Summary
Nous décrivons ici deux nouvelles méthodes d’administration intranasale stable sous anesthésie par inhalation avec le stress physique minimale pour les animaux de laboratoire. On décrit également une méthode pour l’évaluation quantitative des niveaux de distribution de drogues dans le cerveau via la voie de nez-à-cerveau à l’aide de radioactif [14C]-inuline comme substrat modèle de macromolécules soluble dans l’eau.
Abstract
Administration par voie nasale a été signalée à être une voie potentielle pour les livraison de nez-à-cerveau d’agents thérapeutiques qui contourne la barrière hémato - encéphalique. Toutefois, on a peu de rapports en ce qui concerne non seulement l’analyse quantitative, mais aussi des conditions optimales d’administration et de schémas pour les enquêtes de nez-à-cerveau livraison de dosage. Des progrès limités dans la recherche sur les mécanismes de voie nez-à-cérébrale utilisant des rongeurs représentant un obstacle important en termes de conception de systèmes de livraison du nez-à-cerveau de médicaments candidats.
Pour obtenir des progrès à cet égard, nous avons développé et évalué deux nouvelles méthodes d’administration intranasale stable sous anesthésie par inhalation pour les animaux de laboratoire. On décrit également une méthode pour l’évaluation des niveaux de distribution de drogues dans le cerveau via la voie de nez-à-cerveau à l’aide de radio-marquées [14C]-inuline (poids moléculaire : 5 000) comme substrat modèle de macromolécules soluble dans l’eau.
Au départ, nous avons développé un protocole d’administration intranasale axée sur la pipette à l’aide de masques temporairement ouvrantes, qui nous a permis d’effectuer une administration fiable aux animaux sous anesthésie stable. Grâce à ce système, [14C]-inuline pouvait être envoyé au cerveau avec peu d’erreurs expérimentales.
Par la suite, nous avons développé un protocole d’administration intranasale entraînant une canulation inverse du côté des voies respiratoires par le biais de le œsophage, ce qui a été développé pour minimiser les effets de la clairance mucociliaire (MC). Cette technique a conduit à des taux significativement plus élevés [14C]-inuline, qui détecta quantitativement dans le bulbe olfactif, cerveau et bulbe rachidien, que la méthode de la pipette. Cela semble être parce que la rétention de la solution médicamenteuse dans la cavité nasale a été considérablement augmentée par l’administration active à l’aide d’une pompe à seringue dans la direction opposée du MC dans la cavité nasale.
En conclusion, les deux méthodes d’administration intranasale développée dans cette étude peuvent s’attendre à être des techniques extrêmement utiles pour l’évaluation pharmacocinétique chez les rongeurs. La méthode inverse de canulation, en particulier, pourrait être utile pour évaluer le potentiel de nez-à-cerveau livraison de candidats-médicaments.
Introduction
Biomédicaments tels que les anticorps, les oligonucléotides et les peptides sont considérés comme ayant des applications potentielles comme de nouveaux agents thérapeutiques pour les troubles du système nerveux central réfractaires qui n’ont actuellement aucun traitement curatif. Toutefois, étant donné que la plupart des biomédicaments sont des macromolécules soluble dans l’eau, livraison du sang dans le cerveau via l’administration par voie intraveineuse ou orale est extrêmement difficile en raison de l’impédance de la barrière sang - encéphalique (BHE).
Ces dernières années, l’administration intranasale a été signalée à être une voie potentielle pour les livraison de nez-à-cerveau d’agents thérapeutiques qui évite le BBB1,2,3,4,5. Toutefois, on a relativement peu de rapports au sujet de l’analyse quantitative des nez-à-cerveau voie livraison6. En outre, il n’y a eu pratiquement aucun rapport sur les conditions d’administration optimale mis en place et les schémas posologiques, tels que volume, fois, périodes de temps et la vitesse, des enquêtes de la livraison de nez-à-cerveau. Les lacunes susmentionnées peuvent être attribuées pour les raisons suivantes : (i) une méthode optimale d’administration intranasale pour souris doit être établi, et (ii) par voie nasale administration en pipettant également, qui est généralement utilisée, est généralement caractérisée par variation interindividuelle chez les animaux en raison de la clairance mucociliaire (MC), menant ainsi souvent à sous-estimer le potentiel de la livraison effective de nez-à-cerveau d’un médicament particulier.
