Summary
Här beskriver vi två nya metoder för stabil intranasal administrering under inandning anestesi med minimal fysisk stress av försöksdjur. Vi beskriver också en metod för kvantitativ utvärdering av narkotika distribution nivåer i hjärnan via näsan-till-hjärnan vägen med hjälp av radioaktivt märkt [14C]-inulinsirap som modell substrat av vattenlösliga makromolekyler.
Abstract
Intranasal administrering har rapporterats vara en potentiell väg för näsa-till-hjärnan leverans av terapeutiska medel som kringgår den blod - hjärnbarriären. Dock har förekommit några rapporter om inte bara den kvantitativa analysen men också optimal administration villkor och doseringsregimer för undersökningar av näsa-till-hjärnan leverans. Den begränsade framstegen i forskning på näsan-till-hjärnan väg mekanismer använder gnagare utgör ett betydande hinder när det gäller utforma näsa-till-hjärnan leveranssystem för läkemedelskandidater.
För att få vissa framsteg i detta avseende har vi utvecklat och utvärderat två nya metoder för stabil intranasal administrering under inandning anestesi för försöksdjur. Vi beskriver också en metod för utvärdering av narkotika distribution nivåer i hjärnan via näsan-till-hjärnan vägen med hjälp av radioaktivt märkt [14C]-inulin (molekylvikt: 5.000) som modell substrat av vattenlösliga makromolekyler.
Inledningsvis utvecklat vi en pipett-baserade intranasal administrering protokoll använder tillfälligt öppningsbar masker, som gjorde det möjligt för oss att utföra pålitliga administration till djur under stabil anestesi. Med detta system, [14C]-inulinsirap kunde levereras till hjärnan med lite experimentella fel.
Därefter utvecklade vi en intranasal administrering protokollet medför omvänd kanylering från luftvägarna sida genom matstrupen, som utvecklades för att minimera effekterna av mukociliär clearance (MC). Denna teknik ledde till betydligt högre nivåer av [14C]-inulinsirap, som upptäcktes kvantitativt i luktbulben, storhjärnan och förlängda märgen, än metoden pipett. Detta verkar vara eftersom lagring av drogen lösningen i näshålan ökades väsentligen genom aktiv förvaltning med en sprutpump i en riktning motsatt MC in i näshålan.
Sammanfattningsvis kan de två metoderna för intranasal administrering utvecklats i denna studie förväntas vara extremt användbara tekniker för att utvärdera farmakokinetiken hos gnagare. Metoden omvänd kanylering, i synnerhet, kan vara användbara för att utvärdera den fulla potentialen av näsa-till-hjärnan leverans av läkemedelskandidater.
Introduction
Bioläkemedel som peptider, oligonukleotider och antikroppar anses ha potentiella ansökan som romanen terapeutiska medel för eldfasta centrala nervsystemet som har för närvarande ingen botande behandling. Men eftersom de flesta bioläkemedel är vattenlösliga makromolekyler, är leverans från blodet in i hjärnan via intravenös oral administrering extremt svårt på grund av impedansen hos den blood - brain barriären (BBB).
Under de senaste åren har intranasal administrering rapporterats vara en potentiell väg för näsa-till-hjärnan leverans av terapeutiska medel som undviker BBB1,2,3,4,5. Dock har det varit relativt få rapporter om kvantitativ analys av näsa-till-hjärnan väg leverans6. Dessutom har praktiskt taget inga rapporter på etablerade optimal administration villkor och doseringsregimer, såsom volym, gånger, tidsperioder och hastighet, för utredningar av näsa-till-hjärnan leverans. De ovannämnda bristerna kan hänföras till följande orsaker: (i) en optimal metod för intranasal administrering för möss har ännu fastställas, och (ii) intranasal administrering av pipettering, som används allmänt, kännetecknas vanligtvis av interindividuell variation bland djur på grund av mukociliär clearance (MC), vilket ofta leder till underestimations av en viss drog faktisk näsa-till-hjärnan leverans potential.
