Das Protokoll hier skizzierten beschreibt die Immunfluoreszenz-Analyse, Biocytin Erholung und qualitativ hochwertige Rekonstruktionen der hippocampalen CA2 Interneuronen nach der intrazellulären elektrophysiologische Aufnahmen in-vitro- so dass neuronale Charakterisierung und letztlich feine neuronalen Anatomie studiert werden.
Wie kortikale Netzwerkaktivität verarbeitet ist Informationen für eine große Anzahl von Grundlagenforschung und klinische Fragestellungen von Bedeutung. Das hier beschriebene Protokoll identifiziert die grundlegenden Bausteine der diese Schaltung. Eingehenden Studien der kortikalen Regionen bieten letztlich andere Wissenschaftler mit der Schaltungskomponenten notwendig für das Verständnis, wie das Gehirn erhält, verarbeitet und speichert Informationen und was schief läuft in der Krankheit, während der elektrophysiologischen und morphologische Daten sind weit verbreitet durch rechnerische Neurowissenschaftler in den Bau von Modell-Netzwerke, die Informationsverarbeitung zu erkunden. Die hier beschriebene Protokoll beschreibt wie Biocytin gefüllten Zellen aufgezeichnet in der CA2-Region des Hippocampus sind wiederhergestellt und dann in 3D rekonstruiert. Das Protokoll beschreibt darüber hinaus die Demonstration der Calcium-bindendes Protein oder Peptid Inhalte in aufgezeichneten Interneuronen.
Der Kortex und Hippocampus sind Strukturen von solcher Komplexität, dass die Klassifizierung der neuronalen1,2,3,4, Karten der Verbindungen zwischen ihnen5,6 Subtypen , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 und wie diese Schaltung unterstützt kognitive Funktionen12,13,14,15 sind noch unter intensivem Studium und Weiterbildung diskutiert. Zum Beispiel, Details und Komplexität der Schaltung zu verstehen und um Daten aus vielen verschiedenen Studien zu koordinieren, ist es äußerst hilfreich zu definieren und beschreiben Sie die Komponenten dürfen, aber es bleibt eine Frage zur Diskussion, wie viele verschiedene Klassen von Neuronen vorhanden sind, oder sogar ob es möglich ist, alle Neuronen als Zugehörigkeit zu einer bestimmten Klasse zu definieren ist. Computational Tools, die bauen und Testen von Schaltungen mit unterschiedlichem Grad der Komplexität, werden entwickelten16,17,18, aber diese Bemühungen im Mittelpunkt steht die Notwendigkeit einer detaillierten Untersuchungen der Zelltypen und von den Eigenschaften der Verbindungen zwischen ihnen. Eine große Menge an Informationen über die lokalen Schaltung des Neocortex der erwachsenen Ratten hat bereits erfasst wurden, mit das Protokoll beschrieben hier10,19,20,21, 22. Obwohl der “Schaltplan” bei weitem nicht vollständig ist, einige klare Muster oder Regeln entstanden. Obwohl einige Details unterscheiden, sind diese Regeln zwei Säugetierarten (Ratte und Katze) und über mehrere neokortikalen Regionen gemeinsam soll die Entwicklung von grundlegenden Bausteine, die auf menschlichen Neocortex gleichermaßen anwendbar sein dürften. Die hier beschriebene Technik wird verwendet, um unser Verständnis der funktionalen Karte der kortikalen Schaltung durch die Identifizierung der präsynaptischen und postsynaptischen Neuronen beteiligt Verbindungen in den Regionen, die nicht vor, detailliert untersucht worden sind, unter Verwendung eines Protokolls zu verlängern Das ermöglicht ausgezeichnete Gewebe Erhaltung und bemerkenswerte Färbung Erholung im Erwachsenen Gehirngewebe. Daten auf der lokalen Schaltkreis CA2 und neuronale Eigenschaften in diesem Unterfeld haben mit dieser Methode gesammelt wurden, durch die Kombination von intrazellulären elektrophysiologische Aufnahmen (gekoppelte Aufnahmen mit scharfen Mikroelektroden) mit Biocytin füllen, Immunfluoreszenz, histologische Verfahren und hochdetaillierten neuronaler Rekonstruktionen, direkter Vergleich mit den benachbarten CA Regionen23,24,25.
In diesem Artikel beschriebene Verfahren wurde entwickelt im Laufe der Jahre erhalten detaillierte neuronalen Anatomie erlaubt die korrekte Klassifizierung der Zellen und die hohe Qualität und genaue Rekonstruktionen der beiden ihre dendritischen und axonalen Dorne, Daten korreliert mit elektrophysiologische Daten aus gekoppelten Aufnahmen mit scharfen Elektroden. Die histologische Protokoll wurde optimiert, um die Ultrastruktur der Neuronen zu bewahren und erhalten ausgezeichnete Erholung der dendritischen (einschließlich Stacheln) und axonalen Dorne. Zum Beispiel gibt das Prinzip der doppelten Fixierung Technik durch zunächst in einer Fixativ Lösung eintauchen und zweitens nach dem fixieren in Osmium ausgefällt einen guten Kontrast für Lichtmikroskopie26. Eine kleine Menge von Glutaraldehyd und Pikrinsäure Lösung dazu das Fixativ Lösung, Antikörper eindringen zu verbessern und die Zellen Ultrastruktur wie in einer früheren Studie27zu bewahren. Die Permeabilisierung der Gehirnscheiben der Frost-Tausalz-Methode kombiniert mit Cryo-Schutz mit Saccharose, anstatt einer herkömmlichen Waschmittel bietet auch optimale Erhaltung der Gewebe für detaillierte morphologische Analyse der aufgezeichneten Zellen. Darüber hinaus ist die Visualisierung besonders der sehr feine Strukturen durch verringern Hintergrundfärbung mit der Inkubationen mit Wasserstoffperoxid (H2O2) und Natriumborohydrid (NaBH4) gesteigert. Hinzufügen von Nickelchlorid (NiCl2) zu den Meerrettich-Peroxidase (HRP) erhöht Reaktion auf ein schwarzes Pigment Reaktionsprodukt zu erhalten auch den Kontrast.
Das folgende Protokoll beschreibt die Verfahren zum ausgezeichneten Gewebe Bewahrung und hochdetaillierte neuronalen 3D-Rekonstruktionen nach intrazellulären Aufnahmen in Vitrozu ermitteln. Die Beschreibung der Slice-Vorbereitung, intrazelluläre gekoppelte Aufnahmen mit scharfen Elektroden und anschließende histologische Verfahren, die in unserem Labor wurden bisher gemeldeten28. Das Protokoll gilt für die Zellen intrazellulär mit Biocytin in 450 – 500 μm dicke Scheiben gefüllt, kann das gleiche Protokoll nach ganzen Zelle Aufnahmen verwendet werden. Jedoch wird die Verwendung von dünneren Scheiben weniger vollständige Rekonstruktionen der Zellen führen.
Elektrophysiologische Aufnahmen in Vitro (Abbildung 1 Ac,d und v. Chr., d) kombiniert mit histochemische und immunhistochemische Verfahren ermöglichen die detaillierte Morphologie, verbindliches Proteingehalt an Calcium und Identität des Erwachsenen kortikale Interneurone aufgezeichnet offenbart werden. In der CA2-Region, diese Technik erlaubt die Studie der lokalen Schaltung zum ersten Mal und offenbart Unterklassen von Interneuronen, die zuvor nicht in CA1 oder CA3 beschrieben hatte: breit dendritischen und axonalen Arbor Korb Zellen (Abbildung 1 b), Bistratified Zellen und SP-SR Interneuronen.
Das hier beschriebene Protokoll wurde optimiert, um die Ultrastruktur der Neuronen zu bewahren und erhalten ausgezeichnete Erholung der dendritischen (einschließlich Stacheln) und axonalen Dorne. Kritischen Schritte umfasst die Verwendung der doppelten Fixierung Technik zur Verbesserung der Kontrast für Lichtmikroskopie26 und die Zugabe von Glutaraldehyd und Pikrinsäure Lösung zur Fixativ Lösung Antikörper eindringen Verbesserung und Erhaltung der neuronalen Ultrastruktur27. Frost-Tausalz-sanfte Permeabilisierung gibt bessere Erhaltung der Feinstruktur, während Osmication und Harz einbetten Z-Plane Schrumpfung28reduzieren. Darüber hinaus ist die Visualisierung von sehr feinen Strukturen (Axone mit kleinen Boutons z. B. feine) verbessert durch Inkubation in den Abschnitten mit H2O2 und NaBH4 Hintergrundfärbung reduzieren. Kontrast kann auch mit dem Zusatz von NiCl2 der HRP-Reaktion erhöht werden.
Die histologische Verfahren detailliert hier bietet hervorragende Ergebnisse hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit. Allerdings bestimmt die Dauer der elektrophysiologischen Aufnahmen die Qualität der Färbung, mit kürzeren Aufnahmen meist verbunden mit schlechten axonalen Färbung Biocytin/Fluoreszenz. Die Wahl der Aufnahme Protokolle (intrazelluläre Aufnahmen mit scharfen Elektroden vs. ganze Zelle Patch spannen) kann auch Biocytin Aufbewahrung und Erhaltung der feinen Anatomie beeinflussen.
Während die Schwierigkeiten in Feinstruktur in histologischen Verarbeitung hier beschrieben und die Zeit genommen, bei 100 X Vergrößerung (1-4weeks abhängig von der Komplexität des Axons) rekonstruieren die Erhaltung sind willkommen, diese Methode gibt eine genaue Darstellung der dendritischen und axonalen Durchmesser. Die Verwendung von weniger anspruchsvolle Protokolle, Biocytin Kennzeichnung zu offenbaren ist verständlich, aber diese häufig klare Visualisierung der feinen axonalen Verzweigungen entgegen. Reinigungsmittel, Eintrag von Avidin-HRP Biocytin und Antikörper, enthüllen zu fördern sind oft in dicke Schichten notwendig, aber Feinstruktur stören können. Neurowissenschaftler Suche ständig für halbautomatische Methoden der Rekonstruktion, sondern für bleibt jetzt sowie für Axone insbesondere Biocytin-HRP mit manuellen Rekonstruktion der Gold-Standard-31.
Hochdetaillierte neuronale Rekonstruktionen, besonders genaue Zeichnungen der axonalen Boutons und Knoten, das Vorhandensein oder Fehlen von Myelin und ganz allgemein die Zeichnung des kompletten axonalen Laube, mit der Darstellung der genauen Axon-Durchmesser ändert sich entlang seiner Länge, finden Sie weitere Informationen für die genaue Identifizierung eines unterschiedlichen Typs Interneurone. Obwohl viele Interneurone nicht genau in einer bestimmten Klasse passen, bietet die oben beschriebene Technik korrelierte Daten auf neuronale elektrophysiologischen Eigenschaften, die kurzfristige Plastizität im Zusammenhang mit einer bestimmten Art von Verbindung und detaillierte neuronaler Rekonstruktionen, so dass den Schaltplan in der CA2-Region, zum Beispiel im Detail untersucht werden.
Feine, detaillierte Struktur wird oft in Rechenmodelle vereinfacht. Zwar verständlich, führt dies zum Verlust von Informationen, die in Zukunft kritisch erweisen könnte. Analyse der detaillierte 3D Rekonstruktionen mit parallelen synaptischen Daten ermöglicht die Zugabe von weiteren Kriterien für die interneuronale Einstufung. Daten können in öffentlichen Repositories hinterlegt und werden durch Modellbauer, um das Ergebnis der sporadische Änderungen im Axon Durchmesser und Myelinisierung auf Aktionspotential Ausbreitung rechnerisch zu erkunden.
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wird finanziell unterstützt von Novartis Pharma (Basel) und dem Medical Research Council ausgezeichnet zu Prof. Alex Thomson, der Biotechnologie und biologische Wissenschaften Research Council (BBSRC-BB/G008639/1), der physiologischen Gesellschaft der Europäischen Union Horizon 2020 Rahmenprogramm für Forschung und Innovation im Rahmen der spezifischen Grant Agreement Nr. 720270 (menschliche Gehirn Projekt SGA1) und unter bestimmten Grant Agreement Nr. 785907 (menschliche Gehirn Projekt SGA2). Wir sind sehr dankbar, Prof. Alex Thomson, zum Aufbau des Protokolls in anderen kortikalen Regionen, die Sicherung der Finanzierung und für ihre kontinuierliche Unterstützung für dieses Projekt. Beiträge von Lab-Mitglieder, die geholfen, Optimierung der Erholung-Protokoll und rekonstruiert CA2 Neuronen sind dankbar anerkannt: J. Deuchars, H. Pawelzik, D. I. Hughes, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.
Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
Gelatin | Sigma | 48723 | |
Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
Equipment used | |||
Vibratome | Agar Scientific | ||
C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
0.18mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
0.25mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
Glass vials 14 mL | Fisher scientific |