Anesthésie par inhalation, l’isoflurane (initiation : 4 %, entretien : 2 %) avec une inhalation masque pour rongeurs a gagné l’utilisation répandue, dans le but de réduire ou d’éliminer la douleur associée à la chirurgie effectuée sur des animaux de laboratoire. L’utilisation de masques rend relativement simple à exécuter typique de médicaments chez les animaux expérimentaux sous anesthésie par inhalation par voies intraveineuse et sous-cutanée, intrapéritonéales. Toutefois, dans le cas de l’administration intranasale, le masque doit être retiré temporairement des animaux pour l’administration de médicaments. Avec moins de 2 % d’entretien isoflurane, animaux typiquement réveille rapidement de l’anesthésie par inhalation. Lorsque le volume d’administration par dose est important, cela pourrait provoquer la solution médicamenteuse s’écouler de la cavité nasale dans le œsophage, et donc une grande dose peut devoir être décomposé en plusieurs plus petites doses pour l’administration intranasale de petites animaux. Comme l’administration intranasale nécessite le retrait du masque pour une administration répétée et suffisamment de temps pour la livraison de la cavité nasale soutenue, il est fort probable que souris éveillerait de l’anesthésie au cours de la procédure d’administration. Cela rend très difficile d’effectuer l’administration intranasale sous un état stable d’anesthésique et contribue probablement à la variation inter-individuelle de nez-à-cerveau livraison chez les rongeurs.
Dans cette étude, nous avons donc mis au point deux nouvelles méthodes d’administration intranasale stable sous anesthésie par inhalation, qui imposent des contraintes physiques minimes sur les animaux de laboratoire. La première méthode, nous avons utilisé un masque temporairement ouvrant qui permet l’administration intranasale pendant l’anesthésie par inhalation. La partie ouvrante du masque intègre une fiche de silicone qui peut être utilisée conformément au calendrier d’administration pour faciliter l’administration intranasale stable à l’aide d’une pipette. Pour la seconde méthode, une canule a été chirurgicalement insérée pour passer de le œsophage dans la cavité nasale et une pompe à seringue a ensuite été attachée à cela afin que la solution de drogue pourrait être distribuée directement et de manière fiable dans la cavité nasale sous inhalation stable anesthésie. Cette méthode peut améliorer la livraison de médicaments dans le cerveau via la route de nez-à-cerveau, parce qu’en considérablement réduisant au minimum les effets de la MC, médicament mémorisable dans la cavité nasale s’améliorerait. En outre, les auteurs décrivent une méthode d’évaluation quantitative des niveaux de distribution de drogue (% pour le cerveau de la dose injectée/g) dans le cerveau à l’aide de radio-marquées [14C]-inuline [masse moléculaire (mm) : 5 000] comme substrat modèle de soluble dans l’eau macromolécules.
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Protocol
Cette étude animale (#AP17P004) a été effectuée conformément aux directives approuvées par le Comité de l’urbanisme (Tokyo, Japon) et de la Nihon University animalier. Cette étude (#17-0001) a été approuvée par le centre de radio-isotopes de l’école de pharmacie, Université Nihon.
1. les animaux utilisés pour l’Administration intranasale sous anesthésie par Inhalation
- Maison les souris expérimentales dans des cages en acier inoxydable suivant un cycle lumière/obscurité de 12 h (lumière sur 08:00 – 20:00), avec une température contrôlée maintenue à 23 ± 1 ° C, humidité de 50 % ± 10 % et l’accès à la nourriture et l’eau ad libitum .
- Avant expérimentation, anesthésier les souris par inhalation de 2 % isoflurane, initiation suivante à une concentration de 4 %. Confirmer le niveau requis d’anesthetization en vérifiant la disparition de la surface de redressement.
