Summary
Qui, descriviamo due nuovi metodi di somministrazione intranasale stabile sotto anestesia inalazione con minimo sforzo fisico per gli animali da esperimento. Inoltre descriviamo un metodo per la valutazione quantitativa dei livelli di distribuzione di droga nel cervello attraverso la via naso--cervello utilizzando radiomarcato [14C]-inulina come substrato modello di macromolecole solubile in acqua.
Abstract
La somministrazione intranasale è stata segnalata per essere una potenziale via per la consegna di naso--cervello di agenti terapeutici che aggira la barriera emato - encefalica. Tuttavia, ci sono stati alcuni rapporti riguardanti non solo l'analisi quantitativa, ma anche di somministrazione ottimale e regimi per le indagini del naso--cervello consegna di dosaggio. I limitati progressi nella ricerca sui meccanismi di naso--cervello via utilizzando roditori rappresenta un ostacolo significativo in termini di progettazione di sistemi di consegna di naso--cervello per candidati farmaci.
Per guadagnare qualche progresso in questo senso, abbiamo sviluppato e valutato due nuovi metodi di somministrazione intranasale stabile sotto anestesia inalazione per animali da esperimento. Inoltre descriviamo un metodo per la valutazione dei livelli di distribuzione di droga nel cervello attraverso la via naso--cervello mediante radio-marcato [14C]-inulina (peso molecolare: 5.000) come substrato modello di macromolecole solubile in acqua.
Inizialmente, abbiamo sviluppato un protocollo di somministrazione intranasale basati su pipetta utilizzando maschere temporaneamente apribile, che ci ha permesso di eseguire l'amministrazione affidabile agli animali sotto anestesia stabile. Usando questo sistema, [14C]-inulina potrebbe essere consegnata al cervello con piccolo errore sperimentale.
Successivamente abbiamo sviluppato un protocollo di somministrazione intranasale che comportano l'incannulamento inversa dal lato della via aerea attraverso l'esofago, che è stato sviluppato per ridurre al minimo gli effetti della clearance mucociliare (MC). Questa tecnica ha portato a livelli elevati significativamente di [14C]-inulina, che è stato rilevato quantitativamente nel bulbo olfattivo, del cervello e del midollo allungato, rispetto al metodo della pipetta. Questo sembra essere perché la ritenzione della soluzione farmaco nella cavità nasale è stato sostanzialmente aumentato dalla somministrazione attivo utilizzando una pompa a siringa in direzione opposta la MC nella cavità nasale.
In conclusione, i due metodi di somministrazione intranasale sviluppato in questo studio possono essere dovrebbe essere tecniche estremamente utili per la valutazione farmacocinetica nei roditori. Il metodo di inserimento di una canula inversa, in particolare, potrebbe essere utile per valutare le potenzialità del naso--cervello consegna di candidati farmaci.
Introduction
Biomedicinali come peptidi, oligonucleotidi e anticorpi sono considerati di avere potenziale applicazione come nuovi agenti terapeutici per i disordini refrattari del sistema nervoso centrale che non hanno attualmente nessuna terapia curativa. Tuttavia, poiché la maggior parte biomedicinali sono macromolecole solubile in acqua, consegna dal sangue al cervello tramite la somministrazione endovenosa o orale è estremamente difficile a causa di impedenza della barriera sangue - cervello (BBB).
Negli ultimi anni, la somministrazione intranasale è stata segnalata per essere una potenziale via per la consegna di naso--cervello di agenti terapeutici che evita il BBB1,2,3,4,5. Tuttavia, ci sono stati relativamente pochi rapporti per quanto riguarda l'analisi quantitativa del naso--cervello via consegna6. Inoltre, non ci sono stati praticamente nessun rapporti sulle condizioni di amministrazione ottimale accertato e regimi di dosaggio, come il volume, volte, periodi di tempo e velocità, per le indagini del naso--cervello consegna. Le carenze di cui sopra sono riconducibili ai seguenti motivi: (i) un metodo ottimale di somministrazione intranasale per topi deve ancora essere stabilito, e (ii) intranasale amministrazione pipettando, che viene generalmente utilizzato, in genere è caratterizzata di variazione interindividuale tra animali a causa della clearance mucociliare (MC), causando quindi spesso sottovalutate le potenzialità di consegna effettiva del naso--cervello di un particolare farmaco.
