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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Un método simplificado y eficiente para aislar Keratinocytes humanos primarios de tejido adulto de la piel

Published: August 25, 2018 doi: 10.3791/57784
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 3, 1, 1,2
1Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration and Laboratory for Tissue Engineering and Regeneration, School of Stomatology, Shandong University, 2Suzhou Institute of Shandong University, 3Department of Urology, Qilu Hospital of Shandong University

Summary

Aquí presentamos un protocolo para aislar eficientemente keratinocytes humanos primarios de tejidos de la piel adulta. Este método simplifica el procedimiento convencional mediante el uso de la Y-27632 del inhibidor de la roca en el medio de inoculación separar espontáneamente las células epidérmicas de las células cutáneas.

Abstract

Keratinocytes humanos primarios aislados de los tejidos de la piel fresca y su expansión en vitro han sido ampliamente utilizados para la investigación de laboratorio y para usos clínicos. El método de aislamiento convencionales de keratinocytes humanos implica un procedimiento de digestión enzimática secuencial de dos etapas, que ha demostrado ser ineficiente en la generación de primario de células de tejidos adultos debido a la tasa de recuperación celular baja y reducida de la célula viabilidad. Recientemente nos informó un método avanzado para aislar las células progenitoras epidérmico primario humano de tejidos de la piel que utiliza el inhibidor de la cinasa Rho Y-27632 en el medio. En comparación con el protocolo tradicional, este nuevo método es más simple, más fácil y menos desperdiciadora de tiempo y aumenta la producción de células madre epiteliales y realza sus características de la célula de vástago. Además, la nueva metodología no requiere la separación de la epidermis de la dermis y por lo tanto, es conveniente para aislar células de diferentes tipos de tejidos adultos. Este nuevo método de aislamiento supera las principales deficiencias de los métodos convencionales y es más conveniente para producir gran número de células epidérmicas con alta potencia para laboratorio y aplicaciones clínicas. Aquí, describimos el nuevo método en detalle.

Introduction

El objetivo era desarrollar un protocolo sencillo y eficaz para aislar queratinocitos humanos primaria (HKCs) de tejidos adultos, especialmente para aplicaciones clínicas. La piel las células madre epidérmicas, localizadas en la capa basal de la piel, poseen un alto potencial para proliferar y diferenciarse y queratinocitos para mantener las funciones de la piel1,2,3, 4. HKCs aislados de la piel, los tejidos son ampliamente utilizados con fines piel tejido ingeniería y regeneración, especialmente en la reparación de la piel dañada y en terapia génica para aplicaciones clínicas5,6. La cuestión clave para aplicaciones basadas en HKC es aislar y ampliar el gran número de HKCs con alto potencial en vitro7,8. Aunque varios grupos de investigación han desarrollado métodos para producir cultivos de tallo-como HKCs, estos métodos son a veces lentos y complicados para realizar y tener otras limitaciones, tales como rendimientos bajos de células y está limitado por el tipo de espécimen de la piel usa9. Por ejemplo, el método tradicional para aislar HKCs de tejidos de la piel implica una digestión enzimática de dos etapas con una separación de la epidermis de la dermis6. Este método generalmente funciona bien para los tejidos neonatales, pero se hace muy difícil cuando se utiliza para aislar células de tejidos adultos.

Y-27632, un inhibidor de la cinasa de la proteína Rho (roca), se ha divulgado para mejorar significativamente la eficiencia de la célula de vástago epidérmicas aislamiento y Colonia de crecimiento10,11,12. En un estudio anterior, descubrimos que Y-27632 facilita el crecimiento clonal de las células epidérmicas, pero reduce el rendimiento de las células cutáneas controlando diferencialmente a la expresión de moléculas de adhesión13. También establecimos un nuevo medio de inoculación acondicionado, llamado G-medio, que apoya el crecimiento y rendimiento de las células epidérmicas primarias. Mediante la combinación de G-medio con Y-27632, este novedoso método espontáneamente puede separar las células epidérmicas y dérmicas después de la digestión de la enzima, eliminando así el paso de epidermis dermis separación13,14. Basado en informes anteriores, ahora Describimos el procedimiento detallado de este nuevo método para aislar HKCs del tejido de la piel adulta.

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Protocol

Tejidos humanos utilizados en este protocolo se han manejado según las directrices del Comité de ética de investigación de la institución (NO.2015120401, fecha: 12 de mayo de 2015).

