 50 mL DMEM) voor de nieuwe methode.
      Opmerking: Alle enzym oplossingen moeten worden gefilterd met een zeef 0.22-µm en gehouden at4 ° C.
    3. Bereiden van spijsvertering oplossingen voor beide methoden: trypsine van 0,05% en 0,25% trypsine commercieel werden aangekocht. Bereiden van een 10 mg/mL DNase ik oplossing door ontbinding van 50 mg DNase ik poeder in 5 mL PBS, filteren met een zeef 0.22-µm, en opgeslagen bij-20 ° C.
    4. Bereiden van 500 mL medium te neutraliseren de enzymatische spijsvertering: DMEM medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine.
    5. Bereiden van 500 mL van inoculatie medium (groei-factor-bevattende medium, genaamd G-medium): DMEM/F12 (3:1) medium dat 1% penicilline/streptomycine, 40 µg/mL fungizone, 40 ng/mL fibroblast groeifactor 2 (FGF2), 20 ng/mL epidermale groeifactor (EGF), en 2% B27 supplement.
    6. Voorbehandeling van 100 mm celkweek gerechten met 2 mL van coating matrix met type I collageen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

2. de conventionele methode

  1. Huid weefsel voorbehandeling
    1. Neem 1.5 cm,2 van huidweefsel en wassen het 1 x met 10 mL PBS; Spoel het daarna met 10 mL 70% ethanol voor 30 s en Incubeer het 2 x met 10 mL oplossing (PBS met 2% penicilline en streptomycine), 5 minuten elk te wassen.
      Opmerking: Alle wast zijn uitgevoerd in 100-mm cel cultuur gerechten binnen een laminaire flow-kap.
    2. Trim het weefsel met een steriele schaar verwijderen van de subcutane vetlaag in een schaal van 100-mm cel cultuur en, vervolgens, weeg het huidweefsel (het gewicht is 1 g in dit protocol).
      Opmerking: Voldoende trimmen is zeer cruciaal voor de efficiënte scheiding van de epidermis van de dermis. De gelige vetlaag kan visueel gemakkelijk worden onderscheiden.
    3. Het weefsel overbrengen in een andere 100-mm steriele schotel met de dermis zijde naar beneden, en snijd vervolgens het huidweefsel in 3 - tot 4-mm brede stroken met behulp van een scalpel blad.
      Opmerking: De dermis kant met de vetlaag is visueel gemakkelijk herkend.
    4. Voeg 10 mL van 2,5 mg/mL dispase oplossing naar de huid weefsels in een schaal van 100-mm cultuur en, vervolgens, Incubeer de schotel 's nachts bij 4 ° C (niet meer dan 20 h).
      Nota: Het bedrag van de dispase oplossing kan worden berekend met behulp van 10 mL dispase oplossing voor de vertering van elke gram weefsel.
  2. Scheiding van de epidermis van de huidweefsel
    1. Op de tweede dag, afschilferen de opperhuid van de dermis, met behulp van fijne pincet.
      Opmerking: Als het is moeilijk om het afschilferen van de epidermis, de dispase spijsvertering was niet voldoende, die is meestal te wijten aan onvoldoende trimmen van het weefsel. Het weefsel moet in dit geval een langere incubatietijd.
    2. Mince de gepelde epidermis met 500 µL cultuurmedium van de cellen in een weefsel drijfmest met scalpel messen; vervolgens het resuspendeer met 10 mL van 0,25% trypsine in een tube van 50 mL en Incubeer het 20 min in een waterbad bij 37 ° C, met schudden.
  3. Verzamelen en kweken van primaire cellen
    1. Neutraliseer de trypsine-activiteit door een gelijk volume neutralisatie oplossing (10 mL in dit protocol) toe te voegen.
    2. Distantiëren van de epidermale cellen door de oplossing op en neer 20 x pipetteren met een serologische pipet 10 mL en laat de oplossing van de cel door een 100-µm cel zeef te verwijderen van alle resterende weefsel puin.
    3. Centrifugeer het cell-oplossing bij 200 x g gedurende 5 min na filtratie; resuspendeer de pellet cel in neutralisatie medium voor wassen en Centrifugeer het vervolgens weer bij 200 x g te verkrijgen van de cel-pellet.
    4. Resuspendeer de pellet cel in 10 mL van lage-calcium, serumvrij Keratinocyt medium (SFM). Neem 10 µL van deze oplossing naar de cel Totaal aantal tellen en, vervolgens, ongeveer 2 x 106 cellen plaat met 10 mL SFM tot 100 mm cel cultuur gerechten voorbehandeld met coating matrix (bevattende type I collageen).
      Opmerking: Coating is een noodzakelijke stap voor de conventionele methode.
    5. Wijzig het kweekmedium elke 2 d.
      Opmerking: Controleer de cel adhesie onder een Microscoop vóór en na het wijzigen van het kweekmedium.
    6. Passage van de cellen wanneer ze ongeveer 80 bereiken % samenvloeiing.
      Opmerking: Alle cultuur gerechten zijn voorbehandeld met de coating-matrix.