Anestesia per inalazione utilizzando isoflurano (iniziazione: 4%, manutenzione: 2%) con un'inalazione maschera per roditori ha guadagnato uso molto diffuso, con lo scopo di ridurre o eliminare il dolore associato con la chirurgia eseguiti su animali da esperimento. L'uso di maschere rende relativamente semplice eseguire l'amministrazione tipica droga in animali da esperimento sotto anestesia inalazione attraverso le vie sottocutanee, intraperitoneale ed endovenose. Tuttavia, nel caso di somministrazione intranasale, la maschera deve essere temporaneamente rimossi dagli animali per la somministrazione del farmaco. Con manutenzione inferiore al 2% isoflurane, animali in genere risvegliano rapidamente dall'anestesia per inalazione. Quando il volume di amministrazione per ogni dose è grande, questo potrebbe causare la soluzione della droga a fluire dalla cavità nasale nell'esofago, e pertanto una singola grande dose potrebbe essere necessario essere suddiviso in più piccole dosi per la somministrazione intranasale di piccole animali. Come somministrazione intranasale rende necessaria la rimozione della maschera per somministrazione ripetuta e tempo sufficiente per la cavità nasale sostenuta consegna, c'è un'alta probabilità che topi sarebbero risvegliarsi dall'anestesia durante la procedura di somministrazione. Questo rende molto difficile effettuare la somministrazione intranasale sotto uno stabile stato anestetico e probabilmente contribuisce alla variazione interindividuale osservata del naso--cervello consegna fra i roditori.
In questo studio, abbiamo pertanto sviluppato due nuovi metodi di somministrazione intranasale stabile nell'ambito dell'anestesia per inalazione, che impongono il minimo sforzo fisico su animali da esperimento. Per il primo metodo, abbiamo usato una maschera temporaneamente apribile che consente la somministrazione intranasale durante l'anestesia per inalazione. La parte apribile della maschera incorpora un tappo di silicone che può essere utilizzato in conformità con la tempistica di somministrazione per facilitare la somministrazione intranasale stabile utilizzando una pipetta. Per il secondo metodo, una cannula è stata inserita chirurgicamente per passare dall'esofago nella cavità nasale, e una pompa a siringa quindi è stata fissata a questo modo che la soluzione della droga potrebbe essere consegnata direttamente e in modo affidabile nella cavità nasale sotto stabile inalazione anestesia. Questo metodo può migliorare la consegna di farmaci nel cervello per via naso--cervello, perché riducendo sostanzialmente gli effetti della MC, sarebbe migliorato droga rimanenza nella cavità nasale. In più, descriviamo un metodo per valutare quantitativamente i livelli di distribuzione di droga (% per il cervello di dose iniettata/g) nel cervello mediante radio-marcato [14C]-inulina [peso molecolare (MW): 5.000] come substrato modello di solubile in acqua macromolecole.
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Protocol
Questo studio sugli animali (#AP17P004) è stato eseguito in conformità con le linee guida approvate dal comitato di uso (Tokyo, Giappone) e Nihon University Animal Care. Questo studio (n. 17-0001) è stato approvato dal radioisotopo Center della scuola di farmacia, Università di Nihon.
1. gli animali utilizzati per la somministrazione intranasale in anestesia per inalazione
- Casa topi sperimentali in gabbie di acciaio sotto un ciclo luce/buio di 12 h (luce accesa 8:00 – 20:00), con una temperatura controllata e mantenuta a 23 ° c ± 1 ° C, umidità 50% ± 10%, e ad libitum accesso a cibo e acqua.
- Prima della sperimentazione, anestetizzare i topi tramite inalazione di 2% isoflurane, dopo l'inizio ad una concentrazione del 4%. Confermare il livello richiesto di amputate controllando per la scomparsa di raddrizzamento superficiale.
