Summary
ここでは、実験動物の最小限の物理的なストレスと吸入麻酔下で安定の鼻腔内投与の 2 つの手法について述べる。標識 [14C] を使用して鼻の脳経路を介した脳内薬物分布レベルの定量的評価法についても述べる-水溶性高分子のモデル基質としてイヌリン。
Abstract
鼻腔内投与は、血液-脳関門を回避する治療薬の鼻の頭脳へ配信するため潜在的な経路に報告されています。ただし、いくつかのレポートに関する定量的な分析だけでなく、最適な管理条件と鼻の頭脳への配信の調査のためのレジメンを投与されています。げっ歯類を用いた鼻・脳の経路機構研究の限られた進歩の候補薬鼻の脳配信システムの設計の面での重大な障害を表します。
この点でいくつかの前進を得るためには、我々 は開発し、実験動物吸入麻酔下で安定の鼻腔内投与の 2 つの新しい方法を評価しました。標識 [14C] を使用して鼻の脳経路を介した脳内麻薬流通レベルの評価法についても述べる-イヌリン (分子量: 5,000) 水溶性高分子のモデル基質として。
最初に、我々 は安定した麻酔下の動物に信頼性の高い管理を実行する私たちを有効に一時的に開閉マスクを使用ピペットによる鼻腔内投与プロトコルを開発しました。このシステムでは、[14C] を使用して-イヌリンは少し実験的なエラーで脳に配信でした。
我々 はその後、粘液線毛クリアランス (MC) の影響を最小限に抑えるために開発された、食道を介して気道側から逆の穿刺を伴う鼻腔内投与プロトコルを開発しました。この手法を導いた [14C] の著しく高いレベルに-イヌリン、定量的、嗅球、大脳、延髄、ピペット法よりも検出されました。これは、鼻腔内に薬液の保持された鼻腔内に MC とは反対方向にシリンジ ポンプを使用したアクティブな管理によって大幅にために表示されます。
結論として、本研究で開発した鼻腔内投与の 2 つの方法は、齧歯動物の薬物動態を評価するための非常に有用な技術に期待できます。特に、逆カニュレーション法は、薬剤の候補者の鼻の頭脳への配信の可能性を評価するため役に立つかもしれない。
Introduction
ペプチド、オリゴヌクレオチド、抗体などの生物医学は、現在、根治療法がない難治性中枢神経疾患の新規治療薬として潜在的なアプリケーションを持っていると見なされます。ただし、ほとんどの生物医学は水溶性高分子であるため、静脈内投与又は経口投与で脳に血液から配信は血液脳関門 (BBB) のインピー ダンスのために非常に困難。
近年、経鼻投与は BBB1,2,3,4,5を回避する治療薬の鼻の頭脳へ配信するため潜在的な経路に報告されています。ただし、鼻の脳経路配信6の定量分析に関する比較的少数のレポートがずっとあります。さらに、事実上確立された最適な管理条件やボリュームなどの投薬計画に報告されている時間、期間、および速度、鼻の頭脳への配信の調査のため。前述の欠陥は次の理由に起因することができます: マウスの鼻腔内投与の (i) の最適な方法はまだ確立し一般的に使用され、ピペッティングにより (ii) 経鼻投与は通常の特徴粘液線毛クリアランス (MC) のための動物の間で個体差によってそれによりしばしば特定の薬剤の実際鼻の頭脳への配信の可能性を underestimations に 。
イソフルランを用いた吸入麻酔 (開始: 4%、保守: 2%) 吸入の齧歯動物のマスクは削減を目的での広範な使用を得たまたは実験動物に対して手術に関連付けられている痛みを除去します。マスクの使用は、皮下、腹腔内、静脈内経路を介して吸入麻酔下で実験動物に典型的な薬剤管理を実行する比較的簡単です。しかし、鼻腔内投与の場合、マスクは薬剤の投与動物から一時的に削除する必要があります。メンテナンス 2% 未満とイソフルラン、動物一般を目覚めさせる急速吸入麻酔から。線量ごとの管理ボリュームが大きい、鼻腔から食道に流入する薬液の原因し、単一の大きい線量に小さな鼻腔内投与するための複数のより小さい線量に分割する必要があります。動物。鼻腔内投与は、反復投与のマスク除去、鼻腔持続的な配達のための十分な時間といえば、マウス管理手順中に麻酔から目が覚めると高い確率があります。これは安定した麻酔状態で鼻腔内の管理を実行することが非常に困難で、おそらく齧歯動物間で鼻の脳配信観測の個体差に貢献しています。