3. de nieuwe methode

  1. Huid weefsel voorbehandeling
    1. Het verzamelen van het weefsel zoals beschreven hierboven (stap 2.1) voor de conventionele methode.
    2. Wassen van de huidweefsel 1 x met 10 mL PBS en weeg het vervolgens in een steriele plastic container door een elektronische schaal (het gewicht is ongeveer 1 g in dit protocol).
      Opmerking: Het minimum gewicht van weefsel die nodig zijn voor dit protocol is 0.1 g, omdat het moeilijk te verkrijgen van een voldoende aantal cellen als het weefsel model gebruikt te klein is. Er is geen maximumgewicht van weefsel voor dit protocol, die uiteindelijk afhankelijk van de capaciteit van de behandeling van de exploitant.
    3. Pincet gebruiken om te spoelen het huidweefsel met 70% ethanol voor 30 10 mL s.
    4. Incubeer het weefsel 2 x met 10 mL van oplossing (bereid in stap 2.1.1), gedurende 5 minuten wassen elke keer.
      Opmerking: Alle wassen stappen hierboven zijn uitgevoerd in 100-mm cel cultuur gerechten binnen in een laminar flow hood (een weefselkweek kap).
    5. Het weefsel overbrengen in een andere 100-mm cel cultuur steriele schotel.
    6. Met scalpel messen, blad voor het weefsel grondig in een weefsel drijfmest.
    7. Voeg 200 µL van PBS elke 5 min om te houden van de natte weefsels.
      Opmerking: Duren ongeveer 15 min. voor stappen 3.1.5 - 3.1.7. Alle bovenstaande stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
  2. Vertering van huidweefsel
    1. Breng de oplossing van de gehomogeniseerde weefsel in een 50 mL-buis. Voeg 10 mL van enzym mengsel voor elke 1 g van huidweefsel. Meng de enzymen met het gehomogeniseerde weefsels.
    2. Incubeer het mengsel met schudden in een waterbad bij 37 ° C gedurende 1 uur.
    3. Voeg een 1/5-volume van 0,25% trypsine (2,5 mL in dit protocol) aan de spijsvertering-mengsel voor een ander 30 minuten in een waterbad bij 37 ° C.
    4. Toevoegen van DNase ik oplossing aan het enzym mengsel bij een verhouding van 1:100 (v/v) (250 µL in dit protocol) en laat het 5 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
  3. Verzamelen en kweken van primaire cellen
    1. Stop het spijsverteringsproces door toevoeging van 12,5 mL van neutralisatie medium in een 1:1 verhouding. Pipetteer op en neer de oplossing voor ongeveer 20 x, met behulp van serologische Pipetteer 10 mL te distantiëren van de cellen.
    2. Filtreer de gedissocieerde cellen door een 100-µm cel zeef te verwijderen van het puin van het weefsel. Centrifugeer het supernatant bij 200 x g gedurende 5 min. Let op de pellet aan de onderkant van de buis.
    3. Verwijder het supernatant en wassen van de cel pellet met 10 mL van neutralisatie medium, en centrifuge weer bij 200 x g gedurende 5 min voor het verzamelen van de cellen.
    4. Resuspendeer de pellet cel in 10 mL van inoculatie medium (G-medium uit stap 1.2.5) met 10 µM van Y-27632.
    5. Neem 10 µL van de oplossing voor de cel Totaal aantal tellen en, vervolgens, ongeveer 2 x 106 cellen plaat met 10 mL voor G-medium in een schotel van 100 mm cel cultuur.
      Opmerking: De precoating stap is niet nodig voor de nieuwe methode, en geen verwijdering van de dermale laag is niet vereist.
    6. Na de 3 d, vervangt u het medium inoculatie met lage-calcium SFM medium. Wijzig het kweekmedium elke 2 d.
      Opmerking: Controleer de cel adhesie vóór en na het wijzigen van het medium.
    7. Passage van de cellen wanneer ze ongeveer 80 bereiken % samenvloeiing.
      Opmerking: Indien nodig, voorbehandeling van de cellen met 0,05% trypsine gedurende 2 minuten en wassen van de cellen met PBS te verwijderen dermale cellen besmetten voordat de trypsinizing van de epidermale cellen.