2. preparazione della soluzione di amministrazione
- Preparare una soluzione di amministrazione di [14C]-inulina (50 μM, μCi/mL 0,5 per topo) diluendo in tampone fosfato salino e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.
3. intranasale amministrazioni per topi
-
Metodo micropipetta utilizzando una maschera di inalazione temporaneamente apribile (Figura 1)
Nota: Questa tecnica è una modifica del protocollo di somministrazione intranasale utilizzando una micropipetta stabilita da Frey et al. 3- Difficoltà topi in posizione supina su una bacheca legando loro membra sotto anestesia inalazione con isoflurano 2% (Figura 1A).
- Amministrare un volume totale di soluzione di amministrazione 25 μL di ogni mouse a intervalli di 30 s, via le dosi di 1-2 μL in alternativa somministrati nelle narici destra e sinistra, mentre i topi sono fissati nell'ambito dell'anestesia per inalazione (Figura 1B e C).
- Nota: Rifiuti gas anestetico viene effettuato lo scavenging di mezzo attivo (fume hood, biosicurezza duro canalizzata mobile, vuoto, ecc.) quando viene aperta la maschera e di mezzi passivi (contenitore dei rifiuti gas anestetico) quando chiuso
-
Inserimento di una canula di invertire m etodo dal lato della via aerea tramite l'esofago (Figura 2)
Nota: Questa tecnica è una modifica del protocollo assorbimento intranasale per ratti stabilito da Hirai et al. 7- Difficoltà topi in posizione supina su una bacheca legando loro membra sotto anestesia inalazione con 2% isoflurane.
- Capelli del collo sono rasato e predisposto tramite applicazione clorexidina o betadine, seguito da un risciacquo di alcol.
- Esporre la trachea e l'esofago espandendo la pelle sotto la gola con forcipe dopo aver fatto una piccola incisione (1,5 cm) con le forbici.
- Fare un'incisione (1 mm) nella trachea con le forbici.
- Inserire una cannula (diametro interno: 0,58 mm, diametro esterno: 0,965 mm) per una lunghezza di 1,2 cm e collegare l'altra estremità della cannula all'interno della maschera di inalazione.
- Fare un'incisione (1 mm) nell'esofago utilizzando le forbici, inserire una cannula (diametro interno: 0,28 mm, diametro esterno: 0,61 mm) per una lunghezza di 1,4 cm verso la parte posteriore della cavità nasale e legare (Figura 2A e B).
Nota: Le procedure 3.2.2 a 3.2.4, sono state effettuate con un microscopio stereoscopico a ingrandimento × 10. - Fissare un ago (27 × 1/2) una siringa 1 mL riempita con una soluzione di amministrazione e connettersi a una pompa programmabile di micro-siringa.
- Collegare di sopra dell'ago cannula che era stata inserita nell'esofago a 3.2.5 (Figura 2).
- Amministrare un volume totale di 25 μL [14C]-soluzione di inulina ad un tasso costante (5 μL/min) (Figura 2 e 2D).
4. quantitativa esperimento utilizzando Radio-marcato macromolecole solubile in acqua ([14C]-inulina)
- Decapitare i topi sperimentali nell'ambito dell'anestesia e aprire loro crani, usando le forbici e dal lato del oblongata del midollo, mentre facendo attenzione a non danneggiare il cervello.
- Estrarre con attenzione l'intero cervello di scavare con una micro-spatola dal cranio.
- Posto un filtro di carta inumidito con soluzione salina su una piastra Petri che viene memorizzato sul ghiaccio.
- Posizionare i cervelli estratti sul filtro di carta inumidito.
- Pulire il sangue aderente alla superficie del cervello con un batuffolo di cotone inumidito con soluzione fisiologica per eliminare almeno l'influenza di [14C]-inulina nel sangue sulla superficie del cervello.
- Sezionare il cervello rapidamente e dividerli in tre parti: il bulbo olfattivo, cervello e midollo allungato (tra cui il pons).
- Posizionare campioni del cervello in solubilizzante di tessuto a 50 ° C per 1 h.
- Aggiungere 10 μL del cocktail di scintillazione liquida per i campioni di cervello.
- Trasferire un'aliquota di 25 μL della soluzione di amministrazione sciolta in scintillazione cocktail per un flaconcino di scintillazione per determinare la radioattività della soluzione applicata.
- Misurare le disintegrazioni al minuto [14C] radioattività nel campione del cervello ([14C] Xcervello) e la soluzione applicata ([14C] XIN dose) in un contatore a scintillazione liquido dotato di un adeguato correzione di crossover per 3H e 14C.
5. analisi dei dati
- Calcolare i livelli di distribuzione del farmaco (%) per la dose iniettata (ID %) utilizzando la seguente equazione:
Cervello di ⁄g % ID = ([14C] Xcervello/ [14C] Xdose) × 100,
dove Xcervello (cervello dpm/g) è la quantità di [14C] - inulina misurati nel tessuto cerebrale e XIN dose (dpm/25 μL di soluzione) è la concentrazione del [14C] - inulina nella soluzione usata per somministrazione intranasale.
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Representative Results
La figura 3 Mostra il [14C]-livelli di inulina (ID % ⁄g cervello) nel bulbo olfattivo (A), cervello (B) e oblongata del midollo (C) ottenute utilizzando i due tipi di somministrazione intranasale valutati nello studio presente. La somministrazione intranasale mediante la consegna di metodo attivato pipetta [14C]-inulina nel cervello utilizzando le maschere di inalazione apribile (Figura 1). Nell'ambito dell'anestesia per inalazione, i risultati quantitativi ha rivelato nessuna variazione interindividuale sperimentale tra gli animali esaminati, come indicato dall'errore standard basso. Quando il metodo di amministrazione cavità nasale esofagea cannula inverso è stato utilizzato per amministrare [14C] inulina - inulina sotto anestesia per inalazione (Figura 2), i livelli elevati significativamente di [14C] - sono stati osservati nel bulbo olfattivo ( Figura 3A), cervello (Figura 3B) e del oblongata del midollo (Figura 3), che con il metodo della pipetta. Inoltre, all'interno del cervello, più alto [14C]-sono stati rilevati livelli di inulina nel bulbo olfattivo e oblongata del midollo, che sono principalmente implicati nella via del naso--cervello, che nel cervello.
Figura 1: somministrazione intranasale utilizzando una micropipetta in combinazione con una maschera di inalazione temporaneamente apribile. Fotografie che mostrano un mouse fisso (A) con una maschera chiusa prima di amministrazione e (B) Close-up e (C) vista tutta la maschera aperta durante la somministrazione intranasale utilizzando una pipetta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: la somministrazione intranasale di inserimento di una canula inversa dal lato della via aerea tramite l'esofago utilizzando una pompa a siringa. Fotografie che mostrano l'area (A) chirurgica, (B) primo piano e (C) l'intero viste e (D) il sistema di un mouse fisso dopo due tipi di cannula erano stati inseriti nell'esofago e trachea e collegati ad una micro-siringa in una maschera di inalazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Confronto tra [14C]-livelli di inulina nel bulbo olfattivo (A), cervello (B) e oblongata del midollo (C) a seguito di due tipi di somministrazione intranasale. IN-A e IN-B indicano il metodo micropipetta (Figura 1) e il metodo di inserimento di una canula inversa (Figura 2) per somministrazione intranasale, rispettivamente. Utilizzando ogni metodo, un volume totale di 25 μL di [14C]-inulina (50 μM, 0,5 μCi/mL) è stato amministrato. Il tasso di amministrazione di IN-B era 5 μL/min. Ogni colonna rappresenta la media ± S.E. (n = 4). p < 0.01 (di Student t-test) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La consegna del naso--cervello di farmaci è prevista per avere un effetto pronunciato su disturbi del sistema nervoso centrale perché questa via rappresenta un percorso di trasporto diretto che bypassa la BBB. Tre differenti vie di naso--cervello sono state segnalate a data8. Il primo è la via del nervo olfattivo, che passa dal mucosa olfattivo nella mucosa nasale al proencefalo tramite il nervo olfattivo. La seconda è la via del nervo trigemino, che passa dalla mucosa respiratoria nella mucosa nasale al tronco cerebrale del hindbrain attraverso il nervo di trigeminal. La terza è la via di CSF, che è distribuita in tutto il cervello tramite il CSF. Via del naso--cervello ha attirato una notevole attenzione per quanto riguarda l'amministrazione delle macromolecole idrofile, che tendono ad essere ostacolato dalla barriera emato-encefalica e come un mezzo fornire biomedicinali al sistema nervoso centrale8, 9 , 10 , 11 , 12. Tuttavia, pochi studi precedenti sono chiaramente descritti metodi di somministrazione intranasale per piccoli animali al fine di verificare la fornitura dei farmaci candidati via la via naso--cervello. Di conseguenza, c'è stato molto lento progresso della ricerca relazionato ai meccanismi di consegna di naso--cervello droga utilizzando piccoli animali, che rappresenta un ostacolo significativo in termini di progettazione di sistemi di consegna di naso--cervello per candidati farmaci. Pertanto, in questo studio, abbiamo sviluppato due protocolli per somministrazione intranasale in anestesia per inalazione per indagare la distribuzione dei vari candidati farmaci, come ad esempio biomedicinali, destinati a malattie del sistema nervoso centrale. Abbiamo anche descritto un metodo che può essere utilizzato per la valutazione quantitativa.
Il metodo di somministrazione intranasale di pipetta utilizzando le maschere di inalazione temporaneamente apribile sviluppate in questo studio rende possibile eseguire l'amministrazione affidabile con gli animali in uno stato di anestesia stabile senza risveglio, come le maschere non è necessario essere rimosso (Figura 1). Utilizzando questa tecnica, abbiamo dimostrato la consegna di una macromolecola idrosolubile (inulina; MW: 5.000) al cervello. Come inulina non penetra la Bee, può essere utilizzato come indicatore dello spazio di volume intravascolare (circa 10-15 del cervello μL/g) nel cervello del ratto13. Abbiamo ottenuto eccellenti risultati quantitativi, con piccolo errore sperimentale. Il livello di [14C]-inulina nel cervello era chiaramente più alta dopo la somministrazione intranasale di dopo somministrazione endovenosa (dati non mostrati). Di conseguenza, abbiamo stabilito che questa tecnica rappresenta un approccio possibile per somministrazione intranasale che consente l'amministrazione convenzionale usando una pipetta, mentre i soggetti restano sotto anestesia per inalazione (Figura 2). L'anestesia per inalazione potrebbe interessare la membrana epiteliale nasale e, di conseguenza, aumentare la permeabilità attraverso l'epitelio nasale. Ulteriori studi sono richiesti per caratterizzare la consegna del cervello utilizzando il metodo di inserimento di una canula inversa sotto anestesia per inalazione, rispetto ai convenzionale anestesia come somministrazione intraperitoneale.
