Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Vitro Formation canine piège extracellulaire neutrophiles : Analyse dynamique et Quantitative par microscopie de Fluorescence

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58083
Automatic Translation
1, 2
1Department of Veterinary Surgical and Radiological Sciences, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 2Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

Summary

Nous décrivons des méthodes pour isoler canines neutrophiles du sang total et de visualiser la formation nette des neutrophiles vivants à l’aide de la microscopie de fluorescence. Également décrites sont des protocoles pour quantifier la formation nette et citrullinés histone H3 (citH3) expression à l’aide de la microscopie par immunofluorescence.

Abstract

En réponse à l’invasion de pathogènes, neutrophiles libèrent les pièges extracellulaires neutrophiles (filets), qui sont des réseaux extracellulaires d’ADN orné d’histones et des protéines antimicrobiennes. La formation nette excessive (NETosis) et citH3 communiqué au cours d’une septicémie est associé avec multiples dysfonctionnement organique et mortalité chez les souris et les humains, mais ses conséquences chez les chiens sont inconnus. Ici, nous décrivons une technique pour isoler les neutrophiles canines du sang total pour l’observation et quantification des NETosis. Plasma leucocyte-riche, générée par la sédimentation de dextran, est séparée par les médias de séparation gradient de densité disponible dans le commerce et granulocytes recueillis pour comte et le contrôle de viabilité des cellules. Pour observer en temps réel NETosis neutrophiles direct, cellule perméant et taches imperméants fluorescents des acides nucléiques cellulaires sont ajoutés à neutrophiles activés par lipopolysaccharide (LPS) ou phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA). Changements dans la morphologie nucléaire et de la formation nette sont observées au fil du temps par microscopie à fluorescence. In vitro NETosis se caractérise davantage par co-co-localisation d’ADN de cellules libres (cfDNA), contre la myéloperoxydase (MPO) et citrullinés histone H3 (citH3) à l’aide d’un protocole modifié de double-immunomarquage. Afin de quantifier objectivement formation nette et citH3 expression à l’aide de la microscopie en fluorescence, filets et cellules citH3-positives sont quantifiés de façon aveugle à l’aide de logiciels disponibles. Cette technique est un dosage spécifique pour évaluer la capacité in vitro des neutrophiles canines à subir une NETosis.

Introduction

Les neutrophiles sont des granulocytes éphémères chargés de la défense initiale contre l’invasion des agents pathogènes. Neutrophiles, recrutés au site d’infection, éliminent les micro-organismes par phagocytose, dégranulation et génération de réactives de l’oxygène (DRO)1. En présence de bactéries ou d’endotoxines, neutrophiles libération neutrophiles extracellulaire pièges (filets), composé de chromatine extracellulaire orné de histones et des protéines granulaires comme l’élastase et contre la myéloperoxydase (FTU)2. Bien que les filets ont des propriétés antimicrobiennes indispensables, augmentant les preuves expérimentales et cliniques suggère que trop zélée formation nette au cours de l’infection peut conduire à plusieurs organes dysfonction et la mort3,4, 5 , 6.

Parce que les filets peuvent jouer un rôle physiopathologique similaire chez les chiens, les interventions thérapeutiques qui empêchent ou diminuent la formation nette peuvent servir de stratégies de nouveaux traitements chez les animaux de la fosse septique. Pour cette raison, il y a un besoin pour une technique fiable évaluer et quantifier des NETosis et des composantes nettes chez les chiens. Composantes nettes y compris ADN acellulaire (cfDNA) et les nucléosomes précédemment ont été évalués que dans les neutrophiles canines et le plasma chiens clinique7,8,9. Utilisant la fluorescence, Goggs et Letendre trouvent que septiques chiens ont des niveaux plus élevés de cfDNA que des chiens en bonne santé8. Bien que ces techniques soient très objective et quantitative, mesure des cfDNA et des nucléosomes comme marqueurs de NETosis est non spécifique car elles peuvent être dérivées de cellules nécrotiques, autres que les neutrophiles NETosing. Nous décrivons ici une technique qui utilise la microscopie de fluorescence pour étudier les comportements des vivants NETosing neutrophiles. Nous détaillons également un protocole modifié à l’aide de double-immunomarquage à quantifier subjectivement les filets et leurs composants tels que le MPO et citH3 dans les neutrophiles canine10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme à l’Université de Californie à Davis et d’institutionnels animalier (protocole numéro : 18338).

