Summary
Aqui, descrevemos dois métodos novos da administração intranasal estável sob anestesia por inalação com o mínimo de estresse físico para animais experimentais. Podemos também descrever um método de avaliação quantitativa dos níveis de distribuição de drogas no cérebro através da via de nariz-de-cérebro usando radiolabeled [14C]-inulina como um substrato de modelo de macromoléculas solúveis em água.
Abstract
Administração intranasal foi relatada para ser um potencial caminho para entrega de nariz-de-cérebro de agentes terapêuticos que contorna a barreira sangue - cérebro. No entanto, tem havido alguns relatos a respeito não só a análise quantitativa, mas também as condições ideais de administração e dosagem de regimes para investigações de entrega de nariz-de-cérebro. O progresso limitado na investigação sobre os mecanismos de nariz-de-cérebro via usando roedores representa um entrave significativo em termos de concepção de sistemas de entrega nariz-de-cérebro para drogas de candidato.
Para ganhar alguns progressos nesse sentido, desenvolvemos e avaliados dois métodos novos da administração intranasal estável sob anestesia por inalação para animais experimentais. Podemos também descrever um método de avaliação dos níveis de distribuição de drogas no cérebro através da via de nariz-de-cérebro usando rádio-rotulado [14C]-inulina (peso molecular: 5.000) como um substrato de modelo de macromoléculas solúveis em água.
Inicialmente, desenvolvemos um protocolo de administração intranasal baseada em pipeta usando máscaras temporariamente openable, que nos permitiram realizar administração fiável para animais sob anestesia estável. Usando este sistema, [14C]-inulina pôde ser entregue ao cérebro com pequeno erro experimental.
Posteriormente foi desenvolvido um protocolo de administração intranasal que impliquem reversa canulação do lado das vias aéreas através do esôfago, que foi desenvolvido para minimizar os efeitos de infralateral (MC). Esta técnica levou a níveis significativamente mais elevados de [14C]-inulina, que foi detectado quantitativamente no bulbo olfatório, cérebro e medula espinhal, que o método de pipeta. Isto parece ser porque a retenção da solução na cavidade nasal de drogas foi substancialmente aumentada pela Administração ativa usando uma bomba de seringa em uma direção oposta a MC na cavidade nasal.
Em conclusão, os dois métodos de administração intranasal, desenvolvido neste estudo podem ser esperados ser técnicas extremamente úteis para avaliar a farmacocinética em roedores. O método de canulação reverso, em particular, poderia ser útil para avaliar o potencial do cérebro-de-nariz entrega de candidatos da droga.
Introduction
Biomedicines como peptídeos e oligonucleotídeos anticorpos são considerados ter potencial aplicação como novos agentes terapêuticos para distúrbios do SNC refratário que atualmente não têm nenhuma terapia curativa. No entanto, porque a maioria dos biomedicines são macromoléculas solúveis em água, a entrega do sangue para o cérebro através de administração intravenosa ou oral é extremamente difícil devido à impedância da barreira hemato - encefálica (BBB).
Nos últimos anos, a administração intranasal tem sido relatada para ser um potencial caminho para entrega de nariz-de-cérebro de agentes terapêuticos que evita o BBB1,2,3,4,5. No entanto, há relativamente poucos relatos em relação à análise quantitativa de nariz-de-cérebro via entrega6. Além disso, não tem havido relatos virtualmente na administração ideal estabelecido condições e regimes de dosagens, tais como volume, vezes, períodos de tempo e velocidade, para investigações de entrega de nariz-de-cérebro. As irregularidades acima mencionadas podem ser atribuídas às seguintes razões: (i) um método ideal de administração intranasal para ratos ainda tem que ser estabelecido, e (ii) intranasal administração pipetando, que geralmente é usada, é tipicamente caracterizada pela variação interindividual entre animais devido à infralateral (MC), desse modo, muitas vezes levando a underestimations do potencial real entrega de nariz-de-cérebro de um determinado medicamento.
Anestesia por inalação utilizando isoflurano (iniciação: 4%, manutenção: 2%) com uma inalação máscara para roedores ganhou uso difundido, com o objectivo de reduzir ou eliminar a dor associada com a cirurgia realizada em animais experimentais. O uso de máscaras torna relativamente simples para executar a administração de drogas típico em animais experimentais sob anestesia por inalação através das rotas subcutâneas, intraperitoneal e intravenosa. No entanto, no caso de administração intranasal, a máscara precisa ser temporariamente retirados os animais para a administração de drogas. Com manutenção abaixo dos 2% isoflurano, animais geralmente acordem rapidamente da anestesia por inalação. Quando o volume de administração por dose é grande, isso pode causar a solução de drogas a fluir da cavidade nasal para o esôfago, e, portanto, a única grande dose pode precisar ser dividido em várias doses menores para a administração intranasal de pequeno animais. Como administração intranasal exige a remoção da máscara para administração repetida e tempo suficiente para a entrega da cavidade nasal sustentado, há uma alta probabilidade de que os ratos iria acordar da anestesia durante o procedimento de administração. Isto torna muito difícil realizar a administração intranasal sob um estado anestésico estável e provavelmente contribui para a variação interindividual observada de nariz-de-cérebro entrega entre roedores.
Neste estudo, portanto, desenvolvemos dois métodos novos da administração intranasal estável sob anestesia por inalação, que impõem o mínimo de estresse físico dos animais experimentais. Para o primeiro método, usamos uma máscara temporariamente openable que permite a administração intranasal durante a anestesia por inalação. A parte openable da máscara incorpora um plug de silicone que pode ser usado em conformidade com o calendário de administração para facilitar a administração intranasal estável, com uma pipeta. Para o segundo método, uma cânula foi inserida cirurgicamente para passar do esôfago na cavidade nasal, e uma bomba de seringa depois foi anexada a este para que a solução da droga pode ser entregue diretamente e confiavelmente na cavidade nasal sob inalação estável anestesia. Esse método pode melhorar a entrega de drogas para o cérebro através da rota de nariz-de-cérebro, porque minimizando substancialmente os efeitos da MC, seria maior droga retentively na cavidade nasal. Além disso, descrevemos um método para avaliar quantitativamente os níveis de distribuição de drogas (% para o cérebro da dose injetada/g) no cérebro usando rádio-rotulado [14C]-inulina [peso molecular (MW): 5.000] como um substrato de modelo de solúvel em água macromoléculas.
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Protocol
Realizou-se este estudo animal (#AP17P004) em conformidade com as diretrizes aprovadas pelo Comité de uso (Tóquio, Japão) e Universidade de Nihon Animal conta. Este estudo (#17-0001) foi aprovado pelo centro de radioisótopos da escola de farmácia da Universidade de Nihon.
1. os animais utilizados para a Administração Intranasal sob anestesia por inalação
- Abrigar os ratos experimentais em gaiolas de aço inoxidável sob um ciclo de luz/escuro de 12 h (luz em 08:00 – 20:00), com uma temperatura controlada, mantida a 23 ± 1 ° C, umidade de 50% ± 10% e ad libitum acesso à comida e água.
- Antes da experimentação, anestesia os ratos através de inalação de 2% de isoflurano, seguir a iniciação em uma concentração de 4%. Confirme o nível exigido de anesthetization verificando o desaparecimento de superfície corrigindo.
2. preparação da solução de administração
- Preparar uma solução de administração de [14C]-inulina (50 μM, μCi/mL 0,5 por rato) diluindo em tampão fosfato salino e armazenar a 4 ° C até o uso.
3. intranasais administrações para ratos
-
Método de micropipeta usando uma máscara de inalação temporariamente openable (Figura 1)
Nota: Esta técnica é uma modificação do protocolo de administração intranasal utilizando uma micropipeta estabelecida por Frey et al 3- Corrigi os ratos na posição supina, em um quadro de cortiça gravando seus membros sob anestesia por inalação, com 2% de isoflurano (figura 1A).
- Administre um volume total de solução de administração de 25 μL de cada rato em intervalos de 30 s, através de doses de 1 a 2 μL alternativamente administrados nas narinas esquerdas e direita, enquanto os ratos são fixados sob anestesia por inalação (figura 1B e C).
- Nota: Resíduos gás anestésico é ser eliminado por meio activo (fumos capô, gabinete de biossegurança duro-dutos, vácuo, etc.), quando a máscara é aberta e por meios passivos (botijão de gás anestésico waste) quando fechado
-
Reverter a canulação m ethod do lado das vias aéreas através do esôfago (Figura 2)
Nota: Esta técnica é uma modificação do protocolo de absorção intranasal para ratos estabelecido pela Hirai et al 7- Corrigi os ratos na posição supina, em um quadro de cortiça gravando seus membros sob anestesia por inalação, com 2% de isoflurano.
- Cabelo no pescoço é raspado e preparado através de aplicativo betadine ou clorexidina, seguido de um enxaguamento de álcool.
- Expor a traqueia e o esôfago, expandindo a pele abaixo da garganta com fórceps, depois de fazer uma pequena incisão (1,5 cm) com uma tesoura.
- Fazer uma incisão (1 mm) na traqueia com uma tesoura.
- Introduza uma cânula (diâmetro interno: 0,58 mm, diâmetro exterior: 0,965 milímetros) para um comprimento de 1,2 cm e conectar a extremidade oposta da cânula no interior da máscara inalação.
- Fazer uma incisão (1 mm) do esôfago usando a tesoura, introduza uma cânula (diâmetro interno: 0,28 mm, diâmetro exterior: 0,61 mm) a um comprimento de 1,4 cm em direção a parte posterior da cavidade nasal e ligá-lo (Figura 2A e B).
Nota: Procedimentos 3.2.2 a 3.2.4 foram realizados sob um microscópio estereoscópico na ampliação × 10. - Coloque uma agulha (27 × 1/2) uma seringa de 1 mL preenchida com uma solução de administração e se conectar a uma bomba de microseringa programável.
- Conectar-se acima da agulha para a cânula que tinha sido inserida para o esôfago em 3.2.5 (Figura 2).
- Administrar um volume total de 25 μL [14C]-solução de inulina a uma taxa constante (5 µ l/min) (Figura 2 e 2D).
4. quantitativo experimento usando rádio-rotulado de macromoléculas solúveis em água ([14C]-inulina)
- Decapitar os ratos experimentais sob anestesia e abrir seus crânios, com uma tesoura e do lado da medulla oblongata, enquanto tendo o cuidado para não danificar o cérebro.
- Extraia cuidadosamente o cérebro todo por escavar usando uma microespátula de crânio.
- Lugar um papel de filtro umedecido com solução salina em um prato de Petri que é armazenado no gelo.
- Coloque o cérebro extraído o papel de filtro umedecido.
- Limpe o sangue, aderindo à superfície do cérebro com um cotonete humedecido com uma solução salina para eliminar, pelo menos, a influência de [14C]-inulina no sangue na superfície do cérebro.
- Dissecar o cérebro rapidamente e dividi-los em três partes: o bulbo olfatório, cérebro e medula espinhal (incluindo o pons).
- Coloca as amostras de cérebro em solubilizer tecido a 50 ° C, durante 1 h.
- Adicione 10 μL da coquetel de cintilação líquida para as amostras de cérebro.
- Transferi uma alíquota de 25 μL da solução de administração dissolvida na cintilação cocktail para um frasco de cintilação para determinar a radioatividade da solução aplicada.
- Medir as desintegrações por minuto [14C] radioatividade da amostra do cérebro ([14C] Xcérebro) e a solução aplicada ([14C] XIN dose) em um contador de cintilação líquido equipado com um apropriado correção de cruzamento de 3H e 14C.
5. análise de dados
- Calcule os droga distribuição níveis (%) da dose injetada (ID %) usando a seguinte equação:
Cérebro de ⁄g ID % = ([14C] Xcérebro/ [14C] Xem dose) × 100,
onde Xcérebro (cérebro de dpm/g) é a quantidade de [14C] - inulina medido no tecido cerebral e XIN dose (solução de dpm/25 μL) é a concentração do [14C] - inulina na solução utilizada para a administração intranasal.
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Representative Results
A Figura 3 mostra o [14C]-níveis de inulina (ID % ⁄g o cérebro) no bulbo olfatório (A), encéfalo (B) e medula oblongata (C) obtidos utilizando os dois tipos de administração intranasal avaliados no presente estudo. Administração intranasal de entrega método habilitado da pipeta de [14C]-inulina no cérebro usando máscaras de inalação openable (Figura 1). Sob anestesia por inalação, os resultados quantitativos não revelaram nenhuma variação interindividual experimental entre os animais examinados, como indicado por baixo erro padrão. Quando foi utilizado o método de administração de cavidade nasal de cânula reversa esofágico para administrar [14C] inulina - inulina sob anestesia por inalação (Figura 2), níveis significativamente mais elevados de [14C] - foram observadas no bulbo olfatório ( Figura 3A), encéfalo (Figura 3B) e a medula oblongata (Figura 3), do que com o método de pipeta. Além disso, dentro do cérebro, superior [14C]-níveis de inulina foram detectados no bulbo olfatório e medula oblongata, proeminentemente envolvidos na via de nariz-de-cérebro, do que no cérebro.
Figura 1: Administração Intranasal utilizando uma micropipeta em conjunto com uma máscara de inalação temporariamente openable. Fotografias mostrando um mouse fixo (A) com uma máscara fechado antes da administração e (B) close-up e (C) vista inteira da máscara aberta durante a administração intranasal, usando uma pipeta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Administração Intranasal por canulação reversa do lado das vias aéreas através do esôfago usando uma bomba de seringa. Fotografias mostrando a área (A) cirúrgica, (B) close-up e (C) toda exibições e (D) o esquema de um mouse fixo após dois tipos de cânula tinham sido inseridas no esôfago e traqueia e conectadas a uma seringa em uma máscara de inalação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Comparação de [14C]-níveis de inulina no bulbo olfatório (A), encéfalo (B) e medula oblongata (C) na sequência de dois tipos de administração intranasal. Em-um e IN-B indicam o método micropipeta (Figura 1) e o método de canulação inversa (Figura 2) para a administração intranasal, respectivamente. Cada método, um volume total de 25 μL de [14C]-inulina (50 μM, 0,5 μCi/mL) foi administrada. A taxa de administração de IN-B foi de 5 µ l/min. Cada coluna representa a média ± S.E. (n = 4). p < 0,01 (Student t-teste) clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A nariz-de-cérebro entrega de drogas deverá ter um efeito pronunciado sobre distúrbios do sistema nervoso central, porque esta via representa uma rota de transporte directo que ignora o BBB. Três diferentes vias de nariz-de-cérebro têm sido relatadas para data8. O primeiro é o percurso do nervo olfativo, que passa da mucosa olfativa na mucosa nasal para o cérebro através do nervo olfativo. O segundo é o caminho do nervo trigêmeo, que passa de mucosa respiratória na mucosa nasal até o tronco cerebral no rombencéfalo através do nervo trigêmeo. O terceiro é o caminho do CSF, que é distribuído em todo o cérebro através do CSF. O caminho de nariz-de-cérebro tem atraído considerável atenção no que diz respeito a administração de macromoléculas hidrofílicas, que tendem a ser dificultada pelo BBB e como um meio de entregar biomedicines para o sistema nervoso central8, 9 , 10 , 11 , 12. no entanto, alguns estudos anteriores descreveram claramente métodos de administração intranasal, para pequenos animais a fim de verificar a entrega de drogas do candidato através da via de nariz-de-cérebro. Nesse sentido, tem havido progresso muito lento em pesquisas relacionadas aos mecanismos de entrega de droga de nariz-de-cérebro usando pequenos animais, que representa um entrave significativo em termos de concepção de sistemas de entrega nariz-de-cérebro para drogas de candidato. Portanto, neste estudo, desenvolvemos dois protocolos para administração intranasal sob anestesia por inalação para investigar a distribuição de diversas drogas do candidato, tais como biomedicines, doenças do sistema nervoso central de destino. Também descrevemos um método que pode ser usado para avaliação quantitativa.
O método de administração intranasal por pipeta usando máscaras de inalação temporariamente openable desenvolvidas neste estudo torna possível executar administração fiável com animais em um estado de anestesia estável sem despertar, como as máscaras não tem que ser removido (Figura 1). Usando esta técnica, temos demonstrado a entrega de uma macromolécula solúvel (inulina; MW: 5.000) para o cérebro. Como inulina não penetra o BBB, ele pode ser usado como um marcador do espaço de volume intravascular (aproximadamente 10-15 cérebro μL/g) no cérebro de rato13. Obtivemos excelentes resultados quantitativos com pequeno erro experimental. O nível de [14C]-inulina no cérebro foi claramente maior após a administração intranasal do que após administração intravenosa (dados não mostrados). Nesse sentido, estabelecemos que esta técnica representa uma abordagem viável para a administração intranasal que permite a administração convencional utilizando uma pipeta, enquanto os assuntos permanecem sob anestesia por inalação (Figura 2). Anestesia por inalação pode afetar a membrana epitelial nasal e, consequentemente, aumentar a permeabilidade através do epitélio nasal. Mais estudos são necessários para caracterizar a entrega do cérebro usando o método de canulação reversa sob anestesia por inalação, em comparação com a anestesia convencional, tais como a administração intraperitoneal.
Temos investigado posteriormente administração via reversa canulação do lado das vias aéreas através do esôfago, que foi desenvolvido para minimizar os efeitos do MC. Em ratos, o método do Hirai requer cirurgia para fechar o esôfago e depois para administrar a partir da entrada no nariz para minimizar o efeito de MC. Em camundongos, que é fisicamente difícil realizar a canulação da entrada do nariz, e a administração intranasal pode causar espirros. Nosso método de canulação reversa se conecta a cânula inserida diretamente na cavidade nasal de esôfago a uma bomba de seringa, que tem a vantagem de que é possível fechar o esôfago e vias aéreas por cirurgia e simultaneamente realizar intranasal administração. Ajuste da bomba microseringa facilita a administração usando volumes e taxas de dosagens exata. Usando esta técnica, nós gravamos níveis significativamente mais elevados a macromoléculas hidrofílicas administrado o bulbo olfatório, cérebro e medula espinal de ratos que quando usando o método de pipeta (Figura 3). Isto parece ser porque com administração intranasal usando uma pipeta, a solução é passivamente administrada em conformidade com respiração espontânea, tal que a solução tende a ser eliminado em direção a traqueia e o esôfago pelo MC. Em contraste, com administração na cavidade nasal, através de uma cânula esofágica reversa, a solução é administrada ativamente usando uma bomba de seringa na cavidade nasal. Parece que esta abordagem aumenta substancialmente a retenção da solução de droga na cavidade nasal, levando a uma maior distribuição níveis no cérebro. Além disso, detectamos níveis mais elevados da solução administrada no bulbo olfatório e medula oblongata, proeminentemente envolvidos na via de nariz-de-cérebro, do que no cérebro. Nesse sentido, temos demonstrado que a administração na cavidade nasal, através de uma cânula esofágica reversa é um método viável para avaliar o potencial da entrega do nariz-para-cérebro de candidatos da droga.
Em conclusão, os dois métodos de administração intranasal que desenvolvemos neste estudo podem ser esperados ser técnicas extremamente úteis para avaliar a farmacocinética em pequenos animais através da via de nariz-de-cérebro.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado em parte a privada Universidade Branding projeto de pesquisa do MEXT; um subsídio para Research (C) científica (17 K 08249 [a T.K. e TS]) da sociedade para a promoção da ciência (JSPS); Japão um subsídio para investigação cooperativa de fundação para o avanço da bioquímica [de T.S.] e a Fundação de ciência Takeda Hamaguchi [a T.K.]. Agradecemos Sr. Yuya Nito e MS. Akiko Asami pela sua valiosa assistência técnica na condução dos experimentos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ddY mouse | Japan SLC, Inc. | Male, 4-6 weeks, 20-30 g | |
| Isoflurane | Pfizer | v002139 | |
| Isoflurane setup | SHINANO manufacturing CO. LTD. | SN-487-OTAir, SN-489-4 | |
| Isoflurane mask | SHINANO manufacturing CO. LTD. | For small rodents | |
| Isoflurane mask (openable type) | SHINANO manufacturing CO. LTD. | Special orders | |
| Anesthesia Box | SHINANO manufacturing CO. LTD. | SN-487-85-02 | |
| Animal experiments scissors-1 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | B-27H | |
| Animal experiments scissors-2 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | B-13H | |
| Tweezers-1 | FINE SCIENCE TOOLS Inc. | 11272-30 | Dumont #7 Dumoxel |
| Tweezers-2 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | A-12-1 | |
| Cannula tube (PE-50) | Becton, Dickinson and Company. | 5069773 | I.D.: 0.58 mm, O.D.: 0.965 mm |
| Cannula tube (SP-10) | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | KN-392 | I.D.: 0.28 mm, O.D.: 0.61 mm |
| Shaver | MARUKAN, LTD. | DC-381 | |
| Stereoscopic microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
| Needle 27G 1/2 in 13 mm | TERUMO CORPORATION | NN-2738R | |
| 1 mL syringe | TERUMO CORPORATION | SS-01T | |
| Syringe pump | Neuro science | NE-1000 | |
| Cellulose membrane | Toyo Roshi Kaisya, Ltd. | 00011090 | |
| Micro spatula | Shimizu Akira Inc. | 91-0088 | |
| Micropipette (0.5-10 uL) | Eppendorf AG | Z368083 | |
| Pipette chip | Eppendorf AG | 0030 000.811 | |
| Tape | TimeMed Labeling System, Inc. | T-534-R | For fixing mouse |
| [14C]-Inulin | American Radiolabeled Chemicals Inc. | ARC0124A | 0.1 mCi/mL |
| EtOH | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-00461 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc | Tri-Carb 4810TR |
References
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