2. préparation de la Solution d’Administration
- Préparer une solution d’administration [14C]-inuline (50 μM, 0,5 μCi/mL par souris) en diluant dans une solution saline tamponnée au phosphate et conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
3. par voie nasale Administrations pour souris
-
Méthode de micropipette à l’aide d’un masque d’inhalation temporairement ouvrante (Figure 1)
Remarque : Cette technique est une modification du protocole administration intranasale à l’aide d’une micropipette établie par Frey et al. 3- Difficulté des souris en décubitus dorsal sur un tableau de visages en enregistrant leurs branches sous anesthésie par inhalation avec 2 % isoflurane (Figure 1 a).
- Administrer un volume total de solution d’administration 25 μL de chaque souris à intervalles de 30 s, via 1-2 μl de doses administrées alternativement dans les narines droite et gauche, tandis que les souris sont fixés sous anesthésie par inhalation (Figure 1 b et C).
- Remarque : Les déchets gaz anesthésique est piégé par des moyens actifs (fumées hotte, armoire de biosécurité dur-Gainables, vide, etc.) lorsque le masque est ouvert et par des moyens passifs (gaz anesthésique canister) lorsque fermé
-
Inverser la canulation m odes du côté des voies respiratoires par le biais de le œsophage (Figure 2)
Remarque : Cette technique est une modification du protocole d’absorption par voie nasale chez les rats établis par Hirai et al. 7- Difficulté des souris en décubitus dorsal sur un tableau de visages en enregistrant leurs branches sous anesthésie par inhalation avec 2 % isoflurane.
- Cheveux dans le cou est rasé et préparée par application de Bétadine ou chlorhexidine suivie d’un rinçage à l’alcool.
- Exposer la trachée et l’oesophage en élargissant la peau sous la gorge avec une pince, après avoir fait une petite incision (1,5 cm) avec des ciseaux.
- Faites une incision (1 mm) dans la trachée à l’aide de ciseaux.
- Insérer une canule (diamètre intérieur : 0,58 mm, diamètre extérieur : 0,965 mm) pour une longueur de 1,2 cm et fixez l’autre extrémité de la canule à l’intérieur du masque respiratoire.
- Faire une incision (1 mm) dans le œsophage à l’aide de ciseaux, insérer une canule (diamètre intérieur : 0,28 mm, diamètre extérieur : 0,61 mm) pour une longueur de 1,4 cm vers la partie postérieure de la cavité nasale et ligaturer (Figure 2 a et B).
Remarque : Les procédures 3.2.2 à 3.2.4 ont été réalisées sous un microscope stéréoscopique à un grossissement × 10. - Fixer une aiguille (27 × 1/2) à une seringue de 1 mL remplie avec une solution d’administration et se connecter à une pompe à seringue à injection programmable.
- Se connecter au-dessus de l’aiguille à la canule qui a été insérée dans le œsophage à 3.2.5 (Figure 2).
- Administrer un volume total de 25 μL [14C]-solution d’inuline à un rythme constant (5 μL/min) (Figure 2 et 2D).
4. expérience quantitative à l’aide de macromolécules hydrosolubles Radio-marquées ([14C]-inuline)
- Décapiter les souris expérimentales sous anesthésie et ouvrir leurs crânes, à l’aide de ciseaux et du côté du bulbe rachidien, tout en prenant soin de ne pas endommager le cerveau.
- Extraire soigneusement tout le cerveau à l’excavation à l’aide d’une micro-spatule de crâne.
- Place un papier filtre imbibé de solution saline sur une boîte de Pétri qui est stocké sur la glace.
- Placer le cerveau extrait sur papier filtre humide.
- Essuyez les sang adhère à la surface du cerveau avec un coton-tige imbibé d’une solution saline pour éliminer au moins l’influence de [14C]-inuline dans le sang à la surface du cerveau.