1. preparaciones

  1. Tejidos de la piel abdominal adulto fresco recoger descartados de cirugía plástica en el hospital en un tubo de 50 mL con 10 mL de Dulbecco helada de modificado medio de Eagle (DMEM). La muestra puede conservarse a 4 ° C hasta 72 h sin afectar significativamente la viabilidad de las células.
  2. Preparar los reactivos y el medio de cultivo como se describe a continuación.
    1. Añadir 1 mL de la penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 mg/L) a 50 mL de solución tampón fosfato (PBS) para preparar la solución de lavado.
    2. Preparar dos series de soluciones de digestión enzimática: (1) preparar 50 mL de dispase (2,5 mg/mL de DMEM) y 50 mL de tipo I colagenasa (2,5 mg/mL de DMEM) por separado por el método convencional; y (2) preparar 50 mL de una mezcla de dispase y colagenasa de tipo I (disolver 125 mg de polvo dispase y 125 mg de tipo I polvo de colagenasa en 50 mL de DMEM) para el nuevo método.
      Nota: Todas las soluciones de enzima deben ser filtradas con un filtro de 0,22 μm y debe mantenerse at4 ° C.
    3. Preparar soluciones de digestión para ambos métodos: tripsina 0,05% y 0,25% de tripsina fueron comprados comercialmente. Preparar un 10 mg/mL DNasa I solución disolviendo 50 mg de la ADNsa polvo en 5 mL de PBS, filtrar con un filtro de 0,22 μm y almacenar a-20 ° C.
    4. Preparar 500 mL de medio para neutralizar la digestión enzimática: medio DMEM suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina.
    5. Preparar 500 mL de medio de inoculación (que contienen factor de crecimiento medio, llamado G-medio): DMEM/F12 (3:1) medio que contiene 1% de penicilina/estreptomicina, 40 μg/mL fungizone, 40 ng/mL factor de crecimiento fibroblástico 2 (FGF2), ng/mL 20 factor de crecimiento epidérmico (EGF), y Suplemento del 2% B27.
    6. Trate de cultivo celular de 100 mm platos con 2 mL de la matriz de la capa que contiene tipo y colágeno durante 30 min a temperatura ambiente.

2. convencional método

  1. Pretratamiento del tejido de la piel
    1. Tomar 1,5 cm2 de tejido de la piel y lavarlo 1 x con 10 mL de PBS; Luego, lo enjuague con 10 mL de etanol al 70% durante 30 s e incubarlo 2 x con 10 mL de solución (PBS conteniendo 2% penicilina y estreptomicina), de lavado de 5 minutos cada uno.
      Nota: Todos los lavados se realizan en platos de cultivo celular de 100 mm dentro de una campana de flujo laminar.
    2. Corte el tejido con tijeras estériles en eliminar la capa de grasa subcutánea en una placa de cultivo celular de 100 mm y, luego, pesan el tejido de la piel (el peso es 1 g en este protocolo).
      Nota: Recorte suficiente es esencial para la eficiente separación de la epidermis de la dermis. La capa de grasa amarillenta se puede fácilmente distinguir visualmente.
    3. Transferir el tejido a otro recipiente estéril de 100 mm con la parte de la dermis hacia abajo y, a continuación, cortar el tejido de la piel en tiras de 3 a 4 mm de ancho con una hoja de bisturí.
      Nota: La parte de la dermis con la capa de grasa es fácilmente reconocible visualmente.
    4. Añadir 10 mL de solución de dispase 2,5 mg/mL a los tejidos de la piel en una placa de cultivo de 100 mm y, a continuación, incubar el plato durante la noche a 4 ° C (no más de 20 h).
      Nota: La cantidad de solución dispase puede calcularse utilizando 10 mL de solución dispase para la digestión de cada gramo de tejido.
  2. Separación de la epidermis de los tejidos de la piel
    1. En el segundo día, desprenda la epidermis de la dermis con unas pinzas finas.
      Nota: Si es difícil despegarse de la epidermis, la digestión del dispase no era suficiente, que suele ser debido al ajuste insuficiente del tejido. En este caso, el tejido necesita más tiempo de incubación.
    2. Pique la epidermis pelada con 500 μl de medio de cultivo celular en una mezcla de tejido usando cuchillas de bisturí; Luego, suspender con 10 mL de tripsina 0,25% en un tubo de 50 mL y lo Incube 20 min en un baño de agua a 37 ° C, con agitación.
  3. Recolección y cultivo de células primarias
    1. Neutralizar la actividad de tripsina agregando un volumen igual de solución de neutralización (10 mL en este protocolo).
    2. Disociar las células epidérmicas por la solución de arriba y abajo 20 x el pipeteo con una pipeta serológica de 10 mL y pasar la solución de células a través de un colador de celda de 100 μm para eliminar cualquier residuo de tejido residual.
    3. Centrifugue la solución celular a 200 x g durante 5 minutos después de la filtración; Resuspender el precipitado de células en medio de neutralización para el lavado y, a continuación, centrifugar nuevamente a 200 x g para obtener el precipitado de células.
    4. Resuspender el precipitado de células en 10 mL de medio de keratinocyte baja en calcio, libre de suero (SFM). Tomar 10 μl de esta solución de contar el número total de células y, luego, la placa de aproximadamente 2 x 106 células con 10 mL de la OFS en 100 mm de la célula cultura platos pretratados con la matriz de la capa (que contiene colágeno tipo I).
      Nota: La capa es un paso necesario para el método convencional.
    5. Cambiar el medio de cultivo cada 2 d.
      Nota: Verifique la adhesión celular al microscopio antes y después de cambiar el medio de cultivo.
    6. Las células de paso al llegar a cerca de 80% confluencia.
      Nota: Todos los platos de cultura son pretratados con la matriz de la capa.