Inandning anestesi med isofluran (initiering: 4%, underhåll: 2%) med en inandning mask för gnagare har vunnit utbredd användning, med syftet att minska eller eliminera smärta i samband med kirurgi utförs på försöksdjur. Användning av masker gör det relativt enkelt att utföra typisk Läkemedelslära i försöksdjur under inandning narkos via subkutan, intraperitoneal och intravenös rutterna. Masken måste dock vid intranasal administrering, tas tillfälligt bort från djuren för Läkemedelsverket. Med underhåll under 2% isofluran, djur normalt vakna upp snabbt från inandning anestesi. När administrationen volym per dos är stor, detta kan orsaka drog lösningen att flöda från näshålan i matstrupen, och en stor dos kan därför behöva delas upp i flera mindre doser för intranasal administrering till små djur. Som intranasal administrering kräver mask borttagning för upprepad administrering och tillräckligt med tid för ihållande näshålan leverans, finns det en hög sannolikhet att möss skulle vakna upp ur narkos under förfarandet för administration. Detta gör det mycket svårt att utföra intranasal administrering under ett stabilt bedövningsmedel tillstånd, och bidrar förmodligen till den observerade interindividuella variationen av näsa-till-hjärnan leverans bland gnagare.
I denna studie har vi därför utvecklat två nya metoder för stabil intranasal administrering under inandning anestesi, som medför minimal fysisk stress på försöksdjuren. I den första metoden används en tillfälligt öppningsbar mask som gör intranasal administrering under inandning anestesi. Den öppningsbara delen av masken innehåller en silikon-kontakt som kan användas i enlighet med administration timing för att underlätta stabil intranasal administrering med pipett. För den andra metoden, en kanyl var opereras in för att passera från matstrupen till näshålan och en sprutpump fästes sedan till detta så att drogen lösningen kunde levereras direkt och tillförlitligt i näshålan under stabila inandning anestesi. Denna metod kan förbättra leverans av läkemedel till hjärnan via näsan-till-hjärnan rutten, eftersom genom att väsentligt minimera effekterna av MC, drog retentively i näshålan skulle förbättras. Dessutom beskriver vi en metod för att utvärdera kvantitativt narkotika distribution nivåer (% för hjärnans injicerad dos/g) i hjärnan med hjälp av radioaktivt märkt [14C]-inulinsirap [molekylvikt (MW): 5.000] som en modell substrat av vattenlösliga makromolekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta djur studie (#AP17P004) utfördes enligt de riktlinjer som godkänts av Nihon University djur vård och användning kommittén (Tokyo, Japan). Denna studie (nr 17-0001) godkändes av radioisotop Center av skola av apotek, Nihon University.
1. djur som används för Intranasal administrering Under inandning anestesi
- Hus på experimentell möss i rostfritt stål burar under en 12-h ljus/mörk cykel (ljus på 8:00 AM – 8:00 PM), med en kontrollerad temperatur hålls vid 23 ± 1° C, luftfuktighet på 50% ± 10% och ad libitum tillgång till mat och vatten.
- Innan experiment, söva möss via inandning av 2% isofluran, följande inledande vid en koncentration på 4%. Bekräfta den nödvändiga nivån av anesthetization genom att kontrollera för försvinnandet av surface rätande.
2. beredning av Administration
- Bered en administration av [14C]-inulin (50 μM, 0,5 μCi/mL per mus) genom att späda i fosfatbuffrad saltlösning, och förvaras vid 4 ° C fram till användning.
3. intranasalt förvaltningar för möss
-
Mikropipett metod med en tillfälligt öppningsbar inandning mask (figur 1)
Obs: Denna teknik är en ändring av protokollet intranasal administrering med hjälp av en mikropipett som fastställts av Frey m.fl. 3- Fixa möss i ryggläge på en anslagstavlan genom att tejpa sina lemmar under inandning anestesi med 2% isofluran (figur 1A).
- Administrera en total volym på 25-μL administration lösning till varje mus intervaller 30-s, via 1 - till 2-μL doser alternativt administreras in i vänster och höger näsborrarna medan mössen korrigeras under inandning anestesi (figur 1B och C).