1. collecte de sang

  1. Tirer 10 mL de sang soit la veine céphalique ou jugulaire à l’aide d’une aiguille de 21 G par aspiration de la seringue.
  2. Pour éviter des contraintes de cisaillement excessives, retirer l’aiguille de la seringue avant de transférer le sang dans des tubes contenant de l’héparine de sodium (USP 75). Retourner doucement les tubes plusieurs fois afin d’assurer un mélange adéquat d’anticoagulant et de sang. Recherchez les signes de caillots ou d’agrégats de globules rouges avant de placer les échantillons sur la glace.

2. neutrophil isolement

  1. Diluer le sang non coagulé avec un volume égal de tampon phosphate salin de glacé Dubecco (SPD) (pH 7,4, sans les cations divalents). Transfert 8 mL de sang dilué dans un tube conique polypropylène de 50 mL contenant 25 mL de dextran de 3 % (à partir de Leuconostoc spp., dissous dans la solution de chlorure de sodium 0,9 %). Disposer le tube debout à température ambiante pendant 30 min permettre l’agrégation et sédimentation des érythrocytes.
  2. Soigneusement la couche 5 mL de plasma leucocyte-riche (Figure 1) sur le dessus de 5 mL de média gradient de densité dans un tube en polypropylène à fond rond 14 mL. Veillez à ne pas mélanger les 2 solutions11.
  3. Centrifuger les tubes à 400 x g avec accélération/décélération (A/D) la valeur 0 (pas de frein) pendant 30 min à température ambiante.
  4. À l’aide de 5 mL pipette sérologique recueillir la couche de cellules de granulocytes en contournant le plasma et les couches de cellules mononucléaires (PBMC) du sang périphérique (Figure 1). Utilisez une nouvelle pipette chaque fois pour minimiser la contamination.
  5. Dans un tube conique polypropylène 50 mL, placer 4 à 6 mL de la couche de cellules polymorphnuclear (PMN). Car une petite quantité de granulats érythrocytaire peut être aspirée avec la couche PMN, utiliser une pipette sérologique de 1 mL pour retirer délicatement les agrégats d’érythrocytes qui sont réglées au fond du tube.
  6. Lyse des érythrocytes restants avec 20 mL d’eau ultrapure froid. Retourner doucement le tube plusieurs fois pendant 30 à 60 s pour lyse adéquate avant d’ajouter un volume égal de solution de chlorure de sodium 1,8 % glacée.
  7. Centrifuger à 112 x g pendant 10 min à 4 ° C, A/D la valeur 0.
  8. Répétez l’étape de lyse des érythrocytes si ce pellet apparaît rouge. Jeter le surnageant soigneusement avec une pipette sérologique et doucement Resuspendre le culot dans 100 µL de SPD (dextrose 5 mM, 0. 9 mM MgCl2, 1,9 mM CaCl2 et 1 % d’albumine sérique bovine, pH 7,3). Combiner tous les cellules resuspendues et placez sur la glace.
  9. Effectuer un nombre de cellules à l’aide d’un analyseur de cellules automatisées et vérifier le compteur par un hémocytomètre. Si nécessaire, se concentrer APF sur une lame de verre à l’aide d’un cytocentrifuge (1 000 tr/min, 5 min) et détermine le pourcentage des neutrophiles en comptant le nombre de neutrophiles sur le nombre total de cellules.
  10. Déterminer la viabilité des neutrophiles en effectuant un test d’exclusion bleu trypan tels que décrits par Strober et al. 12 isolation réussie cède une viabilité de 95 à 100 % et neutrophiles doivent être supérieures à 95 %.
  11. Déterminer la concentration des neutrophiles en multipliant le nombre total de cellules avec la viabilité pour cent et les neutrophiles pour cent. Réussite de l’isolement devrait produire une concentration de neutrophiles de 1,5 à 6 x 106/ml.
  12. Diluer les neutrophiles à une concentration finale de 1 x 106/ml avec SPD contenant dextrose 5 mM, 0. 9 mM MgCl2, 1,9 mM CaCl2et 1 % d’albumine sérique bovine avec pH ajusté à 7,3.