3. el nuevo método

  1. Pretratamiento del tejido de la piel
    1. Recoger el tejido tal como se describe arriba (paso 2.1) para el método convencional.
    2. Lavar el tejido de la piel 1 x con 10 mL de PBS y, a continuación, pesar en un recipiente de plástico estéril por una balanza electrónica (el peso es alrededor de 1 g en este protocolo).
      Nota: El peso mínimo del tejido necesario para este protocolo es 0.1 g, ya que es difícil obtener un número suficiente de células si la muestra de tejido que se utiliza es muy pequeña. No hay ningún peso máximo del tejido de este protocolo, que en última instancia depende de la capacidad de manejo del operador.
    3. Utilice pinzas para enjuagar el tejido de la piel con 10 mL de etanol al 70% durante 30 s.
    4. Incubar el tejido 2 x con 10 mL de solución (preparado en el paso 2.1.1), durante 5 minutos de lavado cada vez.
      Nota: Todos los pasos de lavado señalados se realizan en platos de cultivo celular de 100 mm dentro de una campana de flujo laminar (una campana de cultivo de tejidos).
    5. Transferir el tejido a otro recipiente estéril de 100 mm de la célula cultura.
    6. Usando las hojas de bisturí, pique bien el tejido en una mezcla de tejido.
    7. Añadir 200 μL de PBS a cada 5 min para mantener los tejidos húmedos.
      Nota: Tomar alrededor de 15 minutos para los pasos 3.1.5 - 3.1.7. Todos los pasos anteriores se realizan a temperatura ambiente.
  2. Digestión de los tejidos de la piel
    1. Transferir la solución del tejido homogeneizado en un tubo de 50 mL. Añadir 10 mL de mezcla de enzimas para cada 1 g de tejido de la piel. Homogeneizar las enzimas de los tejidos homogeneizados.
    2. Incubar la mezcla con agitación en un baño de agua a 37 ° C durante 1 h.
    3. Añadir un volumen de 1/5 de tripsina 0,25% (2,5 mL en este protocolo) a la mezcla de digestión por otro 30 min en un baño de agua a 37 ° C.
    4. Agregar ADNasa solución a la mezcla de enzima en una proporción de 1: 100 (v/v) (250 μl de este protocolo) e incubar por 5 min a temperatura ambiente.
  3. Recolección y cultivo de células primarias
    1. Detener el proceso de digestión mediante la adición de 12,5 mL de medio de neutralización en una proporción 1:1. Pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo para cerca de 20 x, utilizando una pipeta serológica de 10 mL para disociar las células.
    2. Filtrar las células disociadas a través de un colador de celular 100 μm para eliminar los desechos de tejido. Centrifugar el sobrenadante a 200 x g durante 5 min observar el sedimento en el fondo del tubo.
    3. Deseche el sobrenadante y lavar el sedimento celular con 10 mL de medio de neutralización y centrifugar nuevamente a 200 x g durante 5 minutos recoger las células.
    4. Resuspender el precipitado de células en 10 mL de medio de inoculación (G-medio de paso 1.2.5) con 10 μm de Y-27632.
    5. Tomar 10 μl de la solución para contar el número total de células y, entonces, la placa de unos 2 x 106 células con 10 mL de medio G en una placa de cultivo de 100 mm de la célula.
      Nota: El paso de diatomeas no es necesario para el nuevo método, y no retiro de la capa dérmica se requiere ya sea.
    6. Después de 3 d, sustituir el medio de inoculación con medio de SFM baja en calcio. Cambiar el medio de cultivo cada 2 d.
      Nota: Verifique la adhesión celular antes y después de cambiar el medio.
    7. Las células de paso al llegar a cerca de 80% confluencia.
      Nota: Si es necesario, use las células con tripsina 0,05% por 2 min y lavar las células con PBS para eliminar contaminantes de las células cutáneas antes de trypsinizing las células epidérmicas.