本研究で我々 したがって実験動物に最小限の物理的なストレスを課す吸入麻酔下で安定の鼻腔内投与の 2 つの新しい方法を開発しました。最初の方法では、吸入麻酔中の鼻腔内投与により一時的に開閉マスクを使用しました。マスクの開閉部分には、ピペットを使用して安定した鼻腔内投与を容易にする管理タイミングに従って使用できるシリコン製プラグが組み込まれています。2 番目のメソッドでは、カニューレ手術食道から鼻腔内に渡すこと挿入されたシリンジ ポンプは、これに接続されている安定した吸入下鼻腔内で薬液を直接確実に配信されるように、麻酔。このメソッドは、大幅に MC の影響を最小限に抑える、鼻腔内薬して保持が向上するため鼻の脳経路を介して脳への薬の配達を高めることができます。また、標識 [14C] を用いた脳薬配布レベル (注入された線量/g 脳 %) を定量的に評価する手法について述べる-イヌリン [分子量 (MW): 5,000] 水溶性のモデル基質として高分子。
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Protocol
日本大学動物ケアおよび使用委員会 (東京都) による承認ガイドラインに従ってこの動物実験 (#AP17P004) を行った。本研究 (#17-0001) は、日本大学薬学部アイソトープ センターが承認されました。
1. 吸入麻酔下で経鼻投与に使用される動物
- 温度 23 ± 1 ° C、湿度 50% ± 10% と自由への食料と水の維持管理と 12 h 明暗周期 (8:00-20:00 に光)、下のステンレス製ケージの実験マウスを家します。
- 実験前にイソフルラン 2%、4% の濃度で次の開始の吸入を介してマウスを麻酔します。表面立ち直りの消失を確認することによって anesthetization の必要なレベルを確認します。
2. 管理ソリューションの準備
- [14C] の管理ソリューションを準備-イヌリン (50 μ M、マウスあたり 0.5 μCi/mL) リン酸緩衝生理食塩水で希釈することによって、使用するまで 4 ° C で保存します。
3. マウス用鼻腔内投与
-
マイクロ ピペットを用いた一時的に開閉式吸入マスク (図 1)
注: この手法は、フレイらによって確立されたマイクロ ピペットを使用して経鼻投与プロトコルの変更3- コルクボード上臥位でマウスを修正するには、テーピングと 2% (図 1 a) イソフルレン吸入麻酔下で自分の手足。
- (図 1 bとC) 吸入麻酔下でマウスを固定または左と右の鼻に投与 1-2 μ L 用量経由、30 の間隔で各マウスを 25 μ L 管理ソリューションの総ボリュームを管理します。
- 注: 廃棄物のマスクが開かれたとき、受動的な手段 (排出される麻酔ガス キャニスター) 麻酔ガスの清掃 (ヒューム フード、ダクト ハード安全キャビネット、掃除等) アクティブな手段によって閉じられたとき
-
逆にカニュレーションm食道を介して気道側からインデクシング (図 2)
注: この手法は、平井らによって確立されたラットの鼻腔内吸収プロトコルの変更7- コルクボード上臥位でマウスを修正するには、テーピングと 2% イソフルレン吸入麻酔下で自分の手足。
- 首の毛は剃毛、betadine、またはクロルヘキシジン アルコール リンス アプリケーション経由で準備中します。
- ハサミ鉗子で小切開 (1.5 cm) を行った後、喉の下の皮膚を拡大して気管と食道を公開します。
- はさみを使用して気管切開 (1 mm) を行います。
- カニューレを挿入 (内径: 0.58 mm、径: 0.965 mm) 1.2 cm の長さに、吸入マスクの内側にカニューレの反対側の端を取り付けます。
- カニューレを挿入、はさみを使用して食道切開 (1 mm) を作る (内径: 0.28 mm、径: 0.61 mm)、鼻腔の後部に向かって 1.4 センチメートルの長さに (図 2 aおよびB) を縛ると。
注: 手順 3.2.2 に 3.2.4 × 10 倍率で実体顕微鏡下で行われました。 - 管理ソリューションでいっぱい 1 mL シリンジに針 (27 × 1/2) を添付し、プログラマブル マイクロ シリンジ ポンプに接続します。
- 3.2.5 (図 2) で食道に挿入したカニューレ針上に接続します。
- 25 μ L [14C] の総量を管理-一定の割合 (5 μ L/分) でイヌリン ソリューション (図 2 および 2 D)。
4. 定量的実験水溶性高分子の標識を使用して ([14C]-イヌリン)