3. fluorescente microscopie des neutrophiles direct

  1. Place de 200 à 400 μL de neutrophiles (1 x 106/ml) dans chaque puits d’une poly-L-lysine enduit plaque de 12 puits de culture. Permettre aux neutrophiles à adhérer au fond des puits en incubant les cellules à 37 ° C pendant 30 min.
  2. L’étiquette des acides nucléiques avec 1 μM d’un des deux colorants acides nucléiques, celui des taches dans les cellules à membranes intactes et que les taches dans les cellules des membranes semi-perméables (voir Table des matières), pendant 10 min à température ambiante.
  3. Activer les neutrophiles à lipopolysaccharide (LPS) (e. coli O55 de 100 μg/mL. B5), 100 nM phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) comme contrôle positif, ou un volume équivalent de SPD comme contrôle négatif pendant 180 minutes à 37 ° C.
  4. Acquisition d’images à l’aide de la GFP (Excitation : 470/22 nm, émission : 525/50 nm) et Texas Red channels (Excitation : 585/29 nm, émission : 628/32 nm) sur une microscopie à fluorescence à un grossissement de X 40 aux points temps suivants : 30, 90, 120 et 180 min.

4. NET Quantification et détection de composants NET à l’aide d’Immunofluorescence

  1. Placer soigneusement 18 mm diamètre Poly-D-lysine enduite de lamelles dans les puits d’une plaque de 12 puits de culture. Étiqueter correctement les puits.
  2. Semence 100 à 200 μL d’isolé des neutrophiles (1 x 106/ml) directement sur les lamelles et laissez neutrophiles respecte les lamelles en incubant les cellules à 37 ° C pendant 30 min.
  3. Activer les neutrophiles comme décrit à la 3.3. Inhiber la formation nette par un pré-traitement des neutrophiles à µΜ 200 Cl-amidine (15 min, 37 ° C) avant l’activation, comme décrit plus haut par Li et al. 13 s’assurer que le contrôle du véhicule approprié (DMSO) est compris dans le test.
  4. Retirer délicatement les lamelles avec une pince fine. Une feuille de film de paraffine de couche sur un support de tube à essai pour créer des puits peu profonds et mettre 2 à 3 gouttes de 4 % PFA dans chaque puits10. Étiqueter les puits correctement et poser délicatement les lamelles à l’envers sur les puits remplis de PFA. Permettre aux cellules qui sera fixée à température ambiante pendant 20 min.
  5. Laver les cellules 3 fois au SPD pendant 5 min, en les déplaçant d’un puits à l’autre.
  6. Si immunomarquage ne peut pas être effectuée peu de temps après la fixation et l’activation neutrophile, permettent de lamelles d’être séchés en plaçant le lamelles face vers le haut sur un morceau de papier de l’absorbance à l’air. Lamelles peut être conservés pendant jusqu'à 1 semaine face vers le haut dans une plaque de culture de 12 puits marqué à 4 ° C jusqu'à l’analyse plus loin. Laver les cellules 3 fois au SPD pendant 1 min, utilisant la même technique, comme décrit dans 4.4 avant de passer à l’étape suivante.
  7. Pour permeabilize des cellules, poser délicatement la lamelle couvre-objet à l’envers sur une baisse de 1 %, NP-40 pour 1 min en utilisant la technique décrite en 4.4. Laver 3 fois au SPD pendant 1 min sur un rocker.
  8. Au hasard affecter chaque échantillon à un certain nombre et utiliser un marqueur de point de diamant pour étiqueter les lamelles en conséquence.