4. célula pases

  1. Quitarlo del medio, lavan las células con PBS y, luego, añadir 2 mL de tripsina 0,05% (por cada plato 100 mm).
  2. Incubar las células en una incubadora (37 ° C con 5% CO2) durante 5 minutos.
  3. Compruebe las células utilizando un microscopio para asegurarse de que todas las células han separado de la placa de cultivo.
  4. Añada 8 mL de DMEM con 10% FBS para neutralizar la reacción enzimática y, luego, recoger las células en un tubo de 15 mL.
  5. Centrifugue a 200 x g durante 5 min obtener el precipitado de células.
  6. Quite el sobrenadante lentamente y, luego, Resuspender el pellet celular con 10 mL de medio SFM y contar el número de células.
  7. Placa de 1 x 106 células con 10 mL de la OFS en cada plato de 100 mm de la célula.
  8. Cambiar el medio cada 2 días.

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Representative Results

Diagramas esquemáticos del nuevo método (figura 1A) y el método convencional (figura 1B) se presentan en la figura 1. El método convencional es una digestión de dos etapas, que requiere un procedimiento de 2 días. Por el contrario, el nuevo método es una digestión de un solo paso, que toma alrededor de 3 horas para llevar a cabo. Lo importante, el nuevo método de un solo paso puede obtener dos poblaciones (células epidérmicas y dérmicas) al mismo tiempo, que depende de la presencia de Y-27632 en el medio de la inoculación. Por otra parte, precocidad la inicial de las células epidérmicas para llegar a alrededor de 80% confluencia suele al menos 3 días menos que el método convencional si el mismo número de células se inocula después de aislamiento.

El nuevo método produce células epidérmicas más primarias, que crecen en una morfología de las colonias. El HKCs aislados de piel humana, los tejidos fueron inoculados con medio de G que contiene Y-27632. El mismo número de células fueron plateado siguiendo el método convencional como el control. Imágenes representativas de las células epidérmicas a 3 y 5 días después de la inoculación inicial se muestran en la figura 2A. Las células obtenidas del nuevo método que tiende a crecer como una morfología de las colonias. La curva de crecimiento después de la inoculación se evaluó mediante una célula contando kit-8 (CCK-8) en diferentes puntos temporales después de la inoculación (figura 2B), y el tiempo de duplicación es de alrededor 3-4 días para las células preparadas por el nuevo método pero es alrededor 6-8 días para la método convencional. En el día 7, se calcularon los rendimientos de las células. Los resultados se muestran en la figura 2, que muestra que el nuevo método rindió tres veces más células que el método convencional y el tiempo necesario para llegar a confluencia después de la inoculación inicial fue de al menos 3 días menos (Figura 2D). En el día 7, las células epidérmicas alcanzaron la confluencia con el nuevo método, pero no con el método convencional (Figura 2D).