4. de cel Passaging

  1. Verwijder het medium, wassen van de cellen met PBS en, dan, voeg 2 mL 0,05% trypsine (per elke 100 mm schotel).
  2. Incubeer de cellen in een incubator (37 ° C met 5% CO2) gedurende 5 minuten.
  3. Controleer de cellen met behulp van een microscoop om ervoor te zorgen dat alle cellen hebben losgemaakt van de cultuur-schotel.
  4. Voeg 8 mL DMEM met 10% FBS te neutraliseren van de enzymatische reactie, vervolgens verzamelen de cellen in een buis 15 mL.
  5. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min te verkrijgen van de cel-pellet.
  6. Verwijder de bovendrijvende vloeistof langzaam en vervolgens resuspendeer de pellet cel met 10 mL van SFM medium en het aantal cellen tellen.
  7. 1 x 10 bord6 cellen met 10 mL SFM in elke cel van de 100-mm schotel.
  8. Het medium elke 2 d te wijzigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Schema's van de nieuwe methode (figuur 1A) en de conventionele methode (figuur 1B) worden weergegeven in Figuur 1. De conventionele methode is een tweestaps spijsvertering, waarvoor de procedure van een 2-daagse. De nieuwe methode is daarentegen een one-step spijsvertering, die ongeveer 3 uur duurt uit te voeren. Nog belangrijker is, kunt de nieuwe methode van one-step verkrijgen twee populaties (epidermale en dermale cellen) op hetzelfde moment, die afhangt van de aanwezigheid van Y-27632 in het medium van de inenting. Bovendien, de eerste tijd cultuur van epidermale cellen tot ongeveer 80% samenvloeiing duurt meestal ten minste 3 dagen minder dan de conventionele methode als hetzelfde aantal cellen is geënt na isolatie.

De nieuwe methode levert meer primaire epidermale cellen, die in de morfologie van een kolonie groeien. De geïsoleerde HKCs van menselijke huid weefsels waren geënt met G-medium met Y-27632. Hetzelfde aantal cellen werden verguld na de conventionele methode als het besturingselement. Representatieve beelden van de epidermale cellen dagen 3 en5 na de eerste inenting worden getoond in figuur 2A. De cellen verkregen van de nieuwe methode de neiging om te groeien als een kolonie morfologie. De groeikromme na inoculatie werd beoordeeld met behulp van een cel tellen kit-8 (CCK-8) op verschillende tijdstippen na inoculatie (figuur 2B), en de verdubbeling tijd is ongeveer 3-4 dagen voor cellen die zijn bereid volgens de nieuwe methode maar is ongeveer 6-8 dagen voor de conventionele methode. Op dag 7, werden de opbrengsten van de cellen berekend. De resultaten worden weergegeven in figuur 2C, waaruit blijkt dat de nieuwe methode drie keer meer cellen dan de conventionele methode en dat de tijd die nodig is leverde te bereiken van samenvloeiing na de eerste inenting ten minste 3 dagen was minder (figuur 2D). Op dag 7 bereikt de epidermale cellen samenvloeiing met de nieuwe methode, maar niet met de conventionele methode (figuur 2D).

