3 D ダイナミック文化システムの多層間葉系幹細胞シートの構築
Summary
この資料では、プロパティが有利な幹細胞幹細胞の多層シートを構築するため効率的かつ実行可能な方法を提供します。
Abstract
幹細胞療法は有望なを示す将来負傷した臓器や組織を再生・細胞シート技術は低細胞保存とターゲット ゾーン内で貧しい人々 の生存を改善するために開発されました。ただし、体外施工中に幹細胞の活性を維持して細胞シート内細胞量の増加のためのソリューションが急務します。ここでは、このプロトコルは有利な幹細胞の生物活性と最適な操作性と多層の細胞シートを構築する手法を提案します。細胞シート足場として2 (PLA2) decellularization メソッド ホスホリパーゼによって脱ブタの心膜 (DPP) を用意し、ラット骨髄間葉系幹細胞 (BMSCs) が分離されシード細胞として展開されます。一時的な多層細胞シート構造は、RAD16 を使用して作成されます-私ペプチド ハイドロゲルです。最後に、三次元 (3 D) の構造を安定させるために動的な灌流システムと細胞シートを培養し、48 時間培養の in vitro細胞シートを得ることができた。このプロトコルは、多層の細胞シートを構築するための効率的かつ実行可能な方法を提供し、細胞シートが将来的に有利な幹細胞療法製品として開発される可能性があります。
Introduction
幹細胞療法は多くの病気の効果的な治療法として報告されています。ただし、低細胞保存とターゲット ゾーン内で貧しい人々 の生存伝統的な幹細胞の注入の後の重要な問題に残る。この問題を解決するためには、組織工学科学者は、細胞シート技術を開発しました。そのままの細胞外マトリックスを持つ単層細胞シートまず温度応答文化料理1を使用して調製し、, そのフォロー アップ研究幹細胞の保存と、梗塞内生存の重要な改善を報告しました。エリア2,3。方法のうちは、多層の細胞シートを構築する細胞の生存率と細胞シート治療効果3,4を改善するための効果的な戦略として報告されています。以来、科学者は細胞量、幹細胞プロパティ、および細胞シートの機械的性質を高めるために別の細胞シート工法の開発に働いています。これまでのところ、細胞シートの特定の種類を構築し、心筋梗塞の5、軟骨損傷6治療の研究、皮膚傷7。
移植前に幹細胞の生物活性を示した負傷した組織再生に新たな影響を及ぼす、異なる細胞シートの構築戦略は、幹細胞の異なる効果を持ちます。一方、コンフルエントの細胞シートはのみ高密度の幹細胞で構成され、重なり単層細胞シート8または磁気ティッシュ エンジニア リング技術9を使用して、自然な細胞外マトリックスを取得できます。その一方で、研究者は、十分な機械的強度を提供し、細胞成長10、11,12、低細胞播種密度栄養を確保するための許可をサポートする異なる足場を開発しました。供給。ただし、これらのアプローチにもかかわらず多層細胞シート構造内で低効率の高い栄養供給は体外工事主要な関心事を残ります。したがって、効率的かつ実行可能な細胞シート施工システムは緊急に必要です。
このプロトコルでは、multilayeredmesenchymal 幹細胞 (MSC) の細胞シートを準備する手順について説明します。この工法では、細胞シートの機械的強度は、DPP によって提供されます。この足場を基に、3 D の細胞構造を素早く構築できます RAD16 で-私ペプチド ハイドロゲルと動的な灌流システム、3 D の細胞シート構造の安定化し、十分な栄養を提供するために、多層の細胞シートを文化に使用セルの供給。このシステムを使用すると、多層 BMSC シート準備ができましたし、ラット心筋梗塞モデル13の最適な治療効果を展示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この議定書は、多層 MSC シートを構築するための効率的な方法を報告します。この細胞シートは、最適な強度、高い細胞播種密度および有利な幹細胞活性を展示します。BMSCs を例として使用して、3 D の細胞の構造がすぐに RAD16 で構築されて-私ペプチド ハイドロゲルです。動的な灌流システムで培養されて後、多層 BMSC のシートは正常に取得し、BMSCs 高幹細胞マーカー発現を維持します。
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この仕事に支えられた中国の国家自然科学基金 (許可番号 31771064)科学技術計画プロジェクトの広東省 (許可番号 2013B010404030、2014A010105029、および 2016A020214012)。科学技術計画プロジェクトの広州 (許可番号 201607010063)学部の技術革新と起業家研修 (許可番号 201610559028)(許可番号 31800819) 中国の若い科学者を全米科学財団。
Materials
| Phospholipase A2 | Sigma-Aldrich | P6534 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Phosphate buffer | Gibco BRL | 89033 | |
| Penicillin streptomycin / amphotericin | Gibco BRL | 15640055 | |
| Buffer bicarbonate | Sigma-Aldrich | C3041 | |
| Table concentrator | Changzhou Aohua Instrument Co. | KT20183 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) | Corning Cellgro | 10-014-CVR | |
| South American fetal bovine serum | Gibco BRL | 10270-106/P30-3302 | |
| L-Glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning Cellgro | 25-053-CI | |
| Biosafety cabinet | Esco,Singapore | AC2-2S1 | |
| Constant temperature incubator | Esco,Singapore | CLS-170B-8 | |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| EP tube | Axygen | 31617934 | |
| Centrifugal machine | TOMOS | 1-16R | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-500G | |
| Pura Matrix | BD | 354250 | |
| Dynamic perfusion culture system | Minucells and Minutissue | D-93077 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IPC N8 | |
| Pump tubing | Ismatec | Nr.1306 | |
| MINUSHEET 1300 | Regensburg | tissue carrier components | |
| MINUSHEET | Regensburg | dynamic perfusion system | |
| MINUSHEET 0006 | Regensburg | gas exchange equipment | |
| MINUSHEET 0002 | Regensburg | 500 mL glass bottle | |
| MINUSHEET 1301 | perfusion culture container |
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