Summary
在这里, 我们描述了两种新的方法稳定鼻内给药吸入麻醉与最小的物理压力实验动物。我们还描述了一种方法, 定量评估药物分布水平的药物分布水平通过鼻对大脑的途径使用放射性色标 [14c]-伊努林作为水溶性大分子的模型底物。
Abstract
据报道, 鼻内给药是一种潜在的途径, 为鼻脑注射治疗药物, 规避血脑屏障。然而, 关于鼻对脑分娩调查的定量分析, 以及最佳给药条件和剂量方案的报告很少。使用啮齿类动物的鼻脑转路机制的研究进展有限, 这在设计候选药物的鼻对脑运载系统方面构成了重大障碍。
为了在这方面取得一定的进展, 我们开发并评价了两种新的方法, 稳定鼻内给药的吸入麻醉下的实验动物。我们还描述了一种方法, 评估药物分布水平的鼻子到大脑的途径使用无线电标记 [14c]-伊努林 (分子量: 5, 000) 作为水溶性大分子的模型底物。
最初, 我们开发了一种基于管道的鼻内给药协议, 使用临时启用面罩, 使我们能够在稳定的麻醉下对动物进行可靠的给药。使用这个系统, [14c]-伊努林可以传递到大脑, 几乎没有实验误差。
我们随后开发了一个鼻内给药程序, 该方案通过食道从气道侧反向插管, 旨在最大限度地减少黏膜胆道清除 (mc) 的影响。这项技术导致了明显高于移液器法的 [14c]-伊努林, 这是定量检测到的嗅觉灯泡, 大脑, 和延髓。这似乎是因为药物溶液在鼻腔的保留是通过主动给药使用注射器泵在相反的方向进入鼻腔的。
总之, 本研究中开发的两种鼻内给药方法可作为评价啮齿类动物药代动力学的非常有用的技术。特别是反向插管方法, 可以帮助评估药物候选药物从鼻子到大脑分娩的全部潜力。
Introduction
肽、寡核苷酸和抗体等生物类药物被认为具有潜在的应用, 可作为治疗难治性中枢神经系统疾病的新药物, 而这些疾病目前尚无治疗。然而, 由于大多数生物药物都是水溶性大分子, 由于血脑屏障 (bbb) 的阻抗, 通过静脉注射或口服方式将血液输送到大脑是极其困难的。
近年来, 鼻内给药已被报道为一种潜在的途径, 鼻子对大脑的治疗药物, 避免 bbb1,2,3, 4,5.然而, 关于鼻对脑通路传递的定量分析的报告相对较少6。此外, 几乎没有关于已确定的最佳管理条件和剂量方案的报告, 如体积、时间、时间段和速度, 用于调查鼻子对大脑的分娩。上述缺陷可归因于以下原因: (一) 尚未确定小鼠鼻内给药的最佳方法, (二) 通常使用的移液器进行鼻内给药的特点是由于粘液胆道清除 (mc), 动物之间的个体间变异, 从而往往导致对特定药物的实际鼻到脑传递潜力的低估。
使用异氟醚的吸入麻醉 (启动: 4%, 保养: 2%), 用于啮齿类动物的吸入面罩已得到广泛使用, 目的是减少或消除与实验动物手术相关的疼痛。使用面膜使其在吸入麻醉下通过皮下、腹腔和静脉途径进行典型的药物给药变得相对简单。然而, 在鼻内给药的情况下, 需要暂时从动物身上摘下面膜, 以便给药。由于维持不到2% 异氟醚, 动物通常会从吸入麻醉中迅速醒来。当每剂量给药量较大时, 这可能会导致药物溶液从鼻腔流入食道, 因此, 单剂量大剂量可能需要分解成多个较小的剂量, 以便在鼻腔给药到小剂量动物。由于鼻腔内给药需要反复给药面膜和足够的时间持续鼻腔分娩, 因此很有可能小鼠在给药过程中从麻醉中醒来。这使得在稳定的麻醉状态下进行鼻内给药变得非常困难, 并可能有助于观察到啮齿类动物之间鼻子间给产的个体间变异。
在这项研究中, 我们开发了两种新的方法稳定鼻内给药吸入麻醉, 这给实验动物施加最小的身体压力。对于第一种方法, 我们使用了一个暂时选择的面膜, 使吸入麻醉期间鼻内给药。面罩的可选择部分采用硅胶插头, 可根据管理时间使用, 以方便使用移液器进行稳定的鼻内管理。对于第二种方法, 手术插入插管, 从食道进入鼻腔, 然后将注射器泵连接到鼻腔, 以便在稳定的吸入下, 药物溶液能够直接可靠地输送到鼻腔麻醉。这种方法可以通过鼻对脑的途径加强药物进入大脑的传递, 因为通过极大地减少 mc 的影响, 鼻腔内的药物将得到进一步改善。此外, 我们还描述了一种用无线电标记的 [14c]-伊努林 [分子量 (mw): 5, 000] 作为水溶性模型底物定量评估大脑中药物分布水平 (注射剂量大脑的%) 的方法。大分子。
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Protocol
这项动物研究 (#AP17P004) 是根据日本大学动物护理和使用委员会 (日本东京) 批准的准则进行的。这项研究 (#17-0001) 得到了日本大学药学院放射性同位素中心的批准。
1. 吸入麻醉下鼻内管理用动物
- 将实验小鼠置于12小时的光/暗色循环 (8:00 pm 的光) 下, 可控温度保持在 23±1°C, 湿度为50% ±10%, 并可获得食物和水。
