Summary
在这里, 我们描述了一个协议的多重荧光免疫组化染色和成像同时定位的多种癌症相关抗原在淋巴瘤。该协议可推广到所有组织切片中生物标志物的共化分析。
Abstract
免疫组织化学 (ihc) 方法用于光镜原位分析蛋白质表达, 是研究和诊断的有力工具。然而, 使用常规显色 ic 在单个组织切片中对多种抗原进行可视化和定量是具有挑战性的。多路成像在淋巴瘤的研究和诊断中尤其重要, 在淋巴瘤的研究和诊断中, 标记必须在复杂的肿瘤微环境中进行解释。在这里, 我们描述了多路复用荧光 ihc 染色的协议, 以便能够定量评估淋巴瘤中感兴趣的特定细胞类型中的多个目标。该方法包括抗体验证、抗体优化、淋巴瘤亚型标记物的多重优化、组织微阵列 (tma) 幻灯片的染色以及幻灯片的扫描, 然后进行数据分析, 并具有特定的特征指淋巴瘤。使用这种方法, 产生的平均强度的兴趣标记和百分比阳性产生, 以方便进一步的定量分析。多路复用最大限度地减少了样本利用率, 并为每个感兴趣的标记提供了空间信息。
Introduction
淋巴肿瘤是由淋巴细胞不受控制的恶性增殖引起的。这些细胞是免疫系统的重要组成部分, 并定位到主要和次要免疫器官, 如骨髓、淋巴结、脾脏和其他黏膜相关的淋巴系统。淋巴肿瘤是一种异质性疾病, 根据包括形态学、免疫表型、遗传特征和临床表现在内的一系列特征进行分类。虽然每个参数都有一定的作用, 但谱系仍然是一个决定性的特征, 并构成世卫组织分类系统的基础, 该系统识别来自 b 细胞、t 细胞和自然杀伤细胞1的肿瘤。
淋巴瘤分类的关键一直是对白细胞表面标记抗体的鉴定, 对淋巴细胞的各种亚型2。免疫组织化学 (ihc) 传统上被用于分析此类标记, 并基于特定的抗原抗体识别原理, 以检测可通过光学显微镜显示的细胞和组织分子3. 然而, 传统的光场显色多体 ihc 在单个幻灯片上识别多个目标有局限性, 因为通常很难可靠地区分单个组织部分上的多个颜色信号, 尤其是对于具有很低表达的抗原4。对染色进行视觉评估和定量也可能是主观的, 导致分析和数据解释的可变性5。
因此, 传统的 ihc 在福尔马林固定, 石蜡嵌入 (ffpe) 样品是不可行的同时检测多个目标的免疫多样化的疾病, 如淋巴瘤。此外, 区分肿瘤淋巴细胞和周围的免疫细胞往往是不精确的。这阻碍了研究新的生物标志物在淋巴瘤中的相关性。在这种情况下, 多重荧光 ihc (mf-ihc) 提供了一个很有希望的替代方案, 因为它允许定量评估抗原共表达和空间关系的更高的精度, 同时保存有限的样本6,7.当该成像技术与数字图像分析软件结合使用时, 数据解释效率更高, 便于肿瘤和微环境异质性的研究 8,9。在本协议中, 采用了基于类型的免疫荧光 (if) 复用方法来放大信号, 并与任何寄主物种 (即使是在同一物种5、7中开发的) 经过 ihc 验证的任何抗体兼容,10. 基于类型的协议允许荧光体与感兴趣的组织直接结合, 以便在每一步之后都能去除原发抗体和二级抗体, 从而可以连续应用多个污渍没有抗体交叉反应性。
多路复用策略将有助于预测预后和治疗结果, 通过确定目标及其变异的免疫模式在淋巴瘤。多倍荧光 ihc 已在我们的实验室中应用于血管免疫细胞 t 细胞淋巴瘤 (aita) 中 t 和 b 淋巴细胞标记组和 t-滤泡辅助标记的研究, 这是一种具有攻击性临床特征的外周细胞淋巴瘤的亚型行为和肿瘤异质性11。这种方法的效用也说明了弥漫性大 b 细胞淋巴瘤 (dlbcl), 其中 b 细胞受体同时 c-myc 和 bcl-2 表达的信号增加表明布鲁顿酪氨酸激酶抑制的潜在治疗应用12.