El nuevo método mejora la expresión de integrina α6 con las células primarias. Α6 integrina se ha demostrado para ser altamente expresada por las células madre epidérmicas15. Células aisladas por el nuevo método mantienen las características de las células basales de la piel después de varios pasajes. El crecimiento de la Colonia es una de las características de las células madre epidérmicas derivadas de la capa basal de la piel, y un alto nivel de expresión de la integrina α6 es otra característica de estas células madre epidérmicas. Se encontró que la adición de Y-27632 aumentó significativamente la expresión de la integrina α6 en células epidérmicas en el paso 3 (Figura 3A-B), y en el paso 3, las células epidérmicas aisladas utilizando el nuevo método no mostrar ninguna contaminación por las células cutáneas 13. es muy importante mantener las características de células basales después de varios pasajes en vitro expansión. Se realizó análisis de inmunofluorescencia (IF) de la queratina de marcadores de células basales 5 y el marcador de diferenciación terminal loricrin16 con esas células después de tres pasos. Se encontró que 90% de todas las células eran K5-positivos pero menos del 10% de ellos expresó loricrin (figura 3 - 3D). Estos resultados indican que HKCs primarios aislados utilizando el nuevo método contienen una población de células madre epidérmicas y pueden mantener los rasgos característicos de células basales. Pero más que HKCs son pasados, más empiezan a diferenciar. Por el nuevo método, hemos encontrado que las células epidérmicas cultivadas en vitro podría mantener su capacidad de proliferación hasta el paso 8. Por último, probamos la pureza de las células epidérmicas aislado utilizando el nuevo método, ya que una mezcla de células epidérmicas y dérmicas se inoculó después de aislamiento. Con un tratamiento de corto plazo (2-3 min) con tripsina para eliminar las células cutáneas unas contaminando la cultura inicial, una población relativamente pura de las células epidérmicas se obtuvo después de un pasaje (figura 4).

Figure 1
Figura 1 : Comparación de los procedimientos de aislamiento convencionales y nuevas. (A) este panel muestra una representación esquemática del nuevo método de aislamiento. En el día 1, las células epiteliales disociadas se inoculan en medio de G con o sin Y-27632. En presencia de Y-27632 durante 2 días, las células epidérmicas se expanden selectivamente. En alrededor del día 6, las células alcanzan una densidad suficiente para pases. (B) este panel muestra una representación esquemática del método de aislamiento convencional. La epidermis está separada de la dermis y las células epidérmicas están aisladas en el día 2, y por lo general, las células alcanzan una densidad suficiente para pases en alrededor de 10 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : El nuevo método de aislamiento aumenta la producción de las células epidérmicas primarias. (A) este panel muestra representante de imágenes de las células epidérmicas, preparadas por el nuevo método (fila superior) y por el método convencional (fila inferior) a los 3 y 5 días después de la inoculación inicial. Las barras de escala = 200 μm. (B) primaria HKCs elaborado por los convencionales y los nuevos métodos se recolectaron en los puntos de tiempo indicado para el análisis de células viables mediante una célula contando kit-8 (CCK-8). (C) el número total de células preparadas por el nuevo método y por el método convencional se contaron en el día 7 después de la inoculación. (D) el tiempo promedio para llegar a la confluencia de las células epidérmicas primarias (paso 0) se muestra el nuevo método de aislamiento y el método convencional. Para paneles B - D: de Student t-test se utilizó; las barras de error muestran la variación estándar; n = 4; p < 0.01, * p < 0.05 al comparar el método nuevo con el método convencional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Células epidérmicas primarias obtenidas por el método nuevo son capaces de mantener características de células basales durante el en vitro expansión. (A) este panel muestra un análisis FACS de la expresión de integrina α6 de células epidérmicas en el paso 3 tratado con Y-27632 (Y-27632, rojo) o sin Y-27632 (control, gris) para 48 h. (B) este panel muestra un análisis de cuantificación de células con alta niveles de expresión de la integrina α6 del panel A; la expresión del integrin de α6 alta se define como una señal > 103, ** p < 0.01. (C) este panel muestra imágenes representativas de la tinción de inmunofluorescencia de K5 (rojo) y el loricrin (rojo); DAPI (azul) se utilizó para teñir núcleos. Las barras de escala = 100 μm. (D) este panel muestra un análisis de cuantificación de células positivas K5 y loricrin. Un total de 400 células fueron contadas cuantificar cada grupo, y se muestra el número promedio de células positivas K5 y loricrin. Independientemente, el experimento se repitió 4 veces. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Después de la aprobación inicial, las células epidérmicas relativamente puras se obtuvieron utilizando el nuevo método. (A) este panel muestra imágenes representativas de inmunofluorescencia tinción de vimentina (rojo) de las células epidérmicas en pasajes 0 (P0) y 3 (P3); DAPI (azul) se utilizó para teñir núcleos. Las barras de escala = 50 μm. (B) este panel muestra un análisis de cuantificación de células vimentina positiva en pasos de 0 (P0) y 1 (P1). Un total de 400 células fueron contadas cuantificar cada grupo, y se muestra el número promedio de células positivas vimentina. Independientemente, el experimento se repitió 4 veces. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