Abbiamo successivamente studiato amministrazione tramite inserimento di una canula inversa dal lato della via aerea attraverso l'esofago, che è stato sviluppato per ridurre al minimo gli effetti di MC. Nei ratti, metodo di Hirai richiede un intervento chirurgico per chiudere l'esofago e poi amministrare dall'ingresso al naso per ridurre al minimo l'effetto di MC. Nei topi, è fisicamente difficile eseguire l'inserimento di una canula dall'ingresso del naso, e la somministrazione intranasale può causare starnuti. Il nostro metodo di inserimento di una canula inversa si connette la cannula inserita direttamente nella cavità nasale dall'esofago ad una pompa di micro-siringa, che ha il vantaggio che è possibile chiudere l'esofago e delle vie respiratorie da ambulatorio e contemporaneamente eseguire intranasale amministrazione. Regolazione della pompa micro-siringa facilita l'amministrazione utilizzando volumi e tassi di dosaggio precisi. Utilizzando questa tecnica, abbiamo registrato i livelli elevati significativamente delle macromolecole idrofile amministrate nel bulbo olfattivo, cervello e del oblongata del midollo di topi che quando si utilizza il metodo pipetta (Figura 3). Questo sembra essere, perché con la somministrazione intranasale utilizzando una pipetta, la soluzione viene somministrata passivamente in conformità con respirazione spontanea, tale che la soluzione tende ad essere eliminato verso la trachea e l'esofago da MC. Al contrario, con l'amministrazione nella cavità nasale attraverso una cannula inversa esofagea, la soluzione viene somministrata attivamente utilizzando una pompa a siringa nella cavità nasale. Sembra che questo approccio aumenta notevolmente la ritenzione della soluzione farmaco nella cavità nasale, a livelli più elevati di distribuzione nel cervello. Inoltre, abbiamo rilevato i livelli elevati della soluzione somministrata nel bulbo olfattivo e oblongata del midollo, che sono principalmente implicati nella via del naso--cervello, che nel cervello. Di conseguenza, abbiamo dimostrato che l'amministrazione nella cavità nasale attraverso una cannula inversa esofagea è un metodo praticabile per valutare appieno il potenziale della consegna del naso--cervello di candidati farmaci.
In conclusione, i due metodi di somministrazione intranasale che abbiamo sviluppato in questo studio possono essere dovrebbe essere tecniche estremamente utili per la valutazione farmacocinetica nei piccoli animali via la via naso--cervello.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato finanziato in parte dal privato University Research Branding Project dal MEXT; una sovvenzione per scientifico Research (C) (17 K 08249 [di TK e T.S.]) della Japan Society per la promozione della scienza (JSPS); una sovvenzione per la ricerca cooperativa dalla Fondazione per l'avanzamento di biochimica [a T.S.] e la Fondazione di scienza di Takeda Hamaguchi [a T.K.]. Ringraziamo il signor Yuya Nito e MS. Akiko Asami per loro assistenza tecnica preziosa nel condurre gli esperimenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ddY mouse | Japan SLC, Inc. | Male, 4-6 weeks, 20-30 g | |
| Isoflurane | Pfizer | v002139 | |
| Isoflurane setup | SHINANO manufacturing CO. LTD. | SN-487-OTAir, SN-489-4 | |
| Isoflurane mask | SHINANO manufacturing CO. LTD. | For small rodents | |
| Isoflurane mask (openable type) | SHINANO manufacturing CO. LTD. | Special orders | |
| Anesthesia Box | SHINANO manufacturing CO. LTD. | SN-487-85-02 | |
| Animal experiments scissors-1 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | B-27H | |
| Animal experiments scissors-2 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | B-13H | |
| Tweezers-1 | FINE SCIENCE TOOLS Inc. | 11272-30 | Dumont #7 Dumoxel |
| Tweezers-2 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | A-12-1 | |
| Cannula tube (PE-50) | Becton, Dickinson and Company. | 5069773 | I.D.: 0.58 mm, O.D.: 0.965 mm |
| Cannula tube (SP-10) | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | KN-392 | I.D.: 0.28 mm, O.D.: 0.61 mm |
| Shaver | MARUKAN, LTD. | DC-381 | |
| Stereoscopic microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
| Needle 27G 1/2 in 13 mm | TERUMO CORPORATION | NN-2738R | |
| 1 mL syringe | TERUMO CORPORATION | SS-01T | |
| Syringe pump | Neuro science | NE-1000 | |
| Cellulose membrane | Toyo Roshi Kaisya, Ltd. | 00011090 | |
| Micro spatula | Shimizu Akira Inc. | 91-0088 | |
| Micropipette (0.5-10 uL) | Eppendorf AG | Z368083 | |
| Pipette chip | Eppendorf AG | 0030 000.811 | |
| Tape | TimeMed Labeling System, Inc. | T-534-R | For fixing mouse |
| [14C]-Inulin | American Radiolabeled Chemicals Inc. | ARC0124A | 0.1 mCi/mL |
| EtOH | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-00461 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc | Tri-Carb 4810TR |
References
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