  9. Préparer et étiquette individuelle Pétri bordée de film de paraffine et la place de 100 à 200 μL de sérum de chèvre de 5 % sur le film (tampon de blocage). Poser les lamelles à l’envers sur le tampon de blocage. Placer sur une bascule et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
  10. Laver 3 fois au SPD pendant 5 min sur un rocker.
  11. Diluer l’anticorps primaire (histone de 1 : 400 lapin polyclonal anti-citrullinés H3 (citH3) à 5 % de sérum de chèvre). Incuber les cellules marquées Pétri bordée de film de paraffine. Poser chaque lamelle couvre-objet à l’envers sur 50 à 100 μL de la solution diluée d’anticorps. Placer sur une bascule et incuber pendant 1 heure à 37° C.
  12. Laver 3 fois au SPD pendant 5 min sur un rocker.
  13. Anticorps secondaire dilué conjugué à un fluorophore (1 : 200) dans le sérum de chèvre de 5 %. Incuber les cellules marquées Pétri bordée de film de paraffine. Poser chaque lamelle couvre-objet à l’envers sur 50 à 100 μL de la solution diluée d’anticorps. Sur une base berçante et incuber 1 h à 37 ° C dans l’obscurité.
  14. Laver 3 fois au SPD pendant 5 min sur une bascule dans l’obscurité.
  15. Pour la détection simultanée de la myéloperoxydase (MPO), suivez les étapes suivantes pour un protocole modifié immunomarquage double telle que décrite par Li et al. 13
  16. Incuber les cellules marquées Pétri bordée de film de paraffine. Poser chaque lamelle couvre-objet à l’envers sur 100 à 200 μL de lapin de 10 % sérum sous le doux balancement (une nuit ou plus, 4 ° C, dans l’obscurité).
  17. Laver 3 fois au SPD pendant 5 min sur une bascule dans l’obscurité.
  18. Incuber les cellules chez les caprins non conjuguée de 50 μg/mL des fragments Fab anti-lapin pendant 2 h à température ambiante sur une bascule dans l’obscurité.
  19. Laver 3 fois au SPD pendant 5 min sur une bascule dans l’obscurité.
  20. Diluer l’anticorps primaire (1 : 200 lapin anti-humain MPO anticorps polyclonal) dans le sérum de chèvre de 5 %. Incuber les cellules marquées Pétri bordée de film de paraffine. Poser chaque lamelle couvre-objet à l’envers sur 50 à 100 μL de la solution diluée d’anticorps. Sur une base berçante et incuber 1 h à 37° C dans l’obscurité.
  21. Diluer l’anticorps secondaire conjugué à un fluorophore dans 5 % de sérum de chèvre et incuber tel que décrit dans 4,8
  22. Laver 3 fois au SPD pendant 5 min sur une bascule dans l’obscurité.
  23. Contrôles d’interférence doivent être préparés par l’exclusion d’incubation avec deux anticorps primaires dans la deuxième étape pour le label immunitaire.
  24. Tache d’ADN avec 300 nM de 4', 6-Diamidion-2-phénylindole, dichlorhydrate (DAPI) pendant 5 min dans l’obscurité à température ambiante.
  25. Laver 3 fois au SPD pendant 1 min sur une bascule dans l’obscurité.
  26. Appliquez une goutte (~ 50 μl) d’antifade mountant sur une lame de verre. Tapotez doucement le bord de la lamelle sur un papier absorbant pour enlever l’excès de tampon avant de monter la lamelle avec les cellules à l’envers. Le milieu de montage doit former une fine couche entre la lamelle et la lame de verre. Pour enlever les bulles d’air, appuyez très légèrement sur la lamelle couvre-objet avec une pince fine.
  27. Laisser les échantillons guérir du jour au lendemain dans l’obscurité à 4 ° C. Le milieu de montage devrait durcir pendant l’analyse au microscope avec des lentilles d’immersion. Conserver les échantillons à 4 ° C dans l’obscurité.