- Disséquer les cerveaux rapidement et les diviser en trois parties : le bulbe olfactif, cerveau et bulbe rachidien (y compris la protubérance).
- Placer des échantillons de cerveau en solubilisant des tissus à 50 ° C pendant 1 h.
- Ajouter 10 μL de la scintillation liquide cocktail à des échantillons de cerveau.
- Transférer une aliquote de la solution d’administration dissoute à scintillation cocktail dans un flacon à scintillation pour déterminer la radioactivité de la solution appliquée 25 μL.
- Mesurer les désintégrations par minute [14C] radioactivité dans l’échantillon de cerveau (X [14C] ducerveau) et la solution appliquée ([14C] XIN dose) dans un compteur à scintillation liquide équipé d’une bonne correction de Crossover pour 3H et de 14.
5. analyse
- Calculer les drogue distribution niveaux (%) de la dose injectée (ID %) selon l’équation suivante :
Cerveau de ⁄g % ID = ([14C] Xcerveau/ [14C] Xen dose) × 100,
où Xbrain (cerveau dpm/g) est la quantité de [14C] - inuline mesuré dans le tissu cérébral et XIN dose (solution dpm/25 μL) est la concentration de la [14C] - inuline dans la solution utilisée pour l’administration par voie nasale.
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Representative Results
La figure 3 illustre la [14C]-niveaux d’inuline (ID % ⁄g du cerveau) dans le bulbe olfactif (A), cerveau (B) et bulbe rachidien (C) obtenue à l’aide de deux types d’administration intranasale évalué dans cette étude. Administration par voie nasale à l’aide de la livraison de méthode activé pipette [14C]-inuline dans le cerveau à l’aide de masques d’inhalation ouvrante (Figure 1). Sous anesthésie par inhalation, les résultats quantitatifs ne révèlent aucune variation interindividuelle expérimentale chez les animaux examinés, comme indiqué par l’erreur-type faible. Lorsque la méthode d’administration de cavité nasale oesophagien canule inverse a été utilisée pour administrer [14C] inuline - inuline sous anesthésie par inhalation (Figure 2), un taux significativement plus élevés [14C] - ont été observés dans le bulbe olfactif ( Figure 3 a), cerveau (Figure 3 b) et le bulbe rachidien (Figure 3), qu’avec la méthode de la pipette. En outre, dans le cerveau, plus élevé [14C]-inuline niveaux ont été détectés dans le bulbe olfactif et le bulbe rachidien, qui interviennent en bonne place dans la voie de nez-à-cerveau, que dans le cerveau.
Figure 1 : à l’aide d’une micropipette en conjonction avec un masque d’inhalation ouvrant temporairement l’administration intranasale. Photographies montrant une souris fixe (A) avec un masque fermé avant l’administration et gros plan (B) et (C) toute vues du masque ouvert au cours de l’administration par voie nasale à l’aide d’une pipette. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : administration intranasale par canulation inverse du côté des voies respiratoires par le biais de le œsophage à l’aide d’un pousse-seringue. Photographies montrant la zone (A) chirurgicale, (B) gros plan et (C) toute vues et (D) le régime d’une souris fixe après deux types de canule avaient été insérées dans le œsophage et la trachée et reliés à une seringue à injection dans un masque respiratoire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Comparaison de [14C]-niveaux d’inuline dans le bulbe olfactif (A), cerveau (B) et bulbe rachidien (C) suite à deux types d’administration intranasale. IN-A et B IN indiquent la micropipette méthode (Figure 1) et la méthode de canulation inverse (Figure 2) pour l’administration intranasale, respectivement. L’utilisation de chaque méthode, un volume