HKCs primarias cultivadas han sido ampliamente utilizados para tratar heridas en clínicas durante más de tres décadas y, desde entonces, ha sido siempre importante obtener eficientemente un número suficiente de células para aplicaciones clínicas en tiempo y forma. Por lo tanto, en la práctica, el método de aislamiento convencional, que requiere la separación de la epidermis de la dermis, es difícil satisfacer estas demandas, debido al bajo rendimiento de las células y la baja capacidad de las células adultas de paso. Aquí, describimos un nuevo método simple que se desarrolló para obtener eficientemente HKCs de tejido adulto basado en anteriores informes13,14, que es más conveniente tanto para laboratorio como para aplicaciones clínicas.

Debe prestarse atención a los siguientes pasos críticos para lograr los mejores resultados para el nuevo método. En primer lugar, el procedimiento de homogeneización es un paso crucial; insuficiente homogeneización claramente afectará la eficiencia de la digestión enzimática y resultado en una baja producción de células disociadas. En segundo lugar, el paso de la digestión de tripsina no debe tomar más de 30 min; de lo contrario, disminuirá la viabilidad de las células disociadas. En tercer lugar, para recolectar eficientemente las células disociadas, el tamaño del poro del filtro celular utilizado para la filtración debe ser 100 μm, y un filtro solo debe usarse para filtrar no más de 20 mL de la solución de la célula. En cuarto lugar, la densidad de la galjanoplastia inicial es un factor importante para minimizar la contaminación con las células cutáneas, debido a una alta densidad celular reducirá de forma significativa el efecto inhibitorio de la Y-27632 sobre las células cutáneas. Por lo tanto, es crucial contar con precisión el número total de células disociadas en el final del procedimiento de aislamiento antes de la galjanoplastia.

En primer lugar, el nuevo método simplifica el procedimiento de aislamiento: el procedimiento de aislamiento convencional de dos etapas toma generalmente 2 días para llevar a cabo, y el procedimiento de ajuste es crucial para eliminar completamente el tejido graso de la piel, especialmente para tejidos adultos ( Figura 1); de lo contrario, habrá una separación ineficaz de la epidermis de la dermis después de la digestión durante la noche con dispase. Tomando ventaja de Y-27632, que inhibe el crecimiento de las células cutáneas después de la inoculación13, el nuevo método no necesita separar la epidermis de la dermis y, por lo tanto, el procedimiento de ajuste para eliminar el tejido adiposo no es necesario para el nuevo método, que sólo tiene medio día para llevar a cabo. En segundo lugar, el nuevo método también simplifica el procedimiento de cultura ya que, con el método tradicional, las células disociadas se cultivan generalmente en una capa de alimentador de fibroblastos de ratón irradiados en medio que contiene 10% FBS o en un plato de colágeno existentes. Componentes de origen animal son siempre factores de riesgo que debe evitarse para aplicaciones clínicas. Hemos desarrollado un medio libre de suero acondicionado inoculación (G-medio), que no requiere un paso de diatomeas para platos de cultura y también aumenta la producción de queratinocitos primarios13 porque G-medio combinado con Y-27632 promueve la fijación de las células epidérmicas la cultura plato13,17,18. Por lo tanto, el nuevo método facilita el procedimiento de la cultura y también es un procedimiento relativamente seguro para aplicaciones clínicas sin la adición de componentes de origen animal. En tercer lugar, el nuevo método mejora el rendimiento de las células epidérmicas primarias y acorta el tiempo de la cultura inicial necesario para llegar a la confluencia. En comparación con el método tradicional, el rendimiento de las células producidas por el nuevo método es aproximadamente 3 veces mayor, y llegó a la aprobación inicial de las células epidérmicas confluencia por lo menos 3 días antes (figura 2). Por último, el nuevo método puede ser utilizado para el aislamiento de las células epidérmicas de los tipos de muestras de piel, como la piel del cuero cabelludo peludo y tejidos de la piel de adultos con una gruesa capa de grasa, que han sido probados en un anterior informe13.