5. neutrophiles piège extracellulaire Quantification

  1. L’ou les opérateurs acquisition et l’analyse des images de microscope pour les conditions expérimentales de l’aveugle.
  2. À l’aide d’un microscope à fluorescence avec grossissement de 40 X, prendre 10 images au hasard des différentes régions de chaque lamelle lors d’une expérience dans les canaux. S’assurer que la durée d’exposition, la luminosité et le contraste de chaque canal sont cohérentes au cours de l’acquisition d’images.
  3. Analyser les images à l’aide de logiciels disponibles comme ImageJ (NIH). Identifier les filets basés sur la co-localisation de cfDNA, de citH3 et de MPO (Figure 3 a, B). Quantifier le nombre de filets et de neutrophiles dans 10 champs aléatoires pour chaque condition expérimentale. Nombres de filets libéré peut être exprimées sous forme de ratio (nombre de filets : nombre de neutrophiles) pour chaque condition expérimentale.
  4. Pour évaluer les effets du traitement sur l’expression citH3 intracellulaire, compter le nombre de neutrophiles à citH3 intracellulaire et le nombre de neutrophiles sans citH3 intracellulaires dans 10 champs au grossissement de X 40 sous les canaux ( Figure 3, flèches rouges). Expression citH3 intracellulaire peut être exprimée comme le ratio du nombre de neutrophiles à intracellulaire citH3 au nombre de neutrophiles sans citH3 intracellulaires.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Utilisant ce protocole d’imagerie de cellules vivantes, les enquêteurs peuvent observer la morphologie nucléaire, l’intégrité de la membrane plasmique et la présence de cfDNA vie des neutrophiles. Un colorant nucléaire imperméants cellule taches acides noyaux rouges dans les cellules des membranes de cellules endommagées. Un autre colorant cellulaire perméable, étiquettes intracellulaire des acides nucléiques dans des cellules vivantes avec des membranes de plasma. Tous les neutrophiles intacts, indépendamment de leurs traitements, devraient apparaissent vertes et exposer les noyaux sphériques caractéristiques à 0 à 30 min après stimulation (Figure 2 a). Noyaux des neutrophiles imprégnées sur les PMA commencent à perdre leur apparence sphériques par environ 60 min et continuer à acétylations jusqu'à la publication du cfDNA (Figure 2 b). LPS, un stimulant plus lent et plus physiologique des neutrophiles canines, généralement n’entraîne pas de décondensation de la chromatine ou NETosis jusqu'à 90 min après stimulation (Figure 2 b). Par 120 min, AGP-activé par LPS et neutrophiles voit entouré de cfDNA. Par rapport au LPS, neutrophiles plus-AGP activé perdent leur intégrité de la membrane plasmique car elles sont tachées de rouge par le colorant imperméants cellulaire (Figure 2). Neutrophiles non stimulées (contrôle du SPD) devraient maintenir des noyaux sphériques et la membrane plasmique intacte tout au long de la période d’incubation (Figure 2 a-C).

Composantes nettes consistant en cfDNA, citH3 et des granules de MPO sont détectés en utilisant le protocole double immunomarquage. Libération des filets, identifié après co-localisation de cfDNA, citH3 et le MPO, en réponse à LPS et PMA sont indiqués dans la Figure 3 a et 3 b, respectivement. Neutrophiles stimulées par LPS pour 180 min produisent discrètes échafaudages de toile d’araignée des filets à proximité de neutrophiles à proximité (Figure 3 a). Au contraire, neutrophiles activés par PMA produit de vastes quantités de filets qui étaient sensiblement plus grandes en superficie (Figure 3 b, D). Citrullination des histones H3, catalysée par l’enzyme peptidylarginine déiminase (PAD), est une caractéristique de NETosis. PMA, un puissant stimulant du PAD, se traduit par un plus grand nombre de cellules exprimant citH3 intracellulaire par rapport aux neutrophiles non stimulées et stimulées par LPS (Figure 3E).