- 麻酔下で実験的マウスの首をはねるし、脳に損傷を与えないように注意しながらはさみを使って自分の頭蓋と、延髄の側からを開きます。
- 頭蓋からマイクロへらを使用してすくって脳全体を慎重に抽出します。
- 場所のフィルター ペーパーは、氷の上に格納されているシャーレに食塩水を湿らせた。
- 湿らせたろ紙に抽出した脳を配置します。
- 少なくとも [14C] の影響を排除するために食塩水で湿らせた綿棒で脳の表面に付着した血を拭き取る-脳の表面に血液中のイヌリン。
- 急速に脳を分析し、3 つの部分にそれらを分ける: 嗅球、大脳、延髄 (橋を含む)。
- 1 h 50 ° C で組織溶解剤に脳サンプルを配置します。
- 脳サンプルを液体シンチレーション カクテルの 10 μ L を追加します。
- シンチレーション カクテル塗布液の放射能を決定するシンチレーション バイアルに溶解管理ソリューションの 25 μ 因数を転送します。
- 脳サンプル [14C] の分放射能あたりの崩壊を測定 ([14C] X脳) と応用ソリューション ([14C]の線量X) 適切な装備、液体シンチレーション カウンターで3H、 14c. クロス オーバー補正
5. データの解析
- 薬物分布 (%) のレベル注入量 (ID %) 次の方程式を使用してを計算します。
ID % ⁄g 脳 = ([14C] X脳/[14C]線量のX) × 100、
X脳(脳 dpm/g) が [14C] の量は - 脳組織でイヌリン測定し、Xの線量(dpm/25 μ L 溶液) は、[14C] の濃度 - 鼻腔内投与用ソリューションでイヌリン。
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Representative Results
図 3に示す [14C]-嗅球 (A)、大脳 (B) および (C) 本研究で評価した鼻腔内投与の 2 種類を用いて延髄のイヌリン レベル (ID % ⁄g 脳)。[14C] のピペットの方法を有効に配信を使用して経鼻投与-開閉式吸入マスク (図 1) を使用して脳にイヌリン。吸入麻酔下で量的な結果の低標準エラーによって示されるとして、検査された動物の間で実験的個体差は認められなかった.嗅球 (- 吸入麻酔 (図 2)、[14C] の著しく高いレベル イヌリン - イヌリンが認められた [14C] を管理する食道逆カニューレ鼻腔内投与法を使用した場合図 3 a)、(図 3 b)、大脳と延髄 (図 3) よりピペット法。また、脳内、高い [14C]-目立つように関与している鼻の脳経路よりも大脳の嗅球と延髄、イヌリン レベルが検出されました。
図 1: 一時的に開閉式吸入マスクと組み合わせてマイクロ ピペットを使用して経鼻投与。写真 (A) で、閉じたマスク固定マウス管理、および (B) クローズ アップと開かれたマスクの (C) 全体ビューの前にピペットを使用して経鼻投与中。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: シリンジ ポンプを使用して食道を通って気道側から逆の穿刺による鼻腔内投与します。2 種類のカニューレの後 (A) 外科領域、(B) クローズ アップや (C) 全体のビュー、および (D) 固定マウスのスキームを示す写真を食道と気管に挿入されていたし、吸入マスクのマイクロ シリンジに接続されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: [14C] の比較-嗅球 (A)、(B)、大脳と延髄 (C) という 2 つの鼻腔内投与でイヌリン レベル。の A と B にはそれぞれ、マイクロ ピペット法 (図 1) と鼻腔内投与の逆カニュレーション法 (図 2) を示します。[14C] の 25 μ L の容量は、各メソッドを使用して-イヌリン (50 μ M、0.5 μCi/mL) が投与されました。B の投与速度は、5 μ L/分だった。各列は、平均 ± s. e. を表します (n = 4)。p < 0.01 (Student のt-テスト)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