total de 25 μL [14C]-inuline (50 μM, 0,5 μCi/mL) a été administré. Le taux d’administration d’IN-B était 5 μL/min. Chaque colonne représente la moyenne ± S.E. (n = 4). p < 0,01 (de Student t-test) s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La livraison de nez-à-cerveau de médicaments devrait avoir un effet prononcé sur les troubles du système nerveux central parce que cette voie représente une voie de transport directe qui contourne la BHE. Trois voies différentes de nez-à-cerveau ont été signalés à la date8. La première est la voie du nerf olfactif, qui passe de la muqueuse olfactive dans la muqueuse nasale pour le cerveau via le nerf olfactif. La seconde est la voie du nerf trijumeau, qui passe de la muqueuse respiratoire dans la muqueuse nasale au tronc cérébral dans le cerveau postérieur, via le nerf trijumeau. La troisième est la voie de la CSF, qui est distribuée dans tout le cerveau par l’intermédiaire de la CSF. La voie de nez-à-cérébrale a attiré une attention considérable à l’égard de l’administration de macromolécules hydrophiles, qui tendent à être entravée par la BHE et comme un moyen de transporter les biomédicaments dans le système nerveux central8, 9 , 10 , 11 , 12. Cependant, quelques études antérieures ont décrit clairement de méthodes d’administration intranasale pour petits animaux afin de vérifier la livraison des médicaments candidats via la voie de nez-à-cerveau. En conséquence, il a été très lents progrès dans la recherche liée aux mécanismes de livraison de drogue de nez-à-cerveau à l’aide de petits animaux, qui représente un obstacle important en termes de conception de systèmes de livraison du nez-à-cerveau de médicaments candidats. Par conséquent, dans cette étude, nous avons développé deux protocoles pour administration par voie nasale sous anesthésie par inhalation pour étudier la répartition des différents médicaments candidats, tels que les biomédicaments, qui ciblent les maladies du système nerveux central. Nous avons également décrit une méthode qui peut être utilisée pour l’évaluation quantitative.
La méthode d’administration intranasale de pipette à l’aide de masques d’inhalation temporairement ouvrant développées dans cette étude permet d’effectuer une administration fiable avec des animaux dans un état d’anesthésie stable sans réveil, comme les masques n’ont pas à être retiré (Figure 1). En utilisant cette technique, nous avons démontré la livraison d’une macromolécule hydrosoluble (inuline ; MW : 5 000) au cerveau. Comme l’inuline ne pénètre pas le BBB, il peut être utilisé comme marqueur de l’espace du volume intravasculaire (environ 10-15 du cerveau μL/g) dans le cerveau de rat13. Nous avons obtenu d’excellents résultats quantitatifs avec peu d’erreurs expérimentales. Le niveau de [14C]-inuline dans le cerveau a été nettement plus élevé après administration intranasale qu’après administration par voie intraveineuse (données non présentées). En conséquence, nous avons établi que cette technique représente une approche viable pour administration par voie nasale qui permet d’administrer conventionnel à l’aide d’une pipette alors que les sujets restent sous anesthésie par inhalation (Figure 2). L’anesthésie par inhalation peut affectent la membrane épithéliale nasale et, ainsi, accroître la perméabilité par le biais de l’épithélium nasal. D’autres études sont nécessaires pour caractériser la livraison de cerveau en utilisant la méthode inverse de canulation sous anesthésie par inhalation, par rapport à l’anesthésie conventionnel telles que l’administration intrapéritonéale.