Figure 1
Figure 1 : un schéma montrant les étapes d’isolement neutrophil canine. Sang total hépariné dilué est tout d’abord mélangé à 3 % dextran de sédimentation des globules rouges (RBC). Plasma leucocyte-riche est ensuite recueilli et couches sur des volumes égaux de média de séparation de gradient de densité disponible dans le commerce. Après centrifugation (400 x g, 30 min), la couche de RBC-granulocyte est extraite et les globules rouges restants sont éliminés par lyse hypotonique. Après l’addition de 1,8 % NaCl, granulocytes sont tournés vers le bas (x 112 g, 5 min) et resuspendues dans un tampon dédié. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : images fluorescentes représentatives des neutrophiles canines direct. Neutrophiles isolées ont été activés avec 100 µg/mL LPS, nM PMA, ou l’équivalent en 100 volumes de tampon phosphate salin de Dubecco (SPD) comme contrôle négatif pour un total de 180 min. les acides nucléiques en direct neutrophiles intacts ont été colorées vert avec utilisant une cellule perméable colorant, tandis que cfDNA et neutrophiles avec les membranes cellulaires compromis ont été colorés rouge avec un colorant cellulaire-imperméants. (A, D) SPD - et LPS-traités neutrophiles tous maintient une membrane de cellule intacte avec des noyaux sphériques (astérisque). (A, E) Les noyaux des neutrophiles activés par le PAM a commencé à subir une décondensation (pointes de flèche). (B, F) 90 min, la plupart des noyaux neutrophiles LPS - ou PMA-activé avaient perdu leur apparence sphériques (flèches bleues). (C) après 120 min, tous les neutrophiles activés par PMA avaient des membranes plasmiques perméables entourés de cfDNA tandis que cfDNA se voyait entourant un petit nombre de neutrophiles activés par le LPS (flèches). Neutrophiles non stimulées ne produisent pas de cfDNA ni avaient compromis la membrane de la cellule à n’importe quel moment (A-C). (A-B) Original 40 X grossissement. Echelle = 100 µm. (D-F) 80 X grossissement. Echelle = 30 µm. l’expérience a été reproduit deux fois de neutrophiles isolées de 3 différents donateurs. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : formation nette. (A-C) Images par immunofluorescence représentatives de la formation in vitro NET. Neutrophiles isolés provenant d’un donneur unique ont été fixés, perméabilisées et colorés pour l’ADN (bleu), myéloperoxydase (MPO, vert) et citrullinés histone H3 (citH3, rouge) après stimulation par le LPS de (A) 100 µg/mL, (B) 100 nM PMA ou SPD (C) pour 180 min., filets, identifiés par la co-localisation de cfDNA, FTU et citH3, sont décrites (lignes pointillées) sur (A) LPS - et des neutrophiles (B) activés par PMA. Exemples d’expression intracellulaire de citH3 sont indiqués par les flèches rouges. (C) N° filets ni citH3 intracellulaires sont visibles dans les neutrophiles non stimulées. Echelle = 100 µm. (D, E) représentatif boîte et moustaches parcelles de formation nette et expression citH3 intracellulaires dans les neutrophiles isolées de 4 chiens. La zone s’étend de la 25ème à la 75ème percentile et moustaches s’étendent de la plus petite à la plus grande valeur. LPS et stimulation des PMA ont entraîné importante formation nette (D) et l’expression de citH3 intracellulaire (E) par rapport aux neutrophiles non stimulées. + moyenne représente. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nous présentons ici un protocole afin d’observer les changements de noyaux conformation et cfDNA l’échappement vie canine neutrophiles en utilisant un colorant perméants de cellule et un colorant imperméants de la cellule. Le principal avantage de ce test, c’est qu’elle permet une détection en temps réel de formation nette par microscopie à haute résolution dans les neutrophiles direct sans fixation de la cellule, par conséquent, fournir un outil simple et utile pour l’observation in vitro la formation nette. Étant donné que ce test ne nécessite pas d’anticorps pour la détection de composantes nettes, il est idéal pour l’étude de NETosis en espèces avec la disponibilité limitée des anticorps spécifiques d’espèce. À l’aide de ce test, les auteurs ont démontré que neutrophiles canines subissent décondensation de la chromatine en LPS ou PMA stimulation avant NETosis13. Un inconvénient majeur de cette technique est qu’il n’est pas spécifique pour NETosis. Parce que le colorant imperméants de la cellule aussi les taches acides nucléiques dans des cellules nécrotiques ou acides nucléiques libérés des neutrophiles lysées, cfDNA ou cellule cellules imperméants-positive pourraient être faussement interprétés comme neutrophiles filets ou NETosing. Alternativement, la spécificité du NETosis peut être augmentée en incluant les neutrophiles PMA ou LPS-activés qui sont prétraités avec l’inhibiteur de PAD4, Cl-amidine. Nous avons démontré ici l’importance d’assurer la stérilité et la manipulation correcte des neutrophiles au cours du processus d’isolement comme contamination et forces pure peuvent conduire à in vitro nécrose et lyse de la cellule. Nous vous recommandons également de respecter les températures adéquates dans les protocoles et prévenir prolongé (> 1 min) lyse hypotonique. Pour confirmer la viabilité des heures supplémentaires des neutrophiles isolé, un test d’exclusion bleu Trypan, mais aussi un témoin négatif constitué des neutrophiles non stimulés est fortement recommandé.