- 在实验之前, 麻醉小鼠通过吸入2% 异氟醚, 在4% 的浓度下开始。通过检查表面矫正的消失, 确定麻醉的必要程度。
2. 管理解决方案的准备
- 通过在磷酸盐缓冲盐水中稀释, 准备 [14c]-伊努林 (50μm, 0.5μciml) 的给药溶液, 并在4°c 下储存, 直至使用。
3. 鼠标内部管理
-
使用临时可选择吸入面罩的微移液器方法 (图 1)
注: 此技术是使用 frey 等人建立的微移液器对鼻内管理协议的修改.3 个- 用2% 异氟醚在吸入麻醉下将仰角小鼠的四肢贴在软木塞上 (图 1a)。
- 每只小鼠每隔30秒给出25μl 给药解决方案, 通过1至2微米剂量, 在小鼠吸入麻醉下固定在左、右鼻孔中交替给药 (图 1 b和c)。
- 注: 当面罩打开时, 用主动手段 (烟罩、硬质生物安全柜、真空等) 清除废物麻醉气体, 关闭时采用被动方式 (废物麻醉气体罐) 进行清除
-
反向插管米从气道侧通过食道的乙酯 (图 2)
注: 该技术是对 hirai 等人建立的大鼠鼻内吸收协议的修改.7.- 用2% 的异氟醚在吸入麻醉下将仰角小鼠的四肢贴在软木塞上。
- 颈部的头发被剃光, 并通过 betadine 或氯己定的应用进行准备, 然后进行酒精冲洗。
- 用剪刀做一个小切口 (1.5 厘米) 后, 用钳子将喉咙下方的皮肤展开, 从而暴露气管和食道。
- 用剪刀在气管上做一个切口 (1 毫米)。
- 将插管 (内径: 0.58 毫米, 外径: 0.965 毫米) 插入1.2 厘米, 并将插管的另一端连接到吸入面罩的内部。
- 用剪刀在食道上做一个切口 (1 毫米), 将插管 (内径: 0.28 毫米, 外径: 0.28 毫米) 插入1.4 厘米的长度, 并将其结扎 (图 2a和b)。
注: 在 x10 放大倍率的立体显微镜下进行了 3.2.2 3.2.4 的程序。 - 将针头 (27gx半) 连接到装有管理解决方案的1-ml 注射器上, 并连接到可编程的微型注射器泵。
- 连接到 3.2.5 (图 2c) 中插入食道的插管。
- 以恒定速率 (5μl/min)管理 25μl [14c]-伊努林溶液 (图2c 和 2d)。
4. 使用放射性标记的水溶性大分子 ([14c]-伊努林)进行定量实验
- 麻醉下将实验小鼠斩首, 用剪刀和延髓侧打开它们的头颅, 同时注意不要损伤大脑。
- 用颅骨上的微铲子把整个大脑都仔细提取出来。
- 将被盐水浸湿的滤纸放在储存在冰上的培养皿上。
- 将提取的大脑放在潮湿的滤纸上。
- 用用盐水润湿的棉签擦拭粘附在大脑表面的血液, 至少消除 [14°c]-伊努林在大脑表面血液中的影响。
- 快速解剖大脑, 并将其分为三个部分: 嗅球、大脑和延髓 (包括 pons)。
- 将脑液样品置于50°c 的组织溶解剂中1小时。
- 在大脑样本中加入10μl 的液体闪烁鸡尾酒。
- 将溶解在闪烁鸡尾酒中的溶液的 25μl aliquot 转移到闪烁小瓶中, 以确定所应用溶液的放射性。
- 测量大脑样本 ([14c] x脑) 和应用溶液 ([14c] xin 剂量) 中每分钟的分解率, 并配备适当的液体闪烁计数器3h 和14c 的交叉校正。
5. 数据分析
- 使用以下公式计算注射剂量 (id%) 的药物分布水平 (%):
id%/g 大脑 = ([14c] x大脑/[14c] x在剂量) x100,
其中x 脑(dpmw 大脑) 是在脑组织中测量的 [14c]-伊努林的量, xin剂量 (dpms25μl 溶液) 是用于鼻内给药的溶液中 [14c]-伊努林的浓度。
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Representative Results
图 3显示了使用本研究中评估的两种鼻内给药获得的嗅球 (a)、大脑 (b) 和延髓 (c) 中的 [14c]-伊努林水平 (id%/g 脑)。使用移液器法的鼻内给药使 [14c]-伊努林能够使用可接受的吸入面罩输送到大脑 (图 1)。在吸入麻醉下, 定量结果显示, 无论是在被检查的动物之间没有实验性的差异, 这表明低标准误差。当食管反向插管鼻腔给药法在吸入麻醉下给药 [14c]-菊酯时 (图 2), 嗅球中观察到的 [14c]-菊酯含量显著高于水平 (14c]-菊酯素 (图 3a)、大脑 (图 3A) 和延髓 (图 3A), 比移液器法。此外, 在大脑中, 在嗅觉球和延髓中检测到的 [14c]-伊努林水平比大脑中更高的 [14c]-伊努林水平, 它们在鼻对脑的路径中明显参与。
图 1: 使用微移液器与临时选择吸入面罩一起进行鼻内给药.照片显示固定鼠标 (a) 在给药前带有封闭的面罩, (b) 特写镜头和 (c) 使用移液器进行鼻内给药时打开的面罩的全部视图。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 使用注射器泵从气道侧通过食道进行鼻内插管.照片显示 (a) 手术区域、(b) 特写镜头和 (c) 整个视图, 以及 (d) 固定小鼠在将两种插管插入食道和气管并连接到吸入面罩中的微注射器后的方案。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 两种类型的鼻内给药后, 嗅球 (a)、大脑 (b) 和延髓 (c) 中 [14c]-伊努林水平的比较。in-a 和 in-b 分别表示用于鼻内给药的微移液器法 (图 1) 和反向插管法 (图 2)。每种方法, 总体积为 25μl [14c]-伊努林 (50μm, 0.5μci/ml)。in-b 的给药率为 5μlp. min。每列表示平均值± s. e. (n = 4)。** p & lt; 0.01 (学生 t -测试)请点击这里查看此图的更大版本.
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Discussion
药物的鼻子到大脑的传递预计将对中枢神经系统紊乱产生明显的影响, 因为这种途径代表了绕过 bbb 的直接运输路线。迄今为止, 已报告了三种不同的鼻子到大脑的路径.首先是嗅觉神经通路, 它通过嗅觉神经从鼻黏膜的嗅觉黏膜传递到前脑。第二是三叉神经通路, 它通过三叉神经从鼻黏膜的呼吸黏膜传递到后脑的脑干。第三是脑脊液通路, 它通过脑脊液分布在整个大脑中。鼻对大脑的途径在亲水大分子的管理方面引起了相当大的关注, 而亲水大分子往往受到 bbb的阻碍, 并作为向中枢神经系统提供生物祝福的一种手段89,10,11,12. 然而, 以前的研究很少明确说明小动物的鼻内给药方法, 以核实通过鼻对大脑途径提供候选药物的情况。因此, 与使用小动物的鼻子对大脑药物输送机制有关的研究进展非常缓慢, 这在设计候选药物的鼻对脑药物输送系统方面构成重大障碍。因此, 在本研究中, 我们开发了两个方案鼻内给药吸入麻醉, 以调查各种候选药物, 如生物法令, 以中心神经系统疾病的分布。我们还描述了一种可用于定量评价的方法。
本研究开发的移液器鼻内给药的方法是使用暂时可接受的吸入面罩, 因此可以在不觉醒的情况下, 在不觉醒的情况下, 对处于稳定麻醉状态的动物进行可靠的给药。(图 1)。利用这种技术, 我们证明了水溶性大分子 (菊粉;mw: 5, 000) 到大脑。由于菊粉不会穿透 bbb, 因此它可以作为大鼠大脑13中血管内体积空间 (约10-15μll 脑) 的标记.我们在实验误差较小的情况下获得了较好的定量结果。[14c]-伊努林在鼻内给药后明显高于静脉给药后 (数据未显示)。因此, 我们确定, 这种技术是一种可行的方法, 鼻内给药, 使常规给药使用移液器, 而对象保持吸入麻醉 (图 2)。吸入麻醉可能会影响鼻腔上皮膜, 从而增加通过鼻腔上皮的通透性。与常规麻醉 (如腹腔给药) 相比, 需要进一步研究, 以确定吸入麻醉下反向插管法对脑分娩的特征。
随后, 我们通过气道侧通过食道的反向插管进行了研究, 食道的开发是为了最大限度地减少 mc 的影响。在大鼠中, 平井的方法需要手术关闭食道, 然后从入口到鼻子进行管理, 以尽量减少 mc 效应。在老鼠身上, 从鼻子入口进行插管在身体上是很困难的, 鼻内给药可能会导致打喷嚏。我们的反向插管方法将直接插入鼻腔的插管从食道连接到微注射器泵, 其优点是可以通过手术关闭食道和气道, 同时进行鼻腔内手术管理。微型注射器泵的调整便于使用精确的定量速率和体积进行管理。使用这项技术, 我们记录了明显高于使用移液器的方法, 在小鼠的嗅球, 大脑和髓质中给药亲水大分子的水平 (图 3)。这似乎是因为使用移液器进行鼻内给药, 溶液是根据自发呼吸被动给药的, 因此 mc 往往会消除对气管和食道的溶液。相反, 通过食管反插管给鼻腔的药物, 使用注射器泵积极地将溶液输送到鼻腔。看来, 这种方法大大增加了药物溶液在鼻腔的保留, 导致大脑中的分布水平较高。此外, 我们在嗅球和延髓中检测到的给药溶液水平更高, 它们在鼻脑通道中的作用明显, 而在大脑中也有更高的水平。因此, 我们证明, 通过食管反向插管给鼻腔是一种可行的方法, 用于评估药物候选药物的全部潜力。
总之, 我们在本研究中开发的两种鼻内给药方法可以预期是非常有用的技术, 可以通过鼻对脑途径来评估小动物的药代动力学。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了 mext 私立大学研究品牌项目的部分支持;a 日本科学促进会的科学研究补助金 (c) (17k08249 [至 t. k. 和 t. s.]]);hamaguchi 生物化学促进基金会 (tas.) 和武田科学基金会 [给 t. k.) 合作研究赠款。我们感谢 yuya nito 先生和 akiko asami 女士在进行实验方面提供的宝贵技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ddY mouse | Japan SLC, Inc. | Male, 4-6 weeks, 20-30 g | |
| Isoflurane | Pfizer | v002139 | |
| Isoflurane setup | SHINANO manufacturing CO. LTD. | SN-487-OTAir, SN-489-4 | |
| Isoflurane mask | SHINANO manufacturing CO. LTD. | For small rodents | |
| Isoflurane mask (openable type) | SHINANO manufacturing CO. LTD. | Special orders | |
| Anesthesia Box | SHINANO manufacturing CO. LTD. | SN-487-85-02 | |
| Animal experiments scissors-1 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | B-27H | |
| Animal experiments scissors-2 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | B-13H | |
| Tweezers-1 | FINE SCIENCE TOOLS Inc. | 11272-30 | Dumont #7 Dumoxel |
| Tweezers-2 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | A-12-1 | |
| Cannula tube (PE-50) | Becton, Dickinson and Company. | 5069773 | I.D.: 0.58 mm, O.D.: 0.965 mm |
| Cannula tube (SP-10) | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | KN-392 | I.D.: 0.28 mm, O.D.: 0.61 mm |
| Shaver | MARUKAN, LTD. | DC-381 | |
| Stereoscopic microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
| Needle 27G 1/2 in 13 mm | TERUMO CORPORATION | NN-2738R | |
| 1 mL syringe | TERUMO CORPORATION | SS-01T | |
| Syringe pump | Neuro science | NE-1000 | |
| Cellulose membrane | Toyo Roshi Kaisya, Ltd. | 00011090 | |
| Micro spatula | Shimizu Akira Inc. | 91-0088 | |
| Micropipette (0.5-10 uL) | Eppendorf AG | Z368083 | |
| Pipette chip | Eppendorf AG | 0030 000.811 | |
| Tape | TimeMed Labeling System, Inc. | T-534-R | For fixing mouse |
| [14C]-Inulin | American Radiolabeled Chemicals Inc. | ARC0124A | 0.1 mCi/mL |
| EtOH | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-00461 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc | Tri-Carb 4810TR |
References
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