- Obs: Avfall bedövningsmedel gas rensas med aktiva medel (fume huva, hård-kanalanslutna biosäkerhet skåp, vakuum, etc.) När masken öppnas och passiva sätt (bedövningsmedel rökgaserna cannister) när stängt
-
Omvänd kanylering m etod från luftvägarna sida genom matstrupen (figur 2)
Obs: Denna teknik är en ändring av protokollet intranasalt absorption för råttor som fastställts av Hirai et al. 7- Fixa möss i ryggläge på en anslagstavlan genom att tejpa sina lemmar under inandning anestesi med 2% isofluran.
- Hår i nacken är rakad och prepped via betadine eller klorhexidin ansökan följt av en alkohol-skölj.
- Avslöja luftstrupen och matstrupen genom att utvidga huden nedanför halsen med pincett efter att göra ett litet snitt (1,5 cm) med en sax.
- Gör ett snitt (1 mm) i luftstrupen med sax.
- Infoga en kanyl (innerdiameter: 0,58 mm, yttre diameter: 0.965 mm) till en längd av 1.2 cm och fäst den andra änden av kanylen på insidan av masken inandning.
- Gör ett snitt (1 mm) i matstrupen med sax, infoga en kanyl (innerdiameter: 0,28 mm, yttre diameter: 0,61 mm) till en längd av 1,4 cm mot bakre delen av näshålan, och ligera (figur 2A och B).
Obs: Förfaranden 3.2.2 till 3.2.4 genomfördes under en stereoskopisk Mikroskop på x 10 förstoring. - Bifoga en nål (27G × 1/2) i en 1 mL-sprutan som är fylld med en lösning för administration och ansluta till en programmerbar mikro-sprutpumpen.
- Anslut ovanför nålen till den kanyl som hade infogats i matstrupen på 3.2.5 (figur 2 c).
- Administrera en total volym på 25 μL [14C]-inulinsirap lösning med en konstant hastighet (5 μL/min) (figur 2 c och 2D).
4. kvantitativa Experiment med hjälp av radioaktivt märkt vattenlösliga makromolekyler ([14C]-inulinsirap)
- Halshugga de experimentella möss under narkos och öppna upp deras kranium, använda sax och från sidan av förlängda märgen, samtidigt noga med att inte skada hjärnan.
- Extrahera noggrant hela hjärnan genom att ösa med en mikro-spatel från kraniet.
- Plats ett filterpapper fuktad med koksaltlösning på en petriskål som lagras på is.
- Placera de extraherade hjärnorna på det fuktade filterpappret.
- Torka bort blodet ansluter sig till ytan av hjärnan med en bomullspinne fuktad med koksaltlösning att eliminera minst påverkan av [14C]-inulinsirap i blodet på ytan av hjärnan.
- Dissekera hjärnor snabbt, och dela in dem i tre delar: den luktbulben, storhjärnan och förlängda märgen (inklusive pons).
- Placera hjärnan prover i vävnad solubiliserande ämne vid 50 ° C för 1 h.
- Tillsätt 10 μL av den flytande scintillation cocktail till hjärnan proverna.
- Överför en 25 μl alikvot av administration lösningen upplöst i scintillation cocktail till en scintillation flaskan avgöra radioaktiviteten i tillämpad lösningen.
- Mäta nedbrytningar per minut av [14C] radioaktivitet i hjärnan provet ([14C] Xhjärnan) och tillämpad lösningen ([14C] XIN dosen) i en flytande scintillationsräknare utrustad med en lämplig crossover korrigering för 3H och 14C.
5. dataanalys
- Beräkna de narkotika distribution nivåer (%) för den injicerade dosen (ID %) med hjälp av följande ekvation:
ID % ⁄g hjärnan = ([14C] Xhjärnan/ [14C] Xi dos) × 100,
där Xhjärnan (dpm/g hjärnan) är mängden av [14C] - inulinsirap mätt i hjärnvävnaden och XIN dosen (dpm/25 μL lösning) är koncentrationen av [14C] - inulinsirap i den lösning som används för intranasal administrering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 visar den [14C]-inulinsirap nivåer (ID % ⁄g hjärnan) i luktbulben (A), storhjärnan (B) och förlängda märgen (C) erhålls med de två typerna av intranasal administrering bedöms i den aktuella studien. Intranasal administrering med pipett metod aktiverat leverans av [14C]-inulinsirap i hjärnan med hjälp av öppningsbar inandning masker (figur 1). Under inandning anestesi visade de kvantitativa resultaten inga experimentella interindividuella variationen bland de undersökta djur, vilket framgår av låg standardfel. När metoden esofagus omvänd kanyl näshålan administration användes att administrera [14C] - inulinsirap under inandning anestesi (figur 2), signifikant högre nivåer av [14C] - inulinsirap observerades i den luktbulb ( Figur 3A), storhjärnan (figur 3B) och förlängda märgen (figur 3 c), än med pipett-metoden. Dessutom inom hjärnan, högre [14C]-inulinsirap nivåer upptäcktes i luktbulben och förlängda märgen, som är tydligt inblandade i näsan-till-hjärnan väg, än i storhjärnan.
Figur 1: Intranasal administrering med hjälp av en mikropipett i samband med en tillfälligt öppningsbar inandning mask. Fotografier visar en fast mus (A) med en sluten mask innan administrering, och (B) närbild och (C) hela utsikt över öppnade masken under intranasal administrering med pipett. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Intranasal administrering av omvänd kanylering från luftvägarna sida genom matstrupen med en sprutpump. Fotografier visar a kirurgiska området, (B) närbild och (C) hela vyer och (D) system med fast musen efter två typer av kanyl hade varit isatt i matstrupen och luftstrupen och ansluten till en mikro-spruta i en inandning mask. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Jämförelse av [14C]-inulinsirap nivåer i luktbulben (A), storhjärnan (B) och förlängda märgen (C) följande två typer av intranasal administrering. IN-A och IN-B anger mikropipett metod (figur 1) och omvänd kanylering metod (figur 2) för intranasal administrering, respektive. Med varje metod, en total volym på 25 μL av [14C]-inulin (50 μM, 0,5 μCi/mL) administrerades. Administration var av IN-B 5 μL/min. Varje kolumn representerar det medelvärde ± S.E. (n = 4). p < 0,01 (Student's t-test) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Näsa-till-hjärnan leverans av läkemedel förväntas ha en uttalad effekt på centrala nervsystemet eftersom detta utbildningsavsnitt utgör en direkt transportled som kringgår BBB. Tre olika näsa-till-hjärnan vägar har rapporterats till datum8. Först är luktnerven vägen, som passerar från lukt slemhinnan i nässlemhinnan till framhjärnan via luktnerven. Andra är den trigeminusnerven vägen, som passerar från respiratoriska slemhinnan i nässlemhinnan till hjärnstammen i hindbrain via trigeminusnerven. Tredje är CSF vägen, som distribueras i hela hjärnan via GSR. Näsa-till-hjärnan vägen har fått stor uppmärksamhet när det gäller administrationen av hydrofil makromolekyler, som tenderar att hämmas av BBB, och som ett sätt att leverera bioläkemedel till den centrala nervsystem8, 9 , 10 , 11 , 12. några tidigare studier har dock tydligt beskrivna metoder för intranasal administrering för små djur för att kontrollera leveransen av läkemedelskandidater via näsan-till-hjärnan vägen. Följaktligen har det varit mycket långsamma framsteg i forskning som rör näsa-till-hjärnan drogen leveransmekanismer med hjälp av små djur, som utgör ett betydande hinder när det gäller utforma näsa-till-hjärnan leveranssystem för läkemedelskandidater. Därför i denna studie utvecklat vi två protokoll för intranasal administrering under inandning narkos att undersöka fördelningen av olika läkemedelskandidater, såsom bioläkemedel, som är inriktade på centrala nervsystemet sjukdomar. Vi beskrev även en metod som kan användas för kvantitativa utvärderingen.