CfDNA détecté par des acides nucléiques cellulaires-imperméable colorants n’étant pas spécifique pour NETosis, nous élaborer un protocole de double-immunomarquage de quantification in vitro la formation nette et expression citH3 intracellulaires dans les neutrophiles canines. Car neutrophiles libèrent des protéines granulaires comme MPO ainsi que cfDNA et citH3 dans l’espace extracellulaire, NET quantification basée sur la co-localisation de cfDNA, citH3 et FTU est plus spécifique par rapport à d’autres tests tels que cfDNA, nucléosomes ou complexe ADN-MPO 14. en raison de la disponibilité limitée des anticorps qui réagissent avec les protéines canines, nous avons utilisé des anticorps primaires qui proviennent d’une autre espèce (lapin). Pour empêcher la capture des anticorps primaires par les sites de liaison libre résiduel des anticorps secondaires dans chaque étape du processus de coloration, nous avons utilisé tout d’abord un sérum de lapin suivi de fragments Fab non-conjugué pour saturer les sites de liaison libre. Une étape essentielle de cette procédure est d’assurer un lavage adéquat pour éviter des excès des immunoglobulines et des fragments Fab qui peuvent interférer avec la détection de la deuxième protéine d’intérêt. Nous vous recommandons également de tester les différentes dilutions d’anticorps primaires et secondaires pour réduire les interférences et liaison non spécifique. Pour s’assurer que les anticorps secondaires de chaque étape de l’immunomarquage se lie spécifiquement à ses anticorps primaire, enquêteurs devraient inclure 2 différents contrôles à excluent un anticorps primaire dans la deuxième étape de l’immunomarquage. Liaison non spécifique se produit lorsque les signaux émis par les deux anticorps secondaires sont détectés.

