Summary
Aquí, Describimos dos nuevos métodos de administración intranasal estable bajo anestesia inhalatoria con mínimo estrés físico para animales de experimentación. También describimos un método para la evaluación cuantitativa de los niveles de distribución de drogas en el cerebro vía el camino de la nariz al cerebro usando radiactivos [14C]-inulina como sustrato modelo de macromoléculas solubles en agua.
Abstract
Administración intranasal se ha divulgado para ser una vía potencial para la entrega de la nariz al cerebro de agentes terapéuticos que sortea la barrera blood - brain. Sin embargo, han habido pocos informes sobre no sólo el análisis cuantitativo, sino también condiciones de óptima Administración y dosificación de los regímenes para las investigaciones de la entrega de la nariz al cerebro. Los escasos progresos en la investigación sobre los mecanismos de la nariz al cerebro vía usando roedores representa un impedimento significativo en términos de diseño de sistemas de administración de la nariz al cerebro para fármacos candidatos.
Para obtener algunos avances en este sentido, desarrollamos y evaluamos dos nuevos métodos de administración intranasal estable bajo anestesia inhalatoria para animales de experimentación. También describimos un método para la evaluación de los niveles de distribución de drogas en el cerebro vía el camino de la nariz al cerebro usando etiqueta de radio [de14C]-inulina (peso molecular: 5.000) como sustrato modelo de macromoléculas solubles en agua.
Inicialmente, hemos desarrollado un protocolo de administración intranasal pipeta usando máscaras temporalmente se pueden abrir, que nos permitieron llevar a cabo la Administración confiable a los animales bajo anestesia estable. Mediante este sistema, [14C]-inulina podría ser entregada al cerebro con poco error experimental.
Posteriormente desarrollamos un protocolo de administración intranasal, que implique la canulación de la inversa del lado de la vía aérea a través del esófago, que fue desarrollado para reducir al mínimo los efectos de la depuración mucociliar (MC). Esta técnica llevó a niveles significativamente más altos de [14C]-la inulina, que cuantitativamente se detectó en el bulbo olfatorio, cerebro y bulbo raquídeo, que el método de la pipeta. Esto parece ser debido a retención de la solución de la droga en la cavidad nasal fue aumentado substancialmente por la administración activa con una bomba de jeringa en una dirección opuesta a la MC dentro de la cavidad nasal.
En conclusión, los dos métodos de administración intranasal desarrollada en este estudio se pueden esperar a ser técnicas muy útiles para la evaluación farmacocinética en roedores. El método de la inversa de la canulación, en particular, podría ser útil para evaluar el potencial de la nariz al cerebro entrega de medicamentos.
Introduction
Biomedicina como péptidos, oligonucleótidos y anticuerpos se considera tener aplicación potencial como nuevos agentes terapéuticos para los trastornos refractarios del sistema nervioso central que no tienen en la actualidad ningún tratamiento curativo. Sin embargo, porque la mayoría de la biomedicina es macromoléculas solubles en agua, entrega de la sangre en el cerebro mediante administración intravenosa u oral es extremadamente difícil debido a la impedancia de la barrera blood - brain (BBB).
En los últimos años, administración intranasal se ha divulgado para ser una vía potencial para la entrega de la nariz al cerebro de agentes terapéuticos que evita el BBB1,2,3,4,5. Sin embargo, ha habido relativamente pocos informes sobre el análisis cuantitativo de la nariz al cerebro vía entrega6. Por otra parte, han sido prácticamente no hay informes sobre condiciones de administración óptima establecida y regímenes de dosificación, tales como volumen, épocas, períodos de tiempo y velocidad, para las investigaciones de la entrega de la nariz al cerebro. Las deficiencias mencionadas se pueden atribuir a las siguientes razones: (i) un método óptimo de administración intranasal de ratones aún tiene que establecerse, y administración (ii) intranasal mediante pipeteo, que generalmente se utiliza, por lo general se caracteriza por la variación interindividual entre animales debido a la depuración mucociliar (MC), así a menudo conduce a la subestimación de las posibilidades de entrega efectiva de la nariz al cerebro de un medicamento en particular.
Anestesia Inhalatoria con isoflurano (Inicio: 4%, mantenimiento: 2%) con la inhalación de una máscara para roedores ha ganado uso generalizado, con el objetivo de reducir o eliminar el dolor asociado con la cirugía realizada en animales de experimentación. El uso de máscaras hace relativamente simple realizar FDA típico en animales de experimentación bajo anestesia de inhalación por las vías subcutáneas, intraperitoneales e intravenosa. Sin embargo, en el caso de administración intranasal, la máscara debe eliminarse temporalmente de los animales para la administración de la droga. Con mantenimiento debajo del 2% isoflurano, los animales suelen despiertan rápidamente de anestesia inhalatoria. Cuando el volumen por dosis de administración es grande, esto podría causar la solución farmacológica al flujo de la cavidad nasal hacia el esófago, y por lo tanto, una sola dosis grande deba ser dividida en varias dosis más pequeñas para la administración intranasal de pequeñas animales. Como administración intranasal exige retiro de mascarilla para la administración repetida y tiempo suficiente para la entrega sostenida de cavidad nasal, existe una alta probabilidad que ratones despertar de la anestesia durante el procedimiento administrativo. Esto hace muy difícil llevar a cabo administración intranasal en un estado anestésico estable y contribuye probablemente a la variación interindividual observada de la nariz al cerebro entrega entre roedores.
En este estudio, por lo tanto hemos desarrollado dos nuevos métodos de administración intranasal estable bajo anestesia inhalatoria, que imponen estrés físico mínimo en los animales experimentales. Para el primer método, utilizamos una máscara temporalmente abrible que permite administración intranasal durante la anestesia de inhalación. La parte abrible de la máscara incorpora un tapón de silicona que puede utilizarse según el tiempo de administración para facilitar la administración intranasal estable mediante una pipeta. Para el segundo método quirúrgico se insertó una cánula para pasar del esófago en la cavidad nasal, y una bomba de jeringa luego fue unida a esto para que la solución farmacológica podría directamente y fiable entregar dentro de la cavidad nasal bajo inhalación estable anestesia. Este método puede mejorar la entrega de drogas en el cerebro vía la nariz al cerebro, porque reduciendo sustancialmente los efectos de los MC, mejoraría drogas retentively en la cavidad nasal. Además, se describe un método para evaluar cuantitativamente los niveles de la distribución de la droga (% para el cerebro inyectado dosis/g) en el cerebro usando la etiqueta de radio [de14C]-inulina [peso molecular (MW): 5.000] como sustrato modelo de soluble en agua macromoléculas.
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Protocol
Se realizó este estudio en animales (#AP17P004) según lo aprobado por la Universidad de Nihon Animal cuidado y uso (Tokio, Japón). Este estudio (#17-0001) fue aprobado por el centro de radioisótopos de la Facultad de farmacia, Universidad de Nihon.
1. los animales utilizados para administración Intranasal bajo anestesia de inhalación
- Casa de los ratones experimentales en jaulas de acero inoxidable bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12-h (luz de 8:00 – 20:00), con temperatura controlada a mantenerse a 23 ± 1 ° C, humedad de 50% ± 10% y el acceso ad libitum al alimento y al agua.
- Antes de la experimentación, anestesiar los ratones por inhalación de 2% isoflurano, siguiente iniciación a una concentración de 4%. Confirmar el nivel requerido de anestesia comprobando la desaparición de superficie corregir.
2. preparación de la solución de administración
- Preparar una solución de administración de [14C]-inulina (50 μM, 0,5 μCi/mL por ratón) diluyendo en solución salina con tampón fosfato y almacenar a 4 ° C hasta su uso.
3. las administraciones intranasales de ratones
-
Método de micropipeta utilizando una máscara de inhalación que pueden abrirse temporalmente (figura 1)
Nota: Esta técnica es una modificación del Protocolo de administración intranasal utilizando una micropipeta establecida por Frey et al. 3- Fijar ratones en la posición supina sobre un panel de corcho con cinta adhesiva sus extremidades bajo anestesia inhalatoria con isoflurano 2% (figura 1A).
- Administrar un volumen total de 25 μL solución de administración para cada ratón a intervalos de 30-s, por 1-2 μL dosis bien administradas en las fosas nasales izquierdas y derecha mientras que los ratones son fijos bajo anestesia de inhalación (figura 1B y C).
- Nota: Residuos gas anestésico es compactarse por medio activo (fume hood, gabinete de bioseguridad duro conductos, vacío, etc.) cuando la máscara está abierta y por medios pasivos (frasco de gases anestésicos residuales) cerrada
-
Revertir la canulación de la m método del lado de la vía aérea a través del esófago (figura 2)
Nota: Esta técnica es una modificación del protocolo absorción intranasal para ratas por Hirai et al. 7- Fijar ratones en la posición supina sobre un panel de corcho con cinta adhesiva sus extremidades bajo anestesia inhalatoria con isoflurano 2%.
- Pelo en el cuello afeitado y preparado mediante aplicación de betadine o clorhexidina seguida por un enjuague de alcohol.
- Exponer la tráquea y el esófago mediante la expansión de la piel debajo de la garganta con unas pinzas después de hacer una incisión pequeña (1,5 cm) con tijeras.
- Hacer una incisión (1 mm) en la tráquea con unas tijeras.
- Insertar una cánula (diámetro interno: 0,58 mm, diámetro exterior: 0,965 mm) a una longitud de 1,2 cm y coloque el extremo opuesto de la cánula en el interior de la máscara de inhalación.
- Hacer una incisión (1 mm) en el esófago con unas tijeras, inserte una cánula (diámetro interno: 0,28 mm, diámetro exterior: 0,61 mm) a una longitud de 1,4 cm hacia la parte posterior de la cavidad nasal y ligar (figura 2A y B).
Nota: Procedimientos de 3.2.2 a 3.2.4 se llevaron a cabo en un microscopio estereoscópico con aumento x 10. - Conecte una aguja (27 × 1/2) en una jeringa de 1 mL con una solución de administración y conectar a una bomba de jeringa micro programable.
- Conectar por encima de la aguja de la cánula que se ha insertado en el esófago en 3.2.5 (figura 2).
- Administrar un volumen total de 25 μL [14C]-solución de inulina a una tasa constante (5 μL/min) (figura 2 y 2D).
4. cuantitativo experimento utilizando macromoléculas solubles en agua marcada con Radio ([14C]-inulina)
- Decapitar a los ratones experimentales bajo anestesia y abrir sus cráneos, con unas tijeras y desde el lado de la médula oblonga, mientras que teniendo cuidado de no dañar el cerebro.
- Extraer cuidadosamente el cerebro entero sacando con una micro espátula de cráneo.
- Lugar un papel de filtro humedecido con solución salina en una caja Petri que se almacena en hielo.
- Coloque el cerebro extraído en el papel de filtro humedecido.
- Limpie la sangre adherido a la superficie del cerebro con un hisopo de algodón humedecido con solución salina para eliminar al menos la influencia de [14C]-inulina en la sangre en la superficie del cerebro.
- Diseccionar cerebros rápidamente y dividir en tres partes: el bulbo olfatorio, cerebro y el oblongata de la médula (incluyendo el puente de Varolio).
- Colocar las muestras de cerebro en solubilizante de tejidos a 50 ° C durante 1 hora.
- Añadir 10 μL del líquido del cóctel de centelleo a las muestras de cerebro.
- Transferir una alícuota de 25 μL de la solución de administración disolvió en centelleo cóctel a un vial de centelleo para determinar la radioactividad de la solución aplicada.
- Medir las desintegraciones por minuto [14C] radiactividad de la muestra de cerebro ([14C] Xcerebro) y la solución aplicada ([14C] Xdosis IN) en un contador de centelleo líquido equipado con un apropiado corrección de crossover de 3H y 14C.
5. Análisis de datos
- Calcular los droga niveles de distribución (%) de la dosis inyectada (% ID) mediante la siguiente ecuación:
Cerebro de ⁄g ID % = ([14C] Xcerebro/ [14C] Xdosis) × 100,
donde Xcerebro (cerebro de dpm/g) es la cantidad de [14C] - inulina medidos en el tejido cerebral y XIN dosis (solución dpm/25 μL) es la concentración del [14C] - inulina en la solución utilizada para la administración intranasal.
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Representative Results
La figura 3 muestra [14C]-los niveles de inulina (cerebro de ⁄g ID %) en el bulbo olfatorio (A), cerebro (B) y el oblongata de la médula (C) obtenidos mediante los dos tipos de administración intranasal evaluada en el presente estudio. Administración intranasal mediante la entrega de método habilitado pipeta [14C]-inulina en el cerebro utilizando máscaras de inhalación se pueden abrir (figura 1). Bajo anestesia de inhalación, los resultados cuantitativos no revelaron ninguna variación interindividual experimental entre los animales examinados, como indicado por el error de estándar baja. Cuando se utilizó el método de administración de cavidad nasal de cánula esofágica de reversa para administrar [14C] inulina - inulina bajo anestesia inhalatoria (figura 2), niveles significativamente más altos de [14C] - se observaron en el bulbo olfatorio ( Figura 3A), cerebro (figura 3B) y el oblongata de la médula (figura 3), que con el método de la pipeta. Por otra parte, dentro del cerebro, más alta [14C]-se detectaron niveles de inulina en el bulbo olfatorio y oblongata de la médula, que están implicados prominente en el camino de la nariz al cerebro, que en el cerebro.
Figura 1: administración Intranasal mediante una micropipeta junto con una máscara de inhalación temporalmente abrible. Fotografías donde se ve un ratón fijo (A) con una máscara cerrada antes de la administración y (B) primer plano y vistas todos (C) de la máscara abierta durante la administración intranasal con una pipeta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: administración Intranasal por canulación de la inversa del lado de la vía aérea a través del esófago mediante una bomba de jeringa. Fotografías mostrando (A) área, (B) primer planos y (C) toda vistas y (D) esquema de un ratón fijo después de dos tipos de cánula habían sido insertados en el esófago y la tráquea y conectados a una jeringa de micro en una máscara de inhalación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Comparación de [14C]-los niveles de inulina en el bulbo olfatorio (A), cerebro (B) y el oblongata de la médula (C) después de dos tipos de administración intranasal. En un y IN-B indican el método de micropipeta (figura 1) y el método de la canulación de la inversa (figura 2) para administración intranasal, respectivamente. Cada método, de un volumen total de 25 μL de [14C]-inulina (50 μM, 0,5 μCi/mL) se administró. La tasa de administración de IN-B fue 5 μL/min. Cada columna representa el promedio ± S.E. (n = 4). p < 0.01 (de Student t-test) por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se espera que la entrega de la nariz al cerebro de las drogas tienen un efecto pronunciado sobre los trastornos del sistema nervioso central debido a que esta vía representa una ruta de transporte directo que el BBB. Tres vías diferentes de la nariz al cerebro se han divulgado para fecha8. La primera es del nervio olfatorio, que pasa de la mucosa olfatoria de la mucosa nasal en el forebrain a través del nervio olfatorio. La segunda es del nervio trigémino, que pasa de la mucosa respiratoria en la mucosa nasal al médula oblonga en el cerebelo a través del nervio de trigeminal. La tercera es la vía de la CSF, que se distribuye a través del cerebro a través del CSF. La vía de la nariz al cerebro ha atraído la atención considerable con respecto a la administración de macromoléculas hidrofílicas, que tienden a ser impedido por el BBB y como medio de entrega de Biomedicina en el sistema nervioso central8, 9 , 10 , 11 , 12. sin embargo, algunos estudios previos han descrito claramente métodos de administración intranasal para pequeños animales con el fin de verificar la entrega de fármacos candidatos vía el camino de la nariz al cerebro. En consecuencia, ha sido muy lento avance en investigaciones relacionadas con mecanismos de entrega de drogas de la nariz al cerebro mediante pequeños animales, que representa un impedimento significativo en términos de diseño de sistemas de administración de la nariz al cerebro para fármacos candidatos. Por lo tanto, en este estudio, hemos desarrollado dos protocolos para la administración intranasal bajo anestesia inhalatoria para investigar la distribución de los fármacos candidatos diferentes, tales como biomedicina, dirigidos a enfermedades del sistema nervioso central. También describimos un método que puede utilizarse para evaluación cuantitativa.
El método de administración intranasal con la pipeta usando máscaras de inhalación que pueden abrirse temporalmente desarrolladas en este estudio permite realizar administración confiable con los animales en un estado de anestesia estable sin despertar, como las máscaras no tienen que ser eliminado (figura 1). Usando esta técnica, hemos demostrado la entrega de una macromolécula soluble en agua (inulina; MW: 5.000) en el cerebro. Como la inulina no penetra en el BBB, puede utilizarse como un marcador de volumen intravascular espacio (aproximadamente cerebro μL/g de 10-15) en el cerebro de rata13. Obtuvimos excelentes resultados cuantitativos con poco error experimental. El nivel de [14C]-inulina en el cerebro era claramente más alta después de la administración intranasal que después de administración intravenosa (datos no mostrados). En consecuencia, se estableció que esta técnica representa un enfoque viable para la administración intranasal que permite la administración convencional con una pipeta mientras los sujetos permanecen bajo anestesia inhalatoria (figura 2). Anestesia inhalatoria podría afectar la membrana epitelial nasal y, consecuentemente, aumentar la permeabilidad a través del epitelio nasal. Otros estudios son necesarios para caracterizar la entrega cerebral utilizando el método de la inversa de la canulación bajo anestesia inhalatoria, en comparación con la anestesia convencional como la administración intraperitoneal.