Metoden för intranasal administrering med pipett använda tillfälligt öppningsbar inandning masker utvecklats i denna studie gör det möjligt att utföra pålitliga administration med djur i ett tillstånd av stabil anestesi utan uppvaknande, som maskerna inte behöver vara bort (figur 1). Med denna teknik, visat vi leveransen av ett vattenlösligt makromolekyl (inulin; MW: 5.000) till hjärnan. Som inulin inte tränger BBB, kan det användas som en markör för intravaskulär volymutrymme (ca 10-15 μL/g hjärnan) i råtta hjärnan13. Vi fick utmärkt kvantitativa resultat med lilla experimentella fel. Nivån av [14C]-inulinsirap i hjärnan var klart högre efter intranasal administrering än efter intravenös administrering (inga data anges). Vi etablerade följaktligen att denna teknik är en livskraftig strategi för intranasal administrering som gör konventionella administration med pipett medan försökspersonerna kvar under inandning anestesi (figur 2). Inandning anestesi kan påverka näsans epitelceller membranet och därmed öka permeabiliteten genom nasal epitel. Ytterligare studier krävs att karakterisera hjärnan leverans med metoden omvänd kanylering under inandning anestesi, jämfört med konventionella anestesi såsom intraperitoneal administrering.
Vi undersökte därefter administration via omvänd kanylering från luftvägarna sida genom matstrupen, som utvecklades för att minimera effekterna av MC. Hos råttor, Hirais metod kräver kirurgi att stänga matstrupen och sedan att administrera från ingången till näsan för att minimera MC effekt. Det är fysiskt svårt att utföra kanylering från ingången till näsan i möss, och intranasal administrering kan orsaka nysningar. Vår omvända kanylering metod ansluter kanylen direkt in i näshålan från matstrupen till en mikro-sprutpump, som har den fördelen att det är möjligt att stänga matstrupen och airway av kirurgi och samtidigt utföra intranasalt administrering. Justering av mikro-sprutpumpen underlättar administration använder exakt dosering priser och volymer. Med denna teknik, spelade vi betydligt högre nivåer av de administrerade hydrofil makromolekyler i luktbulben, storhjärnan och förlängda märgen av möss än när du använder metoden pipett (figur 3). Detta verkar vara eftersom med intranasal administrering med pipett, lösningen administreras passivt i enlighet med spontan respiration, så att lösningen tenderar att elimineras mot luftstrupen och matstrupen av MC. Däremot med administration i näshålan genom en esofagus omvänd kanyl administreras lösningen aktivt med en sprutpump till näshålan. Det visas att denna strategi väsentligt ökar kvarhållandet av drogen lösningen i näshålan, vilket leder till en högre distribution nivåer i hjärnan. Dessutom upptäckte vi högre nivåer av administrerade lösningen i luktbulben och förlängda märgen, som är tydligt inblandade i näsan-till-hjärnan väg, än i storhjärnan. Följaktligen har vi visat att administrationen i näshålan genom en esofagus omvänd kanyl är en livskraftig metod för att utvärdera den fulla potentialen av näsa-till-hjärnan leveransen av läkemedelskandidater.
Sammanfattningsvis kan de två metoderna för intranasal administrering som vi utvecklat i denna studie förväntas vara extremt användbara tekniker för att utvärdera farmakokinetiken hos smådjur via näsan-till-hjärnan vägen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes delvis av privata universitet Branding forskningsprojektet från MEXT; ett bidrag för vetenskapliga Research (C) (17 K 08249 [att T.K. och T.S.]) från Japan sällskapet för främjande av vetenskap (JSPS); bidrag för forskningssamverkan från stiftelsen Hamaguchi för befordran av biokemi [till T.S.], och Takeda Science Foundation [att T.K.]. Vi tackar Mr Yuya Nito och Ms. Akiko Asami för deras värdefulla tekniska hjälp bedriva experimenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ddY mouse | Japan SLC, Inc. | Male, 4-6 weeks, 20-30 g | |
| Isoflurane | Pfizer | v002139 | |