この経路は、BBB をバイパスし、直接輸送ルートを表すため中枢神経系障害の顕著な効果がある薬の鼻の頭脳へ配信されます。3 つの異なる鼻-脳の経路は、日付8に報告されています。最初の鼻粘膜嗅粘膜から嗅神経を介して脳に渡します嗅神経の経路です。第二は、三叉神経の経路は、三叉神経を介して鼻の粘膜で呼吸器粘膜から菱脳の脳幹に渡します。第三は、CSF 経路は、脳脊髄液を介して脳全体に分散されます。鼻-脳の経路は、BBB と中枢神経系8,に生物医学を提供する手段として妨げられる傾向にある親水性高分子の管理に関してかなりの注目を集めています。9,10,11,12します。 いくつかの先行研究がある鼻の脳経路候補薬の配信を確認するために小動物の鼻腔内投与の方法を明確に記述するただし、します。したがって、候補薬の鼻-脳配信システムの設計の面での重大な障害を表す小さな動物を使用して鼻の脳薬配信メカニズムに関連した研究の非常に遅い進歩がずっとあります。したがって、本研究では、中枢神経系疾患を対象とする生物医学など、様々 な候補薬物の分布を調査する吸入麻酔下で経鼻投与の 2 つのプロトコルを開発しました。定量的に評価する方法について述べる。
本研究で開発した開閉一時的に吸入マスクを用いたピペットによる鼻腔内投与法はそれに、覚醒することがなく安定した麻酔の状態で動物を使用した信頼性の高い管理を行うことが可能にマスクを持っていないので(図 1) を削除します。この手法を使用すると、我々 は水溶性高分子 (イヌリン; の配信を実証MW: 5,000) 脳に。イヌリンは、BBB を浸透していないとは、ラット脳13血管内ボリューム領域 (約 10-15 μ L/g 脳) のマーカーとして使用できます。少し実験的なエラーと優秀な定量的な結果を得た.[14C] のレベル-脳のイヌリンは、(データは示されていない) 静脈内投与後よりも鼻腔内投与後明らかに高かったが。したがって、この手法を表す (図 2) 吸入麻酔下で被験者がままピペットを使用して従来の管理を可能にする鼻腔内投与のための現実的なアプローチを設けています。吸入麻酔可能性があります鼻上皮膜に影響し、その結果、鼻上皮透過を向上します。さらなる研究は、腹腔内投与など従来の麻酔に比べ、吸入麻酔下で逆カニュレーション法を用いた脳配信に特徴付ける必要があります。
その後 MC の影響を最小限に抑えるために開発された、食道を介して気道側から逆の穿刺によって管理を行った。ラット、平井の法には、食道を閉じる手術が必要です。 MC 効果を最小限に抑えるために鼻の入り口から管理しています。マウスでは、鼻の入り口から穿刺を行うことは物理的に困難と鼻腔内投与は、くしゃみを引き起こす可能性があります。私たちリバース カニュレーション法食道から食道を閉じて、手術による気道や鼻腔内を同時に実行することが可能であるという利点を持っているマイクロ シリンジ ポンプに鼻腔内に直接挿入カニューレを接続します。管理。マイクロ シリンジ ポンプの調整には、正確な投与速度とボリュームを使用して管理ができます。この手法を使用すると、嗅球、大脳、延髄ピペット法 (図 3) を使用するよりもマウスの投与の親水性高分子の有意レベルを記録しました。これは鼻腔内投与は、ピペットを使用して、ソリューションは受動的自発呼吸に従って管理されるためソリューションは気管と食道の方 MC によって除去される傾向があるように表示されます。対照的に、食道逆カニューレを通して鼻腔内の管理とソリューションは、積極的に鼻腔内にシリンジ ポンプを使用して管理されます。それはこのアプローチが脳における分布レベルの向上につながる、鼻腔に薬液の保存を大きく表示されます。さらに、目立つように関与している鼻の脳経路よりも大脳の嗅球と延髄、管理ソリューションの高いレベルを検出した.したがって、食道逆カニューレを通して鼻腔に管理が薬剤の候補者の鼻の頭脳への配信の可能性を評価するための現実的な方法であることを示した。
結論として、本研究で開発した鼻腔内投与の 2 つの方法は、鼻の脳経路を介した小動物における薬物動態を評価するための非常に有用な技術に期待できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この研究は文部科学省; から民間の大学研究のブランディング プロジェクトによって一部支えられました科学的な Research (C) ([t. k. t. s. し] 17 08249 K) から日本学術振興会 (JSPS) の科学研究費[フィルミックストピックス] 浜口 [ティ] を生化学の進歩科学財団財団から共同研究の助成。実験を行う上で貴重な技術援助、氏弥仁藤と先生子浅見に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ddY mouse | Japan SLC, Inc. | Male, 4-6 weeks, 20-30 g | |