Alto potencial primarias HKCs han sido ampliamente utilizados para la investigación de laboratorio y para usos clínicos. Este nuevo método aumenta el potencial de las células cultivadas con las características de las células madre epidérmicas13. Y-27632 aumenta la expresión de integrina α6 HKCs y después de tres pasos, más del 90% de las células epidérmicas cultivadas expresó la queratina de marcadores de células basales 5 y menos de 10% de las células expresan el marcador de diferenciación Loricrin, indicando que Estas células mantienen las características de las células basales de la piel después de varios pasajes. Las células epidérmicas cultura ampliada pueden reconstituir la piel en vivo después de injertar13, lo que sugiere que poseen potencial de la regeneración después de la expansión de la cultura. En particular, el nuevo método es ideal para aislar células de tejidos adultos, como se mencionó anteriormente. Por lo tanto, las células epidérmicas preparadas por este método pueden utilizarse para in vitro y en vivo modelos para estudio de enfermedades de la piel y puede ser convertido en productos a base de células autólogos para aplicaciones clínicas como el tratamiento de heridas de la piel.

En Resumen, el nuevo protocolo ofrece un procedimiento simplificado y eficaz para aislar y expandir las células epidérmicas primarias del tejido de la piel adulta. Este avanzado método es más conveniente para la producción de gran número de células epidérmicas de alto potencial tanto para laboratorio como para aplicaciones clínicas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el nacional clave de investigación y desarrollo programa de China (2017YFA0104604), el Programa General de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (NSFC, 81772093), la ciencia y la tecnología desarrollo programa de Suzhou (ZXL2015128), la Fundación Ciencias naturales de la provincia de Jiangsu (BK20161241) y un Shandong Taishan Scholar Award (tshw201502065).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Countess automated cell counter Invitrogen Inc.  C10227 Automatic cell counting 
CO2 Incubator Thermo Scientific 51026333 For cell incubating
Sorvall ST 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004380 Cell centrifuge
Constant Temperature Shaker Shanghai Boxun 150036 For water bath
Electronic Scale Harbin Zhonghui 1171193 For tissue weighing
Cell Culture Dish Eppendorf 30702115 For cell culture
50ml Centrifuge Tube KIRGEN 171003 For cell centrifuge
Cell Strainer Corning incorporated 431792 Cell filtration
Phosphate buffered solution Solarbio Life Science  P1020-500 Washing solution
DMEM Thermo Scientific C11995500 Component of neutralization medium
Defined K-SFM Life Technologies 10785-012 Epidermal cells culture medium
Penicillin Streptomycin Thermo Scientific 15140-122 Antibiotics
Fetal Bovine Serum Biological Industries 04-001-1AC5 Component of neutralization medium
0.05% Trypsin Life Technologies 25300-062 For HKC dissociation
0.25% Trypsin  Beijing Solarbio Science & Technology T1350-100 For HKC dissociation
Coating Matrix Kit Life Technologies R-011-K For coating matrix
Dispase Gibco 17105-041 For HKC isolation
Collagenase Type I Life Technologies 17100-017 For HKC isolation
Deoxyribonuclease I Sigma 9003-98-9 For HKC isolation
F12 Nutrient Mix, Hams Life Technologies 31765035 Component of G-medium
B27 Supplement Life Technologies 17504044 Growth factor in G-medium
FGF-2 Millipore Merck Biosciences 341595 Growth factor in G-medium
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503 ROCK inhibitor
Fungizone Gibco 15290026 Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human Protein Gibco PHG0311 Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8 Thermo Scientific NC9864731 cell proliferation and cytotoxicity assays
Mouse Anti-Human Cytokeratin5 Hewlett-Packard Development Company MA-20142 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Rabbit Anti-Human Loricrin Covance PRB-145p For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Mouse anti-human Vimentin Cell Signaling Technology 3390 For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts
Integrin α6(GOH3) Santa Cruz  SC-19622 flow cytometry analysis of HKCs
Rat IgG2a FITC Santa Cruz  SC-2831 negative control antibody of α6-integrin  in flow cytometry analysis 

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References

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Biología del desarrollo número 138 keratinocytes humanos las células madre epidérmicas las células cutáneas aislamiento de células primarias de la piel cultivo de queratinocitos inhibidor de la quinasa Y-27632 Rho-associated regeneración de la piel
Un método simplificado y eficiente para aislar Keratinocytes humanos primarios de tejido adulto de la piel
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Liu, Z., Wen, J., Leng, X., Zhou, Q., Zhou, C., Zhao, H., Wu, X. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. J. Vis. Exp. (138), e57784, doi:10.3791/57784 (2018).

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