De nieuwe methode versterkt de uitdrukking van α6-integrine door de primaire cellen. Α6-integrine heeft aangetoond dat het zeer worden uitgedrukt door epidermal stamcellen15. De kenmerken van huidcellen basale cellen geïsoleerd door de nieuwe methode gehandhaafd na verscheidene passages. Kolonie groei is een van de kenmerken van de epidermale cellen van de stam afgeleid van de basale laag van de huid, en een hoog niveau van meningsuiting α6-integrine is een ander kenmerk van deze epidermal stamcellen. We vonden dat de toevoeging van Y-27632 aanzienlijk verhoogd de uitdrukking van α6-integrine in epidermale cellen bij passage 3 (Figuur 3A-B), en bij passage 3, epidermale cellen geïsoleerd met behulp van de nieuwe methode Toon geen besmetting door dermale cellen 13. het is zeer belangrijk om te blijven maken van de functies van de basale cel na verscheidene passages tijdens in vitro expansie. Immunofluorescentie (IF) analyse van de basale cel marker keratine 5 en de terminal differentiatie marker loricrin16 werd uitgevoerd met die cellen na drie passages. We vonden dat 90% van alle cellen K5-positief waren, maar minder dan 10% van hen loricrin (Figuur 3 c - 3D) uitgedrukt. Deze resultaten wijzen erop dat primaire HKCs geïsoleerd met behulp van de nieuwe methode de epidermale cel van de stam van de bevolking bevatten en de meest karakteristieke kenmerken van basale cellen kunnen handhaven. Maar hoe langer dat HKCs zijn gepasseerd, hoe meer ze beginnen te onderscheiden. Door de nieuwe methode vonden we dat epidermale cellen gekweekt in vitro kon handhaven hun proliferatie vermogen tot passage 8. Tot slot testten wij de zuiverheid van de epidermale cellen geïsoleerd met behulp van de nieuwe methode, aangezien een mengsel van epidermale en dermale cellen was geënt direct na isolatie. Met een korte tijd (2-3 min) behandeling met trypsine te verwijderen van een paar dermale cellen besmetten de oorspronkelijke cultuur, is een relatief zuiver bevolking van epidermale cellen verkregen na een passage (Figuur 4).

Figure 1
Figuur 1 : Vergelijking van de nieuwe en conventionele isolatie procedures. (A) dit paneel een schematische voorstelling afgebeeld van de nieuwe methode van de isolatie. Op dag 1, worden de gedissocieerde huidcellen geïnoculeerd in G-medium met of zonder Y-27632. In aanwezigheid van Y-27632 voor 2 dagen, de epidermale cellen selectief uit te breiden. Rond dag 6, bereiken de cellen op een dichtheid voldoende voor passaging. (B) dit paneel een schematische voorstelling afgebeeld van de isolatie van de conventionele methode. De epidermis wordt gescheiden van de dermis en de epidermale cellen zijn geïsoleerd op dag 2, en meestal, de cellen een dichtheid voldoende voor ongeveer 10 dagen passaging bereiken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : De nieuwe methode van de isolatie verhoogt het rendement van primaire epidermale cellen. (A) de vertegenwoordiger van dit paneel toont beelden van epidermale cellen, bereid door de nieuwe methode (bovenste rij) en de conventionele methode (onderste rij) dagen 3 en5 na de eerste inenting. De schaal balken = 200 µm. (B) primaire HKCs bereid door de nieuwe en de conventionele methoden werden verzameld op de aangegeven tijd punten voor de analyse van levensvatbare cellen met behulp van een cel tellen kit-8 (CCK-8). (C) het totale aantal cellen uitgewerkt door de nieuwe methode en met de conventionele methode telde op dag 7 na inoculatie. (D) de gemiddelde tijd tot samenvloeiing van primaire epidermale cellen (doorgang 0) weergegeven voor zowel de nieuwe methode van de isolatie en de conventionele methode. Voor de panelen B - D: de Student t-test werd gebruikt; de foutbalken Toon de standaard variatie; n = 4; p < 0,01, * p < 0.05 bij het vergelijken van de nieuwe methode met de conventionele methode. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Primaire epidermale cellen verkregen door de nieuwe methode zijn in staat om basale cel functies tijdens in vitro uitbreiding. (A) dit deelvenster bevat een analyse van de FACS van α6-integrine uitdrukking van epidermale cellen bij passage 3 behandeld met Y-27632 (Y-27632, rood) of zonder Y-27632 (control, grijs) voor 48 h. (B) dit paneel toont een analyse van de kwantificering van cellen met een hoge expressie niveaus van α6-integrine van paneel A; hoge α6-integrine expressie wordt gedefinieerd als een signaal > 103, ** p < 0,01. (C) dit paneel toont beelden van de vertegenwoordiger van de immunofluorescentie kleuring van K5 (rood) en loricrin (rood); DAPI (blauw) werd gebruikt om de vlek kernen. De schaal balken = 100 µm. (D) dit paneel toont een analyse van de kwantificering van de K5 - en loricrin-positieve cellen. Een totaal van 400 cellen werden geteld om te kwantificeren van elke groep, en het gemiddelde aantal K5 - en loricrin-positieve cellen worden weergegeven. Het experiment werd onafhankelijk 4 keer herhaald. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Na de eerste passage, relatief zuiver epidermale cellen werden verkregen met behulp van de nieuwe methode. (A) dit paneel toont representatieve beelden van immunofluorescentie kleuring van vimentin (rood) voor epidermale cellen op passages 0 (P0) en 3 (P3); DAPI (blauw) werd gebruikt om de vlek kernen. De schaal balken = 50 µm. (B) dit paneel toont een analyse van de kwantificering van de vimentin-positieve cellen bij passages 0 (P0) en 1 (P1). Een totaal van 400 cellen werden geteld om te kwantificeren van elke groep, en het gemiddelde aantal vimentin-positieve cellen wordt weergegeven. Het experiment werd onafhankelijk 4 keer herhaald. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gekweekte primaire HKCs hebben grote schaal gebruikt voor de behandeling van wonden in klinieken voor meer dan drie decennia, en sinds die tijd, het is altijd belangrijk geweest voor efficiënt voldoende aantallen cellen voor klinische toepassingen te verkrijgen in een tijdige wijze. Daarom, in de praktijk, de conventionele isolatie-methode, waarbij de scheiding van de epidermis van de dermis, maakt het moeilijk om te voldoen aan deze eisen, als gevolg van de lage opbrengst van de cellen en het lage vermogen om de passage van volwassen cellen. Hier beschrijven we een nieuwe eenvoudige methode die we ontwikkeld om efficiënt te verkrijgen HKCs volwassen weefsel op basis van eerdere verslagen13,14, die is meer geschikt zowel voor laboratorium klinische toepassingen.

Aandacht moet worden besteed aan de volgende kritische stappen om de beste resultaten voor de nieuwe methode. Ten eerste, de homogenisering procedure is een cruciale stap; onvoldoende homogenisering zullen duidelijk van invloed op de efficiëntie van enzymatische spijsvertering en resulteren in een lage rendement van gedissocieerde cellen. Ten tweede, de trypsine spijsvertering stap moet niet meer dan 30 min; anders, de levensvatbaarheid van de gedissocieerde cellen zal afnemen. Ten derde, voor het efficiënt verzamelen van de gedissocieerde cellen, moet de poriegrootte van de zeef van de cel gebruikt voor filtratie 100 µm, en een enkele zeef moet worden gebruikt voor het filteren van niet meer dan 20 mL van de oplossing van de cel. Ten vierde, de dichtheid van het eerste laagje is een belangrijke factor om te minimaliseren van verontreiniging met dermale cellen, omdat een hoge celdichtheid aanzienlijk het remmende effect van Y-27632 op dermale cellen vermindert. Daarom is het cruciaal om nauwkeurig te tellen het totale aantal gedissocieerde cellen aan het einde van de procedure van de isolatie voordat plating.

Ten eerste, de nieuwe methode vereenvoudigt de isolatie-procedure: de procedure in twee fasen conventionele isolatie duurt meestal 2 dagen uit te voeren, en de procedure trimmen is cruciaal voor het volledig verwijderen van het vetweefsel van de huid, vooral voor volwassen weefsels ( Figuur 1); anders zal er een inefficiënte scheiding van de epidermis van de dermis na overnachting spijsvertering met dispase. Door te profiteren van Y-27632, die de groei van huid cellen na inoculatie13 remt, de nieuwe methode hoeft niet te scheiden van de epidermis van de dermis en, dus, het trimmen procedure voor het verwijderen van het vetweefsel is niet nodig voor de nieuwe methode, die alleen een halve dag moet moet worden uitgevoerd. Ten tweede, de nieuwe methode ook vereenvoudigt de procedure cultuur sinds, met de traditionele methode, de gedissocieerde cellen worden meestal gekweekt op een laag feeder van bestraalde muis fibroblasten in medium met 10% FBS of in een collageen-voorgelakt schotel. Dierlijke bestanddelen zijn altijd risico factoren die moeten worden vermeden voor klinische toepassingen. We ontwikkelden een serumvrij geconditioneerde inoculatie medium (G-medium), dat niet vereist dat een precoating stap voor cultuur gerechten en ook verbetert het rendement van primaire keratinocyten13 omdat G-medium gecombineerd met Y-27632 de bevestiging van bevordert epidermale cellen aan de cultuur schotel13,17,18. Daarom is de nieuwe methode vergemakkelijkt de procedure cultuur en is ook een relatief veilige procedure voor klinische toepassingen zonder de toevoeging van dierlijke bestanddelen. Ten derde, de nieuwe methode verbetert het rendement van primaire epidermale cellen en verkort de tijd van de oorspronkelijke cultuur die nodig zijn voor het bereiken van de samenvloeiing. Vergeleken met de traditionele methode, de opbrengst van cellen geproduceerd door de nieuwe methode is ongeveer 3 keer zo hoog, en de eerste passage van epidermale cellen bereikt samenvloeiing ten minste 3 dagen eerder (Figuur 2). Ten slotte is de nieuwe methode kan worden gebruikt voor de isolatie van epidermale cellen tegen alle typen van specimens van de huid, zoals de behaarde hoofdhuid huid en volwassen huid weefsel met een dikke vetlaag, die in een vorige verslag13zijn getest.

De primaire HKCs hoog potentieel hebben wijd gebruikt voor laboratoriumonderzoek en klinische toepassingen. Deze nieuwe methode verbetert het vermogen van gekweekte cellen met kenmerken van epidermale cellen van de stam13. Y-27632 verbetert de α6-integrine-expressie door HKCs, en na drie passages, meer dan 90% van de gekweekte epidermale cellen uitgedrukt de basale cel marker keratine 5, en minder dan 10% van de cellen uitgedrukt de differentiatie markering Loricrin, waaruit blijkt dat deze cellen houden de kenmerken van basale huidcellen na verscheidene passages. De cultuur-uitgebreid epidermale cellen kunnen reconstrueren huid in vivo na enten13, suggereren dat ze regeneratie potentiële na uitbreiding in cultuur bezitten. De nieuwe methode is met name ideaal voor het isoleren van cellen volwassen weefsel, zoals hierboven vermeld. Daarom epidermale cellen bereid door deze methode kunnen worden gebruikt voor in vitro en in vivo modellen om te studeren ziekten van de huid en kunnen worden ontwikkeld tot autologe cel-gebaseerde producten voor klinische toepassingen zoals de behandeling van huid wonden.