Histone citrullination ou désamination, catalysée par l’enzyme peptidylarginine deminase 4 (PAD4), est essentielle dans les bactéries associées aux NETosis dans les souris et les humains15,16. À l’aide de ce test, nous avons pu déterminer que NETosis LPS-induite chez les chiens nécessite également des histones H3 citrullination par PAD13. Pour tester si le stimulant d’intérêt induit NETosis par PAD4 activation, nous recommandons l’inclusion des contrôles positifs à l’aide des activateurs PAD4 connus comme PMA ou de l’ionophore calcique, A2318717. Si les neutrophiles montrent négatifs de souillure pour citH3 dans les échantillons de contrôle positif, le protocole doit être révisé, jusqu'à ce qu’une coloration positive suffisante est entraînée. Nous recommandons également l’inclusion de la valeur du contrôle négatif biologique composé de neutrophiles non stimulées ou neutrophiles traités par inhibiteur de la PAD, Cl-amidine.

L’identification précise de la structure distincte de filets peut être difficile en utilisant cette technique. Cela peut être particulièrement difficile dans les échantillons avec une vaste NETosis, car la fusion des structures NET libérés de neutrophiles adjacentes multiples peut conduire à la sous-estimation des événements NETotic. Les résultats de ce test peuvent être corrélés avec les autres dosages plus objectives comme la cytométrie en flux ou ELISA, qui n’ont pas encore été validés pour une utilisation dans les neutrophiles canines. Pour éviter la formation de structure de filet confluente, enquêteurs peuvent semences une concentration plus faible de cellules. Alternativement, diminuant le temps d’incubation totale peut éviter une vaste NETosis et la fusion des structures NET. Bien que ce protocole peut être utilisé pour étudier la NETosis chez d’autres espèces, basée sur l’expérience des auteurs, neutrophil réponse au LPS ou PMA peut varier considérablement entre les espèces.

La découverte des filets chez le chien met en évidence que NETosis est un mécanisme conservé de l’immunité innée au cours de l’infection microbienne et de maladie auto-immune. Les tests présentés ici peuvent être un outil précieux pour l’étude des NETosis chez les chiens et les autres espèces. Une meilleure compréhension de le NETosis induite par le sepsis facilitera des recherches dans l’élaboration de stratégies de traitement novateur pour une septicémie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

L’auteur-correspondant a été financé par la Fondation d’Animal de Morris (D15CA-907). L’étude a été financée par des fonds de l’Université de Californie à Davis, centre de santé équine et Center for Companion Animal Health (2016-24-F). Les auteurs aimerait Geena Ng pour son aide avec les chiffres et Nghi Nguyen pour son aide avec la vidéo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran from Leuconostoc spp. Sigma 31392 Molecular weight 450,000 – 650,000
Ficoll-Paque PLUS GE Life Sciences 17144002
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific A1285801 With divalent cations
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190136 Without divalent cations
E. coli O55:B5 InvivoGen
SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S11368 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes
SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S7578 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes
Surface-Amps NP-40 Pierce 28324
Poly-D-Lysine coated coverslips neuVitro H-12-pdl 12 mm diameter
Anti-citrullinated histone H3 antibody Abcam Ab5103
Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments Jackson ImmunoResearch 111-007-003 Specificity: IgG (H+L)
Anti- Myeloperoxidase antibody Dako A0398
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) Life Technologies Corporation D1306

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
  2. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs. Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
  3. Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity. The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
  4. Czaikoski, P. G., et al. Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis. PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).
  5. Dwivedi, D. J., et al. Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis. Critical Care. 16 (4), R151 (2012).
  6. Mai, S. H., et al. Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis. Shock. 44 (2), 166-172 (2015).
  7. Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).
  8. Letendre, J. A., Goggs, R. Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).
  9. Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release. J Vis Exp. (117), (2016).
  10. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).
  11. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
  12. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
  13. Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase. Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).
  14. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  15. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
  16. Leshner, M., et al. PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures. Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).
  17. Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).

Tags

Immunologie et Infection numéro 138 la microscopie par Immunofluorescence septicémie isolement de granulocyte histone citrullination peptidylarginine déiminase
<em>In Vitro</em> Formation canine piège extracellulaire neutrophiles : Analyse dynamique et Quantitative par microscopie de Fluorescence
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, R. H. L., Tablin, F. In… More

Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58083, doi:10.3791/58083 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter