Summary
Здесь мы описываем два романа методы стабильных интраназального введения при ингаляционной анестезии с минимальной физической нагрузки для подопытных животных. Мы также описывают метод количественной оценки уровней распространения наркотиков в мозг через нос к мозг путь, используя radiolabeled [14C]-инулина как модель субстрат водорастворимый макромолекул.
Abstract
Чтобы быть потенциальные пути для доставки нос к мозг терапевтических агентов, который обходит blood - brain барьер сообщалось интраназального введения. Однако были несколько сообщений, касающихся не только количественный анализ, но и условия оптимального управления и дозировки схемы для расследования нос к мозг доставки. Ограниченный прогресс в исследованиях по нос к мозг путь механизмы, с помощью грызунов представляет собой значительное препятствие с точки зрения разработки систем доставки нос к мозг для кандидата наркотиков.
Чтобы получить некоторый прогресс в этом отношении, мы разработали и оцениваются два новых методов стабильных интраназального введения при ингаляционной анестезии для подопытных животных. Мы также описывают метод для оценки уровней распространения наркотиков в мозг через нос к мозг пути, с помощью радио меченых [14C]-инулин (молекулярный вес: 5000) как модель субстрат водорастворимый макромолекул.
Первоначально мы разработали на основе пипеткой интраназального введения протокол с использованием временно неповрежденный масок, которые позволяют нам выполнять надежный администрации животных стабильной анестезию. С помощью этой системы, [14C]-инулина может быть доставлено в мозг с маленькой экспериментальной ошибки.
Впоследствии мы разработали протокол интраназального введения, влекущие за собой обратный катетеризации со стороны дыхательных путей через пищевод, который был разработан, чтобы свести к минимуму последствия мукоцилиарный клиренс (MC). Эта техника привела к значительно более высокие уровни [14C]-инулин, который количественно был обнаружен в обонятельные луковицы, головного мозга и продолговатого мозга, чем метод пипеткой. Это, как представляется, быть потому что удержания раствора препарата в носовой полости был существенно увеличен администрацией активно, с помощью насоса шприца в направлении, противоположном направлению MC в полость носа.
В заключение можно ожидать, что два метода интраназального введения, разработанных в этом исследовании будет чрезвычайно полезным методы оценки фармакокинетики грызунов. Метод обратного катетеризации, в частности, может быть полезным для оценки в полной мере потенциал нос к мозг доставки наркотиков кандидатов.
Introduction
Biomedicines пептиды, олигонуклеотиды и антитела считаются потенциальное применение как роман терапевтических агентов для расстройств огнеупорных центральной нервной системы, которые в настоящее время имеют не лечебной терапии. Однако потому что большинство biomedicines водорастворимый макромолекул, Доставка из крови в мозг через внутривенное или устные чрезвычайно затруднено из-за сопротивления гематоэнцефалический барьер (ГЭБ).
В последние годы чтобы быть потенциальные пути для доставки нос к мозг терапевтических агентов, избегает BBB1,2,3,,45сообщалось интраназального введения. Однако были сравнительно мало сообщений о количественного анализа нос к мозг путь доставки6. Кроме того, там были практически никаких сообщений об установленных администрацией оптимальные условия и дозирования схем, таких как объем, время, периоды времени и скорость, для расследования нос к мозг доставки. Вышеупомянутые недостатки можно объяснить следующими причинами: (i оптимальный метод интраназального введения для мышей еще не будет создан, и (ii) интраназального введения, дозирование, который обычно используется, обычно характеризуется изменением межличностных среди животных вследствие мукоцилиарный клиренс (MC), тем самым часто приводит к недооценкам фактической доставки нос к мозг потенциал конкретного препарата.
Ингаляционная анестезия с помощью изофлюрановая (начало: 4%, содержание: 2%) с ингаляцией маска для грызунов получил широкое применение, с целью сокращения или устранения боли, связанные с операции выполняются на экспериментальных животных. Использование масок делает его относительно простой для выполнения типичных медикаментов в подопытных животных при ингаляционной анестезии по маршрутам, подкожно, внутрибрюшинного и внутривенно. Однако в случае интраназального введения, маски необходимо временно удалить от животных для медикаментов. С содержанием менее 2% изофлюрановая, животные обычно пробудить быстро от ингаляционной анестезии. При большой объем администрации за дозу, это может привести к наркотиков решение поступать из носовой полости в пищевод, и поэтому один большой дозы может потребоваться быть разбита на несколько меньших дозах для интраназального введения малых животных. Как интраназального введения требует удаления маски для повторных администрации и достаточного времени для доставки устойчивого носовой полости, существует высокая вероятность того, что мышь будет пробудить от анестезии во время процедуры администрирования. Это делает его очень трудно выполнить интраназального введения под стабильное состояние анестезии и вероятно способствует наблюдаемых межличностных вариации нос к мозг доставки среди грызунов.
В этом исследовании мы разработали два новых методов стабильных интраназального введения при ингаляционной анестезии, устанавливающих минимальный физический стресс на подопытных животных. Для первого метода мы использовали временно неповрежденный маску, которая позволяет интраназального введения при ингаляционной анестезии. Открывающиеся часть маски включает силиконовыми колпачками, которые могут использоваться в соответствии с администрации сроках для содействия стабильной интраназального введения, с помощью пипетки. Для второго метода канюли хирургически был вставлен пройти из пищевода в полость носа, и шприцевый насос был затем прикрепляется к этому так, чтобы раствор препарата может быть непосредственно и надежно доставлено в полость носа при стабильным ингаляции обезболивание. Этот метод может увеличить поставки наркотиков в мозг через нос к мозг, потому что путем существенно минимизации последствий MC, можно было бы улучшить препарата retentively в носовой полости. Кроме того, мы описываем метод количественной оценки уровни распространения наркотиков (% для мозга вводят дозу/g) в головном мозге, с помощью радио меченых [14C]-инулин [молекулярный вес (МВт): 5000] как модель субстрат водорастворимые макромолекул.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это животное исследование (#AP17P004) была выполнена в соответствии с руководящими принципами, утвержденными Нихон университет животное уход и использование Комитетом (Токио, Япония). Это исследование (#17-0001) был одобрен радиоизотопные центр школа фармакологии Университета Нихон.
1. животных, используемых для интраназального введения при ингаляционной анестезии
- Дом экспериментальной мышей в клетках из нержавеющей стали под свет/темно цикла 12-h (свет на 8:00 – 8:00 вечера), с контролируемой температурой на уровне 23 ° c ± 1° C, влажность 50% ± 10%, и ad libitum доступа к продовольствию и воде.
- До экспериментов анестезировать мышей через вдыхание 2% изофлюрановая, следующее посвящение в 4% концентрации. Подтвердите требуемый уровень анестезии, установив за исчезновение выравнивание поверхности.
2. Подготовка решения администрации
- Подготовить решение администрации [14C]-инулин (50 мкм, 0.5 мкКи/мл на мышь) путем разбавления в фосфат амортизированное saline и хранить при 4 ° C до использования.
3. интраназального администраций для мышей
-
Микропипеткой метод с использованием временно неповрежденный вдыхании маски (Рисунок 1)
Примечание: Этот метод является модификацией интраназального введения протокола с помощью микропипеткой, установленные Фрей и др. 3- Исправьте мышей в лежачем положении на пробковой доске, лентой их конечностей при ингаляционной анестезии с 2% изофлюрановая (рис. 1A).
- Администрировать общий объем 25 мкл администрации решения для каждой мыши интервалы 30-s, через 1-2 мкл доз в качестве альтернативы в левой и правой ноздри в то время как мыши фиксируются при ингаляционной анестезии (рис. 1B и C).
- Примечание: Отходы анестезирующий газ продуваемых активных средствами (вытяжной капюшоном, кабинет-канальные биобезопасности, вакуум и т.д.) при открытии маски и пассивных средств (отходов анестезирующий газ канистра) при закрытии
-
Обратный катетеризации m ethod со стороны дыхательных путей через пищевод (Рисунок 2)
Примечание: Этот метод является модификацией интраназального поглощения протокола для крыс, учрежденной Хираи et al. 7- Исправьте мышей в лежачем положении на пробковой доске, лентой их конечностей при ингаляционной анестезии с 2% изофлюрановая.
- Волосы на шее побрился и нацелен через Бетадин или хлоргексидином приложения, после чего сполосните алкоголя.
- Разоблачить трахеи и пищевода, развернув кожи ниже горла с щипцами после внесения небольшой разрез (1,5 см) с ножницами.
- Сделайте надрез (1 мм) в трахею, используя ножницы.
- Вставьте канюлю (внутренний диаметр: 0,58 мм, внешний диаметр: 0.965 мм) длиной 1,2 см и подключите противоположный конец канюли внутри вдыхании маски.
- Сделать надрез (1 мм) в пищевод, используя ножницы, Вставьте канюлю (внутренний диаметр: 0,28 мм, внешний диаметр: 0,61 мм) длиной 1,4 см к задней части носовой полости и перевязать его (рис. 2A и B).
Примечание: Процедуры 3.2.2 для 3.2.4 проводились под стереоскопическим микроскопом на увеличение × 10. - Прикрепить иглы (27 g × 1/2) в 1-мл шприц, заполнены с решением администрации и подключитесь к программируемым микро шприцевой насос.
- Подключение выше иглы канюля, вставленный в пищевод в 3.2.5 (рис. 2 c).
- Администрировать общий объем 25 мкл [14C]-раствор инулина с постоянной скоростью (5 мкл/мин) (рис. 2 c и 2D).
4. количественный эксперимент с использованием радио меченых водорастворимый макромолекул ([14C]-инулин)
- Обезглавить экспериментальной мышей под наркозом и открыть их черепа, используя ножницы и со стороны продолговатого мозга, при этом стараясь не повредить мозги.
- Экстракт тщательно весь мозг, черпая с помощью микро шпатель из черепной коробки.
- Место фильтровальной бумаги, смоченной физиологический раствор на чашку Петри, которая хранится на льду.
- Место мозги, извлеченный на смоченную фильтровальной бумаги.
- Вытереть кровь, придерживаясь поверхности головного мозга с ватным тампоном, смоченным с физиологическим раствором, чтобы по крайней мере устранить влияние [14C]-инулина в крови на поверхности мозга.
- Рассечь мозги быстро и разделить их на три части: обонятельные луковицы, головного мозга и продолговатого мозга (включая Понс).
- Поместите образцы мозга в Солюбилизатор ткани при 50 ° C за 1 ч.
- Добавьте 10 мкл ЖС коктейль образцов мозга.
- Передача 25 мкл Алиготе решения администрации, растворенных в сцинтилляционные коктейль сцинтилляционные флакон для определения радиоактивности прикладного решения.
- Измерить распады в минуту [14C] радиоактивность в образце мозга ([14C] Xмозга) и прикладное решение ([14C] Xв дозе) в жидких сцинтилляционный счетчик с соответствующей кроссовер коррекции для 3H и 14C.
5. анализ данных
- Вычислите наркотиков распределения уровней (%) вводят дозы (ID %) с помощью следующего уравнения:
Мозг ⁄g % ID = ([14C] Xмозга/ [14C] Xв дозе) × 100,
где Xмозга (dpm/g мозга) — это количество [14C] - инулин измеряется в ткани мозга и Xв дозе (dpm/25 мкл раствора) – концентрация [14C] - инулина в раствор для интраназального введения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 3 показывает [14C]-инулин уровни (ID % ⁄g мозга) в обонятельные луковицы (A), головной мозг (B) и продолговатого мозга (C) полученных с помощью двух типов интраназального введения, оценены в настоящем исследовании. Интраназального введения с помощью пипетки включен метод доставки [14C]-инулина в мозг, используя открывающиеся вдыхании маски (рис. 1). При ингаляционной анестезии количественные результаты показали без экспериментальных межличностных вариации среди обследованных животных, как указано в низкой стандартной ошибки. Когда пищевода обратный канюля носовой полости администрации метод был использован для администрирования [14C] - инулин при ингаляционной анестезии (рис. 2), значительно более высокие уровни [14C] - инулин были замечены в обонятельные луковицы ( Рисунок 3А), головной мозг (рис. 3B) и продолговатого мозга (рис. 3 c), чем с помощью метода пипеткой. Кроме того, в головном мозге, выше [14C]-инулин уровни были обнаружены в обонятельные луковицы и продолговатого мозга, которые широко участвуют в нос к мозг пути, чем в головном мозге.
Рисунок 1: интраназального введения с помощью микропипеткой в сочетании с маской временно неповрежденный ингаляции. Фотографии, показывающие фиксированной мыши (A) с закрытой маски до администрации и (B) макро и (C) всего просмотров открыт маски во время интраназального введения с помощью пипетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: интраназального введения путем обратного катетеризации со стороны дыхательных путей через пищевод, с помощью насоса шприца. Фотографии (A) хирургические области, (B) макро и (C) всего просмотров и (D) схема фиксированной мыши после двух видов канюля были вставлены в трахеи и пищевода и подключен к микро шприц в маске ингаляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Сравнение [14C]-инулин уровни в обонятельные луковицы (A), головной мозг (B) и продолговатого мозга (C) после двух видов интраназального введения. IN-A и B в указывают микропипеткой метод (рис. 1) и обратный катетеризации метод (рис. 2) для интраназального введения, соответственно. Использование каждого метода, суммарный объем 25 мкл [14C]-вводили инулин (50 мкм, 0,5 мкКи/мл). Администрация в-B составлял 5 мкл/мин. Каждый столбец представляет среднее ± с.е. (n = 4). p < 0.01 (Студенческая t-тест) пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ожидается, что нос к мозг доставки наркотиков имеют выраженный эффект на центральной нервной системы, потому что это путь представляет прямой транспорт маршрут обходит BBB. Дата8были зарегистрированы три различных пути нос к мозг. Во-первых, путь Обонятельный нерв, который проходит от обонятельной слизистой оболочки в слизистой носа до переднего мозга через Обонятельный нерв. Во-вторых, путь тройничного нерва, которая проходит от слизистую дыхательных путей в слизистой оболочки носа в ствол головного мозга в задний мозг через тройничного нерва. В-третьих, пути CSF, которая распространяется по всему мозгу через спинномозговой жидкости. Нос к мозг путь она привлекла большое внимание в области гидрофильные макромолекул, которые клонат быть мешает BBB, как средства доставки biomedicines в центральной нервной системе8, 9 , 10 , 11 , 12. Однако несколько предыдущих исследований четко описали методы интраназального введения для мелких животных с целью проверки доставки наркотиков кандидатов через нос к мозг путь. Соответственно был очень медленный прогресс в исследованиях, связанных с механизмами распространения наркотиков нос к мозг с помощью мелких животных, которое представляет собой значительное препятствие с точки зрения разработки систем доставки нос к мозг для кандидата наркотиков. Таким образом в этом исследовании, мы разработали два протокола для интраназального введения при ингаляционной анестезии для изучения распределения различных кандидат препаратов, таких как biomedicines, которые ориентированы заболевания центральной нервной системы. Мы также описал метод, который может использоваться для количественной оценки.
Метод интраназального введения в пипетку с использованием временно неповрежденный вдыхании маски разработана в этом исследовании делает возможным для надежной администрирования с животными в состоянии стабильной обезболивание без пробуждения, как маски не должны быть удалены (рис. 1). Используя эту технику, мы продемонстрировали доставки водорастворимый макромолекул (инулина; Мартин Уитмарш: 5000) в мозг. Как инулин не проникают BBB, она может использоваться как маркер внутрисосудистый объем пространства (около 10-15 мкл/g мозга) в мозге крыс13. Мы получили отличные результаты количественных с маленькой экспериментальной ошибки. Уровень [14C]-инулина в мозге была явно выше после интраназального введения чем после внутривенного введения (данные не показаны). Соответственно мы установили, что эта техника представляет собой жизнеспособный подход для интраназального введения, который позволяет обычных администрации с помощью пипетки, в то время как предметы остаются под ингаляционной анестезии (рис. 2). Ингаляционная анестезия может повлиять на эпителия слизистой и, как следствие, повысить проницаемость через носовой эпителий. Характеризовать мозга доставки с помощью метода обратного катетеризации при ингаляционной анестезии, по сравнению с обычными анестезии как внутрибрюшинного администрации необходимы дополнительные исследования.
Впоследствии мы исследовали администрации через обратный катетеризации со стороны дыхательных путей через пищевод, который был разработан, чтобы свести к минимуму последствия MC. У крыс, Hirai метод требует операцию, чтобы закрыть пищевода и затем управлять от входа в нос, чтобы минимизировать эффект MC. В мышей это физически трудно для выполнения катетеризации от входа носа и интраназального введения может вызвать чихание. Наш метод обратного катетеризации соединяет канюля, непосредственно вставлены в полости носа от esophagus к микро шприцевой насос, которая имеет то преимущество, что это возможно закрыть пищевода и сократимость хирургическим путем и одновременно выполнять интраназального введения администрирования. Корректировка микро шприцевой насос облегчает администрирование с помощью точного дозирования ставки и томов. Используя эту технику, мы записали значительно более высокие уровни управляемых гидрофильные макромолекул в обонятельные луковицы, головного мозга и продолговатого мозга мышей, чем при использовании метода пипетки (рис. 3). Это, как представляется, быть потому что интраназального введения с помощью пипетки, решение пассивно осуществляется согласно спонтанное дыхание, таким образом, что решение, как правило, должны быть устранены к трахеи и пищевода, MC. В отличие от этого с администрацией в полость носа через пищевода обратный канюля, решение осуществляется, активно используя шприцевый насос в полость носа. Похоже, что этот подход существенно увеличивает хранения наркотиков раствора в полость носа, приводит к более высоким уровням распределения в головном мозге. Кроме того мы обнаружили более высокие уровни управляемые решения в обонятельные луковицы и продолговатого мозга, которые широко участвуют в нос к мозг пути, чем в головном мозге. Соответственно мы продемонстрировали, что администрация в полость носа через пищевода обратный канюля является жизнеспособной метод для оценки в полной мере потенциал нос к мозг доставки наркотиков кандидатов.
В заключение можно ожидать, что два метода интраназального введения, которую мы разработали в этом исследовании будет чрезвычайно полезным методы оценки фармакокинетики в мелких животных через нос к мозг путь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было частично поддерживается частных исследований университета брендинг проекта от МПКСНТ; субсидий для научных Research (C) (17 K 08249 [к T.K. и т.с.]) из японского общества для поощрения науки (JSP); Грант для совместных исследований от Хамагути фонда для улучшения биохимии [чтобы т.с.] и Такэда научный фонд [т.к.]. Мы благодарим г-н Юя Nito и г-жа Акико Asami за их ценную техническую помощь в проведении экспериментов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ddY mouse | Japan SLC, Inc. | Male, 4-6 weeks, 20-30 g | |
| Isoflurane | Pfizer | v002139 | |
| Isoflurane setup | SHINANO manufacturing CO. LTD. | SN-487-OTAir, SN-489-4 | |
| Isoflurane mask | SHINANO manufacturing CO. LTD. | For small rodents | |
| Isoflurane mask (openable type) | SHINANO manufacturing CO. LTD. | Special orders | |
| Anesthesia Box | SHINANO manufacturing CO. LTD. | SN-487-85-02 | |
| Animal experiments scissors-1 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | B-27H | |
| Animal experiments scissors-2 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | B-13H | |
| Tweezers-1 | FINE SCIENCE TOOLS Inc. | 11272-30 | Dumont #7 Dumoxel |
| Tweezers-2 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | A-12-1 | |
| Cannula tube (PE-50) | Becton, Dickinson and Company. | 5069773 | I.D.: 0.58 mm, O.D.: 0.965 mm |
| Cannula tube (SP-10) | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | KN-392 | I.D.: 0.28 mm, O.D.: 0.61 mm |
| Shaver | MARUKAN, LTD. | DC-381 | |
| Stereoscopic microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
| Needle 27G 1/2 in 13 mm | TERUMO CORPORATION | NN-2738R | |
| 1 mL syringe | TERUMO CORPORATION | SS-01T | |
| Syringe pump | Neuro science | NE-1000 | |
| Cellulose membrane | Toyo Roshi Kaisya, Ltd. | 00011090 | |
| Micro spatula | Shimizu Akira Inc. | 91-0088 | |
| Micropipette (0.5-10 uL) | Eppendorf AG | Z368083 | |
| Pipette chip | Eppendorf AG | 0030 000.811 | |
| Tape | TimeMed Labeling System, Inc. | T-534-R | For fixing mouse |
| [14C]-Inulin | American Radiolabeled Chemicals Inc. | ARC0124A | 0.1 mCi/mL |
| EtOH | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-00461 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc | Tri-Carb 4810TR |
References
- Sakane, T., Yamashita, S., Yata, N., Sezaki, H. Transnasal delivery of 5-fluorouracil to the brain in the rat. Journal of Drug Targeting. 7 (3), 233-240 (1999).
- Illum, L. Transport of drugs from the nasal cavity to the central nervous system. European Journal of Pharmaceutical Science. 11 (1), 1-18 (2000).
- Hanson, L. R., Frey, W. H. 2nd Intranasal delivery bypasses the blood-brain barrier to target therapeutic agents to the central nervous system and treat neurodegenerative disease. BMC Neuroscience. 9 (Suppl 3), S5 (2008).
- Chapman, C. D., et al. Intranasal treatment of central nervous system dysfunction in humans. Pharmaceutical Research. 30 (10), 2475-2484 (2012).
- Kanazawa, T. Development of non-invasive drug delivery system to the brain for brain diseases therapy. Yakugaku-Zasshi. 138 (4), 443-450 (2018).
- Kozlovskaya, L., Abou-Kaoud, M., Stepensky, D. Quantitative analysis of drug delivery to the brain via nasal route. Journal of Controlled Release. 189, 133-140 (2014).
- Hirai, S., Yashiki, T., Matsuzawa, T., Mima, H. Absorption of drugs from the nasal mucosa of rat. International Journal of Pharmaceutics. 7 (4), 317-325 (1981).
- Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Advances in Drug Delivery Reviews. 64 (7), 614-628 (2011).
- Lalatsa, A., Schatzlein, A. G., Stepensky, D. Strategies to deliver peptide drugs to the brain. Molecular Pharmaceutics. 11 (4), 1081-1093 (2014).
- Kanazawa, T. Brain delivery of small interfering ribonucleic acid and drugs through intranasal administration with nano-sized polymer micelles. Medical Devices. 8, 57-64 (2015).
- Kanazawa, T., et al. Enhancement of nose-to-brain delivery of hydrophilic macromolecules with stearate- or polyethylene glycol-modified arginine-rich peptide. International Journal of Pharmacology. 530 (1-2), 195-200 (2017).
- Kamei, N., et al. Effect of an enhanced nose-to-brain delivery of insulin on mild and progressive memory loss in the senescence-accelerated mouse. Molecular Pharmaceutics. 14 (3), 916-927 (2017).
- Suzuki, T., Oshimi, M., Tomono, K., Hanano, M., Watanabe, J. Investigation of transport mechanism of pentazocine across the blood-brain barrier using the in situ rat brain perfusion technique. Journal of Pharmaceutical Science. 91 (11), 2346-2353 (2002).