Kortom biedt het nieuwe protocol een vereenvoudigde en doeltreffende procedure om te isoleren en primaire epidermale cellen van volwassen huidweefsel uit te breiden. Deze geavanceerde methode is meer geschikt voor de productie van grote aantallen hoog potentieel epidermale cellen zowel voor laboratorium klinische toepassingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de nationale sleutel onderzoek en ontwikkeling programma van China (2017YFA0104604), het algemene programma van nationale Natural Science Foundation van China (NSFC, 81772093), de wetenschap en de technologie ontwikkeling programma van Suzhou (ZXL2015128), de Natural Science Foundation van de oostelijke provincie Jiangsu (BK20161241), en een Shandong Taishan Scholar Award (tshw201502065).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Countess automated cell counter Invitrogen Inc.  C10227 Automatic cell counting 
CO2 Incubator Thermo Scientific 51026333 For cell incubating
Sorvall ST 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004380 Cell centrifuge
Constant Temperature Shaker Shanghai Boxun 150036 For water bath
Electronic Scale Harbin Zhonghui 1171193 For tissue weighing
Cell Culture Dish Eppendorf 30702115 For cell culture
50ml Centrifuge Tube KIRGEN 171003 For cell centrifuge
Cell Strainer Corning incorporated 431792 Cell filtration
Phosphate buffered solution Solarbio Life Science  P1020-500 Washing solution
DMEM Thermo Scientific C11995500 Component of neutralization medium
Defined K-SFM Life Technologies 10785-012 Epidermal cells culture medium
Penicillin Streptomycin Thermo Scientific 15140-122 Antibiotics
Fetal Bovine Serum Biological Industries 04-001-1AC5 Component of neutralization medium
0.05% Trypsin Life Technologies 25300-062 For HKC dissociation
0.25% Trypsin  Beijing Solarbio Science & Technology T1350-100 For HKC dissociation
Coating Matrix Kit Life Technologies R-011-K For coating matrix
Dispase Gibco 17105-041 For HKC isolation
Collagenase Type I Life Technologies 17100-017 For HKC isolation
Deoxyribonuclease I Sigma 9003-98-9 For HKC isolation
F12 Nutrient Mix, Hams Life Technologies 31765035 Component of G-medium
B27 Supplement Life Technologies 17504044 Growth factor in G-medium
FGF-2 Millipore Merck Biosciences 341595 Growth factor in G-medium
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503 ROCK inhibitor
Fungizone Gibco 15290026 Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human Protein Gibco PHG0311 Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8 Thermo Scientific NC9864731 cell proliferation and cytotoxicity assays
Mouse Anti-Human Cytokeratin5 Hewlett-Packard Development Company MA-20142 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Rabbit Anti-Human Loricrin Covance PRB-145p For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Mouse anti-human Vimentin Cell Signaling Technology 3390 For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts
Integrin α6(GOH3) Santa Cruz  SC-19622 flow cytometry analysis of HKCs
Rat IgG2a FITC Santa Cruz  SC-2831 negative control antibody of α6-integrin  in flow cytometry analysis 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
  2. Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. Development and homeostasis of the skin epidermis. Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383 (2012).
  3. Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. Epidermal stem cells - role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin. Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).
  4. Blanpain, C., Fuchs, E. Epidermal stem cells of the skin. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).
  5. Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2 (2013).
  6. Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
  7. Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing. Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).
  8. Hirsch, T., et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).
  9. Hentzer, B., Kobayasi, T. Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture. Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).
  10. Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
  11. Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
  12. Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).
  13. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
  14. Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. A new method to isolate human epidermal keratinocytes. Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).
  15. Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin). Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
  16. Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).
  17. Breyer, J., et al. Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).
  18. Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).

Tags

Ontwikkelingsbiologie kwestie 138 menselijke keratinocyten epidermale cellen van de stam dermale cellen primaire huid cel isolatie Keratinocyt cultuur Y-27632 Rho-geassocieerde kinase inhibitor regeneratie van de huid
Een vereenvoudigde en efficiënte methode om te isoleren van de primaire mens keratinocyten van volwassen huidweefsel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Z., Wen, J., Leng, X., Zhou,… More

Liu, Z., Wen, J., Leng, X., Zhou, Q., Zhou, C., Zhao, H., Wu, X. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. J. Vis. Exp. (138), e57784, doi:10.3791/57784 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter