Summary
Her beskriver vi to nye metoder for stabil intranasal administrasjon under innånding anestesi med minimal fysisk stress for forsøksdyr. Vi også beskriver en metode for kvantitativ vurdering av narkotika distribusjon i hjernen via nese-til-hjerne veien ved hjelp av radiolabeled [14C]-inulin som en modell substrat av vannløselige makromolekyler.
Abstract
Intranasal administrasjonen har blitt rapportert å være en potensiell sti nese-til-hjerne levering av terapeutiske agenter som omgår blod - hjerne barrieren. Men har det vært noen rapporter om ikke bare den kvantitativ analyse, men også optimal administrasjon forhold og dosering regimer for undersøkelser av nese-til-hjerne levering. Begrenset fremdriften i forskning på nesen-til-hjerne veien mekanismer bruker gnagere representerer et betydelig hinder i designe nese-til-hjerne leveringssystemer for kandidaten narkotika.
For å få noe fremskritt i denne forbindelse, vi utviklet og evalueres to nye metoder for stabil intranasal administrasjon under innånding anestesi for forsøksdyr. Vi også beskriver en metode for vurdering av narkotika distribusjon nivåer i hjernen via nese-til-hjerne veien ved hjelp av radio-merket [14C]-inulin (molekylvekt: 5000) som en modell substrat av vannløselige makromolekyler.
I utgangspunktet utviklet vi en pipette-basert intranasal administrasjon protokoll som midlertidig kan åpnes masker, som mulig for oss å utføre pålitelig administrasjon dyr under stabil anestesi. Med dette systemet, [14C]-inulin kan leveres til hjernen med litt eksperimentell feil.
Deretter utviklet vi en intranasal administrasjon protokoll innebærer omvendt cannulation fra airway siden gjennom esophagus, som ble utviklet for å redusere effekten av mucociliary klaring (MC). Denne teknikken førte til betydelig høyere nivåer av [14C]-inulin, som ble kvantitativt oppdaget i Luktelappen, hjernen og forlengede marg, pipette-metoden. Dette synes å være fordi oppbevaring av narkotika løsningen i nesehulen ble vesentlig økt med aktive administrasjon med en sprøytepumpe i en retning motsatt MC i nesehulen.
Avslutningsvis kan de to metodene for intranasal administrasjon utviklet i denne studien forventes å være ekstremt nyttige teknikker for å vurdere farmakokinetikken i gnagere. Metoden omvendt cannulation spesielt kan være nyttig for å vurdere potensialet på nesen-til-hjerne levering av narkotika kandidater.
Introduction
Biomedicines som peptider, oligonucleotides og antistoffer er vurdert å ha potensielle program som roman terapeutiske agenter for ildfaste sentrale nervesystemet lidelser som har ingen helbredende terapi. Men fordi de fleste biomedicines er vannløselige makromolekyler, er levering fra blod til hjernen via intravenøse eller muntlig administrasjon ekstremt vanskelig på grunn av impedans på blod - hjerne barrieren (BBB).
De siste årene, har intranasal administrasjon blitt rapportert å være en potensiell sti nese-til-hjerne levering av terapeutiske agenter som unngår de BBB1,2,3,4,5. Imidlertid har det vært relativt få rapporter om kvantitativ analyse av nese-til-hjerne veien levering6. Videre har det vært nesten ingen rapporter på etablert optimal administrasjon forhold og dosering regimer, for eksempel volum, ganger, tidsperioder og hastighet, for undersøkelser av nese-til-hjerne levering. De nevnte manglene kan tilskrives årsaker: (i) en optimal metode for intranasal administrasjon for mus har ennå å bli etablert, og (ii) intranasal administrasjonen av pipettering, som vanligvis brukes, er vanligvis preget av interindividuelle variasjon blant dyr på grunn av mucociliary klaring (MC), og dermed ofte fører til underestimations av faktisk nese-til-hjerne levering potensialet i et bestemt medikament.
Innånding anestesi bruker isoflurane (innvielsen: 4%, vedlikehold: 2%) med en innånding maske for gnagere har fått utbredt bruk, med sikte på å redusere eller eliminere smerten forbundet med kirurgi utført på forsøksdyr. Bruk av masker gjør det relativt enkelt å utføre typisk drug administrasjonen i forsøksdyr under innånding anestesi via subkutan, intraperitoneal og intravenøs rutene. Imidlertid i intranasal administrasjon må masken fjernes midlertidig fra dyr narkotika administrasjon. Med vedlikehold under 2% isoflurane, dyr vanligvis vekke raskt innånding bedøvelsen. Når administrasjonen volumet per dose er stor, dette kan føre til narkotika løsningen å strømme fra nesehulen i spiserøret, og derfor en enkelt stor dose må deles inn i flere mindre doser for intranasal administrasjon til små dyr. Som intranasal administrasjon nødvendiggjør maske fjerning gjentatte administrasjon og tilstrekkelig tid for vedvarende nesehulen levering, er det en høy sannsynlighet for at mus ville vekke fra anestesi under administrasjon prosedyren. Dette gjør det svært vanskelig å utføre intranasal administrasjon under en stabil bedøvende tilstand, og bidrar sannsynligvis til den observerte interindividuelle varianten av nese-til-hjerne levering blant gnagere.
I denne studien utviklet vi derfor to nye metoder for stabil intranasal administrasjon under innånding anestesi, som pålegger minimal fysisk stress på forsøksdyr. For det første metoden brukte vi en midlertidig kan åpnes maske som gjør intranasal administrasjonen under innånding anestesi. Delen kan åpnes i masken inkorporerer en silikon plugg som kan brukes i henhold til administrasjon timing for å lette stabil intranasal administrasjon bruker en pipette. For den andre metoden, en kanyle kirurgisk ble satt inn for å passere fra spiserøret i nesehulen og en sprøytepumpe ble deretter festet til dette slik at stoffet løsningen kan direkte og pålitelig leveres i nesehulen under stabil innånding anestesi. Denne metoden kan øke tilførselen av narkotika til hjernen via nese-til-hjerne ruten, fordi av vesentlig minimere effekten av MC, stoffet retentively i nesehulen ville være bedre. I tillegg beskriver vi en metode for å vurdere kvantitativt narkotika distribusjon nivåer (% for injisert dose/g hjernen) i hjernen ved hjelp av radio-merket [14C]-inulin [molekylvekt (MW): 5000] som en modell substrat av vannløselige makromolekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dette dyret studien (#AP17P004) ble utført i henhold til veiledning godkjent av Nihon University Animal Care og bruk Committee (Tokyo, Japan). Denne studien (#17-0001) ble godkjent av radioisotop midten av farmasøytisk, Nihon University.
1. dyr som brukes for Intranasal administrasjon Under innånding anestesi
- Huset eksperimentelle musene i rustfritt stål bur under en 12-h lys/mørke syklus (lett på 8:00 AM til 8:00), med en kontrollert temperatur opprettholdt på 23 ± 1° C, luftfuktighet på 50% ± 10%, og ad libitum tilgang til mat og vann.
- Før eksperimentering, bedøve musene via innånding av 2% isoflurane, følgende initiering i en konsentrasjon på 4%. Bekrefte det nødvendige nivået på anesthetization ved å merke av for forsvinningen av overflaten rettende.
2. tilberedning av administrasjon
- Forberede en administrasjon løsning av [14C]-inulin (50 μM, 0,5 μCi/mL per mus) fortynne i fosfat-bufret saltvann, og lagre på 4 ° C før bruk.
3. intranasal administrasjoner for mus
-
Brønnene metoden bruker en midlertidig kan åpnes innånding maske (figur 1)
Merk: Denne teknikken er en modifikasjon av intranasal administrasjon protokollen bruker brønnene etablert av Frey et al. 3- Fix mus i supine posisjon på en corkboard ved taping deres lemmer under innånding anestesi med 2% isoflurane (figur 1A).
- Administrere et totalt volum på 25-μL administrasjon løsning til hver musen i 30-s intervaller, via 1 - til 2-μL doser alternativt administreres i de venstre og høyre neseborene mens mus er fast under innånding anestesi (figur 1B og C).
- Merk: Avfall bedøvende gass er scavenged aktiv måte (fume hette, hard-ducted biosikkerhet regjering, vakuum, etc.) når masken er åpnet og passiv måte (avfall bedøvende gass beholderen) når lukket
-
Omvendt cannulation m ethod fra airway siden gjennom spiserøret (figur 2)
Merk: Denne teknikken er en modifikasjon av intranasal absorpsjon protokollen for rotter etablert av Hirai et al. 7- Fix mus i supine posisjon på en corkboard ved taping deres lemmer under innånding anestesi med 2% isoflurane.
- Håret i halsen er barbert og prepped via betadine eller chlorhexidine søknad etterfulgt av en alkohol skyll.
- Utsett trachea og esophagus ved å utvide huden under halsen med tang etter et lite innsnitt (1,5 cm) med saks.
- Gjør et snitt (1 mm) i luftrøret med saks.
- Setter inn en kanyle (interne diameter: 0.58 mm, utvendig diameter: 0.965 mm) til en lengde på 1,2 cm og sy den motsatte enden av kanyle innsiden av innånding masken.
- Gjøre et snitt (1 mm) i spiserøret med saks, sette inn en kanyle (interne diameter: 0,28 mm, utvendig diameter: 0,61 mm) til en lengde på 1.4 cm mot bakre del av nesehulen, og ligate det (figur 2A og B).
Merk: Prosedyrene 3.2.2 til 3.2.4 ble utført under stereoskopisk mikroskop ved × 10 forstørrelse. - Feste en nål (27G × 1/2) til en 1-mL sprøyte fylt med en administrasjon løsning og koble til en programmerbar mikro-sprøytepumpen.
- Koble over p å kanyle hadde satt inn i spiserøret på 3.2.5 (figur 2C).
- Administrere et totalt volum på 25 μL [14C]-inulin løsning med en konstant hastighet (5 μL/min) (figur 2C og 2D).
4. kvantitativ eksperimentere med Radio-merket vannløselige makromolekyler ([14C]-inulin)
- Halshugge eksperimentelle musene under narkose og åpne opp deres kranier, ved hjelp av saks og fra siden av forlengede, mens ta vare ikke å skade hjernen.
- Ekstra nøye hele hjernen av scooping bruker en mikro-slikkepott fra kraniet.
- Sted et filter papir fuktet med saltvann på en Petriskål som er lagret på is.
- Plasser utpakkede hjernen på fuktet filter papir.
- Tørk av blod følge overflaten av hjernen med en bomullspinne fuktet med saltvann å eliminere minst påvirkning av [14C]-inulin i blodet på overflaten av hjernen.
- Dissekere hjernen raskt, og dele dem inn i tre deler: den olfactory pære, hjernen og forlengede marg (inkludert pons).
- Plass hjernen prøver i vev solubilizer ved 50 ° C i 1 time.
- Legge til 10 μL av flytende scintillation cocktail hjernen prøvene.
- Overføre en 25 μL aliquot administrasjon løsningen oppløst i scintillation cocktail til scintillation ampuller å bestemme radioaktiviteten anvendt løsningen.
- Måle disintegrations per minutt [14C] radioaktivitet i hjernen utvalget ([14C] Xhjernen) og anvendt løsningen ([14C] XIN dose) i en flytende scintillation teller utstyrt med en passende Crossover korreksjon for 3H og 14C.
5. analyse
- Beregne narkotika distribusjon nivåene (%) for den injiserte dosen (ID %) ved hjelp av følgende ligning:
ID % ⁄g hjernen = ([14C] Xhjernen/ [14C] Xdose) × 100
der Xhjernen (dpm/g hjernen) er mengden av [14C] - inulin målt i hjernevevet og XIN dose (dpm/25 μL løsning) er konsentrasjonen av den [14C] - inulin i løsningen for intranasal administrasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 viser den [14C]-inulin nivåer (ID % ⁄g hjernen) i Luktelappen (A), hjernen (B) og forlengede marg (C) hentet ved hjelp av de to typene intranasal administrasjon vurdert studien. Intranasal administrasjon med Pipetter metoden aktivert levering av [14C]-inulin inn i hjernen ved hjelp kan åpnes innånding masker (figur 1). Under innånding anestesi viste kvantitativ resultatene ingen eksperimentell interindividuelle variasjon blant undersøkt dyrene, som indikert ved lav standardfeilen. Når metoden esophageal omvendt kanyle nesehulen administrasjon ble brukt til å administrere [14C] - inulin under innånding anestesi (figur 2), betydelig høyere nivåer av [14C] - inulin ble observert i Luktelappen ( Figur 3A), hjernen (figur 3B) og forlengede marg (Figur 3 c), enn med metoden pipette. Videre i hjernen, høyere [14C]-inulin nivåer ble oppdaget i Luktelappen og forlengede marg, som er tydelig involvert i nese-til-hjerne veien, enn i cerebrum.
Figur 1: Intranasal administrasjon med brønnene i forbindelse med en midlertidig kan åpnes innånding maske. Bildene viser en fast mus (A) med en lukket maske før administrasjonen, og (B) nærbilde og (C) hele utsikt over åpnet masken intranasal administrasjon bruker en pipette. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Intranasal administrasjon av omvendt cannulation fra airway siden gjennom spiserøret bruker en sprøytepumpe. Fotografier viser (A) kirurgiske området, (B) nærbilde og (C) hele og (D) ordningen med fast musen etter to typer kanyle hadde blitt satt inn i spiserøret og luftrøret og koblet til en mikro-sprøyte i en innånding maske. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Sammenligning av [14C]-inulin nivåer i Luktelappen (A), hjernen (B) og forlengede marg (C) følgende to typer intranasal administrasjon. IN-A- og IN-B Angir brønnene metoden (figur 1) og omvendt cannulation metoden (figur 2) for intranasal administrasjon, henholdsvis. Med hver metode, et totalt volum på 25 μL [14C]-inulin (50 μM, 0,5 μCi/mL) ble administrert. Administrasjon frekvensen av IN-B var 5 μL/min. Hver kolonne representerer den gjennomsnittlig ± S.E. (n = 4). p < 0,01 (Student t-test) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nese-til-hjerne levering av legemidler er forventet å ha en uttalt effekt på sentralnervesystemet lidelser fordi denne veien representerer direkte transportvei som omgår BBB. Tre ulike nese-til-hjerne veier er rapportert til dato8. Først er olfactory nerve veien, som går fra olfactory mucosa i nasal mucosa til forebrain via på olfactory nerve. Andre er trigeminal nerve veien, som går fra luftveiene mucosa i nasal mucosa til hjernestammen i hindbrain via trigeminal nerve. Tredje er CSF veien, som distribueres gjennom til hjernen via CSF. Nese-til-hjerne veien har tiltrukket betydelig oppmerksomhet med hensyn til administrasjon av hydrofile makromolekyler, som pleier å være forhindret av BBB, og som leverer biomedicines til sentralnervesystemet8, 9 , 10 , 11 , 12. men noen tidligere studier har tydelig beskrevet metoder for intranasal administrasjon for små dyr for å kontrollere levering av kandidaten rusmidler fra nese-til-hjerne veien. Derfor har det vært svært langsom fremgang i forskning relatert til nese-til-hjerne stoffet leveringsmekanismer bruke små dyr, som representerer et betydelig hinder i designe nese-til-hjerne leveringssystemer for kandidaten narkotika. Derfor i denne studien utviklet vi to protokoller for intranasal administrasjon under innånding anestesi å undersøke fordelingen av ulike kandidat stoffer, som biomedicines, som er rettet mot sentralnervesystemet sykdommer. Vi også beskrevet en metode som kan brukes for kvantitativ vurdering.
Metoden for intranasal administrasjon av pipette bruker midlertidig kan åpnes innånding masker utviklet i denne studien gjør det mulig å utføre pålitelig administrasjon med dyr i en tilstand av stabil anestesi uten oppvåkning, som maskene ikke trenger bli fjernet (figur 1). Bruker denne teknikken, viste vi levering av en vannløselig Makromolekyl (inulin; MW: 5000) til hjernen. Som inulin ikke trenge BBB, kan den brukes som en markør av intravascular volumplass (ca 10-15 μL/g hjernen) i rotte hjernen13. Vi fikk gode kvantitative resultater med litt eksperimentell feil. Nivået av [14C]-inulin i hjernen var klart høyere etter intranasal administrasjon enn etter intravenøs administrasjon (data ikke vist). Derfor etablerte vi at denne teknikken representerer en levedyktig tilnærming for intranasal administrasjon som gjør konvensjonelle administrasjon bruker en pipette mens fagene er fortsatt under innånding anestesi (figur 2). Innånding anestesi kan påvirke nasal epithelial membranen, og følgelig øke permeabilitet gjennom nasal epitel. Videre studier er nødvendig å karakterisere hjernen levering med metoden omvendt cannulation under inhalasjonen anestesi, sammenlignet med konvensjonelle anestesi som intraperitoneal administrasjon.
Vi undersøkt deretter administrasjon via omvendt cannulation fra airway siden gjennom esophagus, som ble utviklet for å redusere effekten av MC. Rotter, Hirais metode krever kirurgi å lukke spiserøret og deretter administrere fra inngangen til nesen å minimere MC effekten. I mus, det er fysisk vanskelig å utføre cannulation fra inngangen til nesen og intranasal administrasjon forårsake nysing. Vår omvendt cannulation metoden forbinder kanyle direkte inn nesehulen fra spiserøret å en mikro-sprøytepumpen som har fordelen at det er mulig å lukke spiserøret og luftveier av kirurgi og samtidig utføre intranasal administrasjon. Justering av mikro-sprøytepumpen forenkler administrasjonen å bruke presis dosering priser og volumer. Bruker denne teknikken, registrerte vi betydelig høyere nivåer av administrert hydrofile macromolecules i olfactory pære, hjernen og forlengede mus enn ved bruk av metoden Pipetter (Figur 3). Dette synes å være fordi med intranasal administrasjon bruker en pipette, løsningen administreres passivt i samsvar med spontan åndedrett, slik at løsningen gjerne elimineres mot trachea og esophagus ved MC. I kontrast med administrasjonen i nesehulen gjennom en esophageal omvendt kanyle administreres løsningen aktivt bruker en sprøytepumpe til nesehulen. Det synes at denne tilnærmingen vesentlig øker oppbevaring av narkotika løsningen i nesehulen, fører til et høyere distribusjon nivåer i hjernen. Videre oppdaget vi høyere nivåer av administrert løsning i Luktelappen og forlengede marg, som er tydelig involvert i nese-til-hjerne veien, enn i cerebrum. Derfor viste vi at administrasjonen i nesehulen gjennom en esophageal omvendt kanyle er en levedyktig metode for å vurdere det fulle potensialet av nese-til-hjerne leveringen av narkotika kandidater.
Som konklusjon, kan to metoder for intranasal administrasjon som vi har utviklet i denne studien forventes å være ekstremt nyttige teknikker for å vurdere farmakokinetikken i små dyr via nese-til-hjerne veien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet delvis av Private universitetet merkevarebygging prosjektet fra MEXT; en Grant-in-Aid for vitenskapelige Research (C) (17 K 08249 [til T.K. og TS]) fra Japan Society for fremme av vitenskap (JSPER); stipend for samarbeidende forskning fra Hamaguchi Foundation for avansement i biokjemi [til T.S.], og Takeda Science Foundation [T.K.]. Vi takker Mr. Yuya Nito og Ms. Akiko Asami for deres verdifulle kundestøtte i gjennomfører eksperimenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ddY mouse | Japan SLC, Inc. | Male, 4-6 weeks, 20-30 g | |
| Isoflurane | Pfizer | v002139 | |
| Isoflurane setup | SHINANO manufacturing CO. LTD. | SN-487-OTAir, SN-489-4 | |
| Isoflurane mask | SHINANO manufacturing CO. LTD. | For small rodents | |
| Isoflurane mask (openable type) | SHINANO manufacturing CO. LTD. | Special orders | |
| Anesthesia Box | SHINANO manufacturing CO. LTD. | SN-487-85-02 | |
| Animal experiments scissors-1 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | B-27H | |
| Animal experiments scissors-2 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | B-13H | |
| Tweezers-1 | FINE SCIENCE TOOLS Inc. | 11272-30 | Dumont #7 Dumoxel |
| Tweezers-2 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | A-12-1 | |
| Cannula tube (PE-50) | Becton, Dickinson and Company. | 5069773 | I.D.: 0.58 mm, O.D.: 0.965 mm |
| Cannula tube (SP-10) | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | KN-392 | I.D.: 0.28 mm, O.D.: 0.61 mm |
| Shaver | MARUKAN, LTD. | DC-381 | |
| Stereoscopic microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
| Needle 27G 1/2 in 13 mm | TERUMO CORPORATION | NN-2738R | |
| 1 mL syringe | TERUMO CORPORATION | SS-01T | |
| Syringe pump | Neuro science | NE-1000 | |
| Cellulose membrane | Toyo Roshi Kaisya, Ltd. | 00011090 | |
| Micro spatula | Shimizu Akira Inc. | 91-0088 | |
| Micropipette (0.5-10 uL) | Eppendorf AG | Z368083 | |
| Pipette chip | Eppendorf AG | 0030 000.811 | |
| Tape | TimeMed Labeling System, Inc. | T-534-R | For fixing mouse |
| [14C]-Inulin | American Radiolabeled Chemicals Inc. | ARC0124A | 0.1 mCi/mL |
| EtOH | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-00461 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc | Tri-Carb 4810TR |
References
- Sakane, T., Yamashita, S., Yata, N., Sezaki, H. Transnasal delivery of 5-fluorouracil to the brain in the rat. Journal of Drug Targeting. 7 (3), 233-240 (1999).
- Illum, L. Transport of drugs from the nasal cavity to the central nervous system. European Journal of Pharmaceutical Science. 11 (1), 1-18 (2000).
- Hanson, L. R., Frey, W. H. 2nd Intranasal delivery bypasses the blood-brain barrier to target therapeutic agents to the central nervous system and treat neurodegenerative disease. BMC Neuroscience. 9 (Suppl 3), S5 (2008).
- Chapman, C. D., et al. Intranasal treatment of central nervous system dysfunction in humans. Pharmaceutical Research. 30 (10), 2475-2484 (2012).
- Kanazawa, T. Development of non-invasive drug delivery system to the brain for brain diseases therapy. Yakugaku-Zasshi. 138 (4), 443-450 (2018).
- Kozlovskaya, L., Abou-Kaoud, M., Stepensky, D. Quantitative analysis of drug delivery to the brain via nasal route. Journal of Controlled Release. 189, 133-140 (2014).
- Hirai, S., Yashiki, T., Matsuzawa, T., Mima, H. Absorption of drugs from the nasal mucosa of rat. International Journal of Pharmaceutics. 7 (4), 317-325 (1981).
- Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Advances in Drug Delivery Reviews. 64 (7), 614-628 (2011).
- Lalatsa, A., Schatzlein, A. G., Stepensky, D. Strategies to deliver peptide drugs to the brain. Molecular Pharmaceutics. 11 (4), 1081-1093 (2014).
- Kanazawa, T. Brain delivery of small interfering ribonucleic acid and drugs through intranasal administration with nano-sized polymer micelles. Medical Devices. 8, 57-64 (2015).
- Kanazawa, T., et al. Enhancement of nose-to-brain delivery of hydrophilic macromolecules with stearate- or polyethylene glycol-modified arginine-rich peptide. International Journal of Pharmacology. 530 (1-2), 195-200 (2017).
- Kamei, N., et al. Effect of an enhanced nose-to-brain delivery of insulin on mild and progressive memory loss in the senescence-accelerated mouse. Molecular Pharmaceutics. 14 (3), 916-927 (2017).
- Suzuki, T., Oshimi, M., Tomono, K., Hanano, M., Watanabe, J. Investigation of transport mechanism of pentazocine across the blood-brain barrier using the in situ rat brain perfusion technique. Journal of Pharmaceutical Science. 91 (11), 2346-2353 (2002).