Posteriormente investigamos la administración a través de la canulación de la inversa del lado de la vía aérea a través del esófago, que fue desarrollado para reducir al mínimo los efectos de la MC. En ratas, método de Hirai requiere una cirugía para cerrar el esófago y luego a administrar desde la entrada a la nariz para reducir al mínimo el efecto de MC. En ratones, es físicamente difícil para llevar a cabo la canulación de la entrada de la nariz, y administración intranasal puede causar estornudos. Nuestro método de inverso de la canulación conecta la cánula que se inserta directamente en la cavidad nasal desde el esófago a una bomba de jeringa de micro que tiene la ventaja de que es posible cerrar el esófago y las vías respiratorias por la cirugía y simultáneamente realizar intranasal Administración. Ajuste de la bomba de jeringa micro facilita administración usando volúmenes y tasas de dosificación precisa. Usando esta técnica, se registraron niveles significativamente más altos de las macromoléculas hidrofílicas administradas en el bulbo olfatorio, cerebro y el oblongata de la médula de ratones que cuando usando el método de la pipeta (figura 3). Esto parece ser porque con la administración intranasal con una pipeta, la solución es administrada pasivamente según la respiración espontánea, tal que la solución tiende a eliminarse hacia la tráquea y el esófago por MC. En cambio, con la administración en la cavidad nasal a través de una cánula esofágica inversa, la solución se administra activamente utilizando una bomba de jeringa en la cavidad nasal. Parece que este enfoque aumenta considerablemente la retención de la solución de droga en la cavidad nasal, lo que a niveles más altos de la distribución en el cerebro. Además, se detectaron niveles más altos de la solución administrada en el bulbo olfatorio y oblongata de la médula, que están implicados prominente en el camino de la nariz al cerebro, que en el cerebro. Por consiguiente, hemos demostrado que la administración en la cavidad nasal a través de una cánula esofágica inversa es un método viable para evaluar el potencial de la entrega de la nariz al cerebro de los candidatos de la droga.
En conclusión, los dos métodos de administración intranasal que desarrollamos en este estudio se pueden esperar a ser técnicas muy útiles para la evaluación farmacocinética en animales pequeños a través de la vía de la nariz al cerebro.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado en parte por la privada Universidad marca proyecto de investigación de MEXT; subvenciones para Research (C) científico (17 K 08249 [a T.K. y T.S.]) de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS); una subvención para la investigación cooperativa de la Fundación de Hamaguchi para el avance de la bioquímica [a T.S.] y la Fundación de ciencia de Takeda [a T.K.]. Agradecemos a Yuya Nito el Sr. y la Sra. Akiko Asami por su valiosa asistencia técnica en la realización de los experimentos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ddY mouse | Japan SLC, Inc. | Male, 4-6 weeks, 20-30 g | |
| Isoflurane | Pfizer | v002139 | |
| Isoflurane setup | SHINANO manufacturing CO. LTD. | SN-487-OTAir, SN-489-4 | |
| Isoflurane mask | SHINANO manufacturing CO. LTD. | For small rodents | |
| Isoflurane mask (openable type) | SHINANO manufacturing CO. LTD. | Special orders | |
| Anesthesia Box | SHINANO manufacturing CO. LTD. | SN-487-85-02 | |
| Animal experiments scissors-1 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | B-27H | |
| Animal experiments scissors-2 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | B-13H | |
| Tweezers-1 | FINE SCIENCE TOOLS Inc. | 11272-30 | Dumont #7 Dumoxel |
| Tweezers-2 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | A-12-1 | |
| Cannula tube (PE-50) | Becton, Dickinson and Company. | 5069773 | I.D.: 0.58 mm, O.D.: 0.965 mm |
| Cannula tube (SP-10) | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | KN-392 | I.D.: 0.28 mm, O.D.: 0.61 mm |
| Shaver | MARUKAN, LTD. | DC-381 | |
| Stereoscopic microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
| Needle 27G 1/2 in 13 mm | TERUMO CORPORATION | NN-2738R | |
| 1 mL syringe | TERUMO CORPORATION | SS-01T | |
| Syringe pump | Neuro science | NE-1000 | |
| Cellulose membrane | Toyo Roshi Kaisya, Ltd. | 00011090 | |
| Micro spatula | Shimizu Akira Inc. | 91-0088 | |
| Micropipette (0.5-10 uL) | Eppendorf AG | Z368083 | |
| Pipette chip | Eppendorf AG | 0030 000.811 | |
| Tape | TimeMed Labeling System, Inc. | T-534-R | For fixing mouse |
| [14C]-Inulin | American Radiolabeled Chemicals Inc. | ARC0124A | 0.1 mCi/mL |
| EtOH | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-00461 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc | Tri-Carb 4810TR |
References
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