| Isoflurane setup | SHINANO manufacturing CO. LTD. | SN-487-OTAir, SN-489-4 | |
| Isoflurane mask | SHINANO manufacturing CO. LTD. | For small rodents | |
| Isoflurane mask (openable type) | SHINANO manufacturing CO. LTD. | Special orders | |
| Anesthesia Box | SHINANO manufacturing CO. LTD. | SN-487-85-02 | |
| Animal experiments scissors-1 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | B-27H | |
| Animal experiments scissors-2 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | B-13H | |
| Tweezers-1 | FINE SCIENCE TOOLS Inc. | 11272-30 | Dumont #7 Dumoxel |
| Tweezers-2 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | A-12-1 | |
| Cannula tube (PE-50) | Becton, Dickinson and Company. | 5069773 | I.D.: 0.58 mm, O.D.: 0.965 mm |
| Cannula tube (SP-10) | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | KN-392 | I.D.: 0.28 mm, O.D.: 0.61 mm |
| Shaver | MARUKAN, LTD. | DC-381 | |
| Stereoscopic microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
| Needle 27G 1/2 in 13 mm | TERUMO CORPORATION | NN-2738R | |
| 1 mL syringe | TERUMO CORPORATION | SS-01T | |
| Syringe pump | Neuro science | NE-1000 | |
| Cellulose membrane | Toyo Roshi Kaisya, Ltd. | 00011090 | |
| Micro spatula | Shimizu Akira Inc. | 91-0088 | |
| Micropipette (0.5-10 uL) | Eppendorf AG | Z368083 | |
| Pipette chip | Eppendorf AG | 0030 000.811 | |
| Tape | TimeMed Labeling System, Inc. | T-534-R | For fixing mouse |
| [14C]-Inulin | American Radiolabeled Chemicals Inc. | ARC0124A | 0.1 mCi/mL |
| EtOH | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-00461 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc | Tri-Carb 4810TR |
References
- Sakane, T., Yamashita, S., Yata, N., Sezaki, H. Transnasal delivery of 5-fluorouracil to the brain in the rat. Journal of Drug Targeting. 7 (3), 233-240 (1999).
- Illum, L. Transport of drugs from the nasal cavity to the central nervous system. European Journal of Pharmaceutical Science. 11 (1), 1-18 (2000).
- Hanson, L. R., Frey, W. H. 2nd Intranasal delivery bypasses the blood-brain barrier to target therapeutic agents to the central nervous system and treat neurodegenerative disease. BMC Neuroscience. 9 (Suppl 3), S5 (2008).
- Chapman, C. D., et al. Intranasal treatment of central nervous system dysfunction in humans. Pharmaceutical Research. 30 (10), 2475-2484 (2012).
- Kanazawa, T. Development of non-invasive drug delivery system to the brain for brain diseases therapy. Yakugaku-Zasshi. 138 (4), 443-450 (2018).
- Kozlovskaya, L., Abou-Kaoud, M., Stepensky, D. Quantitative analysis of drug delivery to the brain via nasal route. Journal of Controlled Release. 189, 133-140 (2014).
- Hirai, S., Yashiki, T., Matsuzawa, T., Mima, H. Absorption of drugs from the nasal mucosa of rat. International Journal of Pharmaceutics. 7 (4), 317-325 (1981).
- Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Advances in Drug Delivery Reviews. 64 (7), 614-628 (2011).
- Lalatsa, A., Schatzlein, A. G., Stepensky, D. Strategies to deliver peptide drugs to the brain. Molecular Pharmaceutics. 11 (4), 1081-1093 (2014).
- Kanazawa, T. Brain delivery of small interfering ribonucleic acid and drugs through intranasal administration with nano-sized polymer micelles. Medical Devices. 8, 57-64 (2015).
- Kanazawa, T., et al. Enhancement of nose-to-brain delivery of hydrophilic macromolecules with stearate- or polyethylene glycol-modified arginine-rich peptide. International Journal of Pharmacology. 530 (1-2), 195-200 (2017).
- Kamei, N., et al. Effect of an enhanced nose-to-brain delivery of insulin on mild and progressive memory loss in the senescence-accelerated mouse. Molecular Pharmaceutics. 14 (3), 916-927 (2017).
- Suzuki, T., Oshimi, M., Tomono, K., Hanano, M., Watanabe, J. Investigation of transport mechanism of pentazocine across the blood-brain barrier using the in situ rat brain perfusion technique. Journal of Pharmaceutical Science. 91 (11), 2346-2353 (2002).