| Isoflurane | Pfizer | v002139 | |
| Isoflurane setup | SHINANO manufacturing CO. LTD. | SN-487-OTAir, SN-489-4 | |
| Isoflurane mask | SHINANO manufacturing CO. LTD. | For small rodents | |
| Isoflurane mask (openable type) | SHINANO manufacturing CO. LTD. | Special orders | |
| Anesthesia Box | SHINANO manufacturing CO. LTD. | SN-487-85-02 | |
| Animal experiments scissors-1 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | B-27H | |
| Animal experiments scissors-2 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | B-13H | |
| Tweezers-1 | FINE SCIENCE TOOLS Inc. | 11272-30 | Dumont #7 Dumoxel |
| Tweezers-2 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | A-12-1 | |
| Cannula tube (PE-50) | Becton, Dickinson and Company. | 5069773 | I.D.: 0.58 mm, O.D.: 0.965 mm |
| Cannula tube (SP-10) | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | KN-392 | I.D.: 0.28 mm, O.D.: 0.61 mm |
| Shaver | MARUKAN, LTD. | DC-381 | |
| Stereoscopic microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
| Needle 27G 1/2 in 13 mm | TERUMO CORPORATION | NN-2738R | |
| 1 mL syringe | TERUMO CORPORATION | SS-01T | |
| Syringe pump | Neuro science | NE-1000 | |
| Cellulose membrane | Toyo Roshi Kaisya, Ltd. | 00011090 | |
| Micro spatula | Shimizu Akira Inc. | 91-0088 | |
| Micropipette (0.5-10 uL) | Eppendorf AG | Z368083 | |
| Pipette chip | Eppendorf AG | 0030 000.811 | |
| Tape | TimeMed Labeling System, Inc. | T-534-R | For fixing mouse |
| [14C]-Inulin | American Radiolabeled Chemicals Inc. | ARC0124A | 0.1 mCi/mL |
| EtOH | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-00461 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc | Tri-Carb 4810TR |
References
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