Nous avons étudié par la suite l’administration par l’intermédiaire de canulation inverse du côté des voies respiratoires par le biais de le œsophage, ce qui a été développé pour minimiser les effets de MC. Chez le rat, méthode de Hirai nécessite une intervention chirurgicale pour refermer le œsophage, puis d’administrer de l’entrée sur le nez pour minimiser l’effet de MC. Chez la souris, il est physiquement difficile d’effectuer la canulation de l’entrée du nez, et administration intranasale peut provoquer des éternuements. Notre méthode inverse canulation relie la canule insérée directement dans la cavité nasale de le œsophage à une pompe à seringue à injection, qui a l’avantage qu’il est possible de fermer le œsophage et des voies respiratoires par la chirurgie et exécuter simultanément par voie nasale administration. Réglage de la pompe de la seringue à injection facilite l’administration à l’aide de volumes et taux de dosage précis. En utilisant cette technique, nous avons enregistré un taux significativement plus élevés des macromolécules hydrophiles administrées dans le bulbe olfactif, cerveau et bulbe rachidien des souris que lorsque vous utilisez la méthode de la pipette (Figure 3). Cela semble être parce qu’avec l’administration par voie nasale à l’aide d’une pipette, la solution est passivement administrée conformément à la respiration spontanée, telle que la solution tend à être éliminée vers la trachée et l’oesophage par MC. En revanche, avec l’administration dans la cavité nasale par une canule inverse œsophagienne, la solution est gérée activement à l’aide d’une seringue dans la cavité nasale. Il semble que cette approche augmente considérablement la rétention de la solution médicamenteuse dans les fosses nasales, conduisant à un taux plus élevés de la distribution dans le cerveau. En outre, nous avons détecté des niveaux plus élevés de la solution administrée dans le bulbe olfactif et le bulbe rachidien, qui interviennent en bonne place dans la voie de nez-à-cerveau, que dans le cerveau. En conséquence, nous avons démontré que l’administration dans la cavité nasale par une canule inverse oesophagienne est une méthode viable pour évaluer tout le potentiel de la livraison de nez-à-cerveau de candidats-médicaments.
En conclusion, les deux méthodes d’administration intranasale que nous avons développés dans cette étude peuvent s’attendre à être techniques extrêmement utiles pour l’évaluation de la pharmacocinétique des petits animaux par la voie de nez-à-cerveau.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été financée en partie par le projet de Branding privé recherche universitaire du MEXT ; une subvention pour Research (C) scientifique (17 K 08249 [à T.K. et T.S.]) de la société japonaise pour la Promotion de la Science (JSPS) ; une subvention pour la recherche de la Fondation Hamaguchi pour la promotion de biochimie [à T.S.] et la Fondation des sciences Takeda [à T.K.]. Nous remercions M. Yuya Nito et Mme Akiko Asami pour leur précieuse assistance technique dans les expériences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ddY mouse | Japan SLC, Inc. | Male, 4-6 weeks, 20-30 g | |
| Isoflurane | Pfizer | v002139 | |
| Isoflurane setup | SHINANO manufacturing CO. LTD. | SN-487-OTAir, SN-489-4 | |
| Isoflurane mask | SHINANO manufacturing CO. LTD. | For small rodents | |
| Isoflurane mask (openable type) | SHINANO manufacturing CO. LTD. | Special orders | |
| Anesthesia Box | SHINANO manufacturing CO. LTD. | SN-487-85-02 | |
| Animal experiments scissors-1 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | B-27H | |
| Animal experiments scissors-2 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | B-13H | |
| Tweezers-1 | FINE SCIENCE TOOLS Inc. | 11272-30 | Dumont #7 Dumoxel |
| Tweezers-2 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | A-12-1 | |
| Cannula tube (PE-50) | Becton, Dickinson and Company. | 5069773 | I.D.: 0.58 mm, O.D.: 0.965 mm |
| Cannula tube (SP-10) | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | KN-392 | I.D.: 0.28 mm, O.D.: 0.61 mm |
| Shaver | MARUKAN, LTD. | DC-381 | |
| Stereoscopic microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
| Needle 27G 1/2 in 13 mm | TERUMO CORPORATION | NN-2738R | |
| 1 mL syringe | TERUMO CORPORATION | SS-01T | |
| Syringe pump | Neuro science | NE-1000 | |
| Cellulose membrane | Toyo Roshi Kaisya, Ltd. | 00011090 | |
| Micro spatula | Shimizu Akira Inc. | 91-0088 | |
| Micropipette (0.5-10 uL) | Eppendorf AG | Z368083 | |
| Pipette chip | Eppendorf AG | 0030 000.811 | |
| Tape | TimeMed Labeling System, Inc. | T-534-R | For fixing mouse |
| [14C]-Inulin | American Radiolabeled Chemicals Inc. | ARC0124A | 0.1 mCi/mL |
| EtOH | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-00461 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc | Tri-Carb 4810TR |
References
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