在这里, 我们描述了整个协议, 从抗体验证, 选择适当的控制组织和多路复用使用淋巴瘤 ffpe 组织, 最终分析染色幻灯片使用扫描自动定量病理成像系统。
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Protocol
该协议中使用的所有组织都是根据新加坡 nhg 领域特定审查委员会 b 的研究获得的, 该研究报告为 201\ 00693。
1. 抗体的选择和验证
注: 在进行任何多路复用面板的建立之前, 请确保所有抗体都能进行有力的染色, 只识别感兴趣的目标抗原。其目的是选择抗体, 特别是承认在组织切片感兴趣的抗原。
- 对于具有成熟研究用途或在 ihc 中常规临床使用的抗体, 通过对阳性和阴性对照组织进行常规的 ihc5、13,确认表位检索和抗体稀释等条件部分。对于人类来源的组织切片, 请确保在开始实验之前有适当的伦理许可。
注: 阳性对照是预期表达感兴趣的抗原的组织, 负对照是那些不表达的组织。良性扁桃体组织被选择作为淋巴瘤抗原的良好组织控制, 因为它包含免疫细胞的混合物, 包括 b 细胞、t 细胞、抗原呈现细胞以及基质和上皮细胞。后者起到了有益的负面内部控制的作用。 - 对于未知目标或已公布数据不足的商业抗体, 使用 crispr 敲除或 sirna 击倒感兴趣的抗原, 通过创建匹配的正负对照 ffpe 细胞块14来进行抗体验证通过标准的分子生物学技术在适当的细胞系中。按照步骤1.1 的要求, 使用这些 ffpe 细胞块来代替常规 ihc 的正对照组织。
注: hela 或293t 细胞通常用于不是细胞类型特异性的抗原, 因为淋巴瘤细胞系很难转染。对于淋巴细胞特异性抗原, 淋巴瘤细胞系可与病毒转导或电穿孔一起使用, 作为基因传递的方式 (尽管疗效较低)。
2. 规划复合板的抗体和荧光剂的顺序
- 为最终的多路染色规划试剂的顺序。例如, 这里的多路协议序列最初计划为第一, bcl-6;二、bcl-2;第三, c-myc;第四, cd20;第五, ki67。
注: 要决定序列, 在最终的多重染色中, 应首先对需要较高浓度的亲和力较弱的抗体进行染色。可能对多轮微波剥离具有耐药性的高亲和力抗体在多重协议中最后应用, 以避免非特异性染色。 - 为面板中的每个抗体规划荧光蛋白伙伴。有关本示例中的选择, 请参阅表 1和材料表。
注: 要决定每个抗体的荧光伙伴, 选择光谱不同的荧光体的抗体具有类似的模式定位在细胞内和组织内。这将最大限度地减少光谱重叠和不混合的难度。
3. 模拟 5-复用面板中基于单位类型的 if
注: 在本例中, 讨论了 cd20 的协议, 它计划作为上述多序列中的第四个抗体。对于抗体在序列中的位置, 额外剥离步骤的数量会有所不同。
- 使用微体切割正负对照组织的3μm 薄切片, 并将切片放置在多 l-溶氨酸涂层显微镜玻璃滑块上。
- 使用适当的清除解决方案 3倍, 各4分钟。将幻灯片补充为100% 酒精、90% 酒精和70% 酒精, 每次4分钟。将滑梯放入蒸馏水中2-3分钟。
- 将幻灯片放入微波安全玻璃瓶中的标准抗原回收缓冲液 (市售) 中, 使幻灯片浸入其中。在98°c 的 ph9 抗原检索溶液中, 使用合适的微波进行热诱导表位检索 (hier) 25分钟。
注: 任何压力范围为 800-1, 100 瓦的微波都可以使用, hier 可以进行相应的优化。在这种情况下, 多功能微波组织处理器 (开放的空气) 用于 hier 和剥离。检索特定表位的初始设置基于传统 ihc 的先验知识。 - 执行额外的微波剥离轮 (在这种情况下, 对于面板中的第四抗体, 每轮, 每轮的功率为100% 至 98°c, 20% 的功率为 10分钟, 以保持在相同的温度。在蒸馏水中冷却滑块至少10分钟。
注: 在单 plex if 步骤期间执行多轮微波剥离, 以将目标抗原暴露在与建议的多重方法相同的加热步骤中。由于 cd20 计划作为第四抗体, 做微波剥离3倍之前和做一次后, 做的主要抗体培养。 - 在额外的微波剥离过程中, 每5分钟检查并补充一次缓冲液。重要的是, 不要让幻灯片在多个剥离过程中干涸。从微波炉中取出滑梯时, 请使用钳子和耐热手套将其放入单独的蒸馏水罐中。等待抗原回收溶液自然冷却。
- 使用商业过氧化物酶块阻止组织过氧化物酶活性 10分钟 (3% 过氧化氢可用作替代试剂)。用三色缓冲盐水 (tbs) 和非离子洗涤剂清洗5分钟。
注: tbs 由 50 mm tris-cl、ph 7.5 和 150 mm n特尔. tbs 组成, 用于制造 tbs-d。 - 用抗体稀释剂或牛血清白蛋白块 15分钟, 然后与感兴趣的原代抗体孵育 (例如, cd20, 1:2000 稀释抗体稀释剂, 见材料表) 在室温下30分钟清洗3x 用tbs-d 缓冲器每次5分钟。应该有足够的 tbs-d 缓冲器, 使幻灯片完全浸入所有洗涤步骤中。
注: 牛血清白蛋白可作为替代抗体稀释剂使用。抗体稀释剂的体积取决于组织的大小, 从 50μl (活检样本) 到 400μl (切除样本或组织微阵列样本) 不等。 - 在室温下, 根据原代抗体的来源选择, 用适当的辣根过氧化物酶 (hrp) 标记的二级抗体进行培养15分钟。每次用 tbs-d 缓冲液清洗 3倍, 每次5分钟。
- 应用适当的基于类型的荧光试剂 (1: 100 在扩增稀释剂) 和孵育在室温下 5分钟, 以允许荧光剂结合到组织样本的一级抗体结合部位。每次用 tbs-d 缓冲液清洗 3倍, 每次5分钟。
- 执行额外的基于微波的剥离, 以去除初级和二级抗体。根据抗体在序列中的位置根据需要重复。
- 将滑梯放入蒸馏水中冷却。用 dapi (1: 100 抗体稀释剂稀释) 进行10分钟的培养, 然后用 tbs-d 缓冲液清洗 3x, 每次5分钟。用湿巾擦干滑梯上的区域, 用适当的安装介质安装滑梯。
- 将幻灯片成像 (见本协议第6节和第7节), 并确定染色的适当性 (通过明确区分正面和负面控制组织来定义)。
注: 如果染色模式不正确, 请在调整以下一个或多个参数后重做单次染色: 热回收步骤的数量、热回收的量、抗体的潜伏期/抗体的潜伏期浓度 (初级和初级次), 抗体在序列中的位置, 以及荧光体的选择。单细胞染色步骤通常需要多轮优化, 以获得一组合适的参数, 用于适当的染色。建议用每个初级抗体测试一系列荧光, 因为这将为决定最终的多路抗体集提供灵活性。
4. 多配偶议定书中每个抗体的单剂重复
- 根据抗体在序列中的位置, 以类似的方式对其他抗体重复单次染色, 方法是调整微波剥离步骤的数量。例如, 在六路复用面板中对第三种抗体进行单细胞染色时, 在初级抗体培养之前执行两个微波剥离步骤和三个微波剥离步骤。
注: 重要的是要认识到, 基于微波的抗体剥离也暴露给 hier 样品。如果特定抗体需要不同的表位检索策略, 则在规划多路序列时需要考虑到这一点。在本例中, ki67 表位检索需要 ph 值 9, 为30分钟。由于 hier 的25分钟将在序列协议的 ki67 染色之前完成, 因此只需要额外的 5分钟 hier。
5. 多重染色协议
注: 只有在使用单 plex if 染色对所有组件进行优化后, 才继续执行多重染色协议。回顾单细胞染色的结果, 并设计一个表格, 显示多路数顺序的最终布局和每个抗体的荧光体的选择。表 1提供了这里使用的每个抗体的抗体浓度、染色持续时间以及热回收的顺序和性质的细节。
- 使用微体切割正负对照组织的3μm 薄切片, 以及感兴趣的目标组织 (此处为淋巴瘤的 ffpe 样本), 并将切片放置在多-l-溶酶涂层显微镜玻璃滑梯上 (见材料表)。
注: 建议在面板中包含每个抗体的正负对照, 以及用于多重检测的实际样本。这允许确认染色协议执行正确。 - dewax, 执行热诱导表位检索 (hier), 并阻止组织过氧化物酶活性, 如单人协议步骤 3.3-3.5。
- 用优化的多路序列的第一个初级抗体进行孵化, 如先前使用 monoplex if 步骤确定的那样。在本例中, bcl-6 在室温下稀释抗体稀释剂 (见材料表) 为1:30 时, 是复用协议的第一步。用 tbs-d 缓冲液清洗5分钟。
- 根据前一步使用的原代抗体的种类 (见材料表), 在室温下使用适当的 hrp 标记的二级抗体进行培养 10分钟, 用 tbs-d 缓冲液清洗5分钟。
- 应用优化的基于酪的荧光试剂 (本例中为 cy5, 1: 100 在放大稀释剂中, 见材料表), 在室温下孵育5分钟。孵育后, 用 tbs-d 缓冲液清洗5分钟。
注: 基于类型的荧光试剂的选择是基于优化的单倍体 if。 - 使用适当的显微镜检查第一抗体的染色效率 (见材料表)。
注: 如果样品是 tma 或单张幻灯片, 则可以轻松地进行临时成像检查。但是, 如果在多个幻灯片上执行污渍, 这可能不切实际, 并且可能会省略此步骤。 - 使用单点步骤中优化的条件, 对协议中的第二抗体执行微波剥离。然后, 继续用 hrp 标记的二级抗体和基于酪基的荧光试剂 (此处, 520, 见材料表) 染色第二初级抗体 (此处为 bcl2)。第二轮染色完成后, 在荧光显微镜下检查染色效果。
- 同样, 重复使用序列中的第三、第四和第五抗体 (这里分别为 c-myc、cd20 和 ki67, 分别使用荧光570、540和 620)。如果可行, 在每个步骤之间执行成像检查。
- 添加核反污剂 (dapi, 1: 100 在抗体稀释剂中稀释) 10分钟, 然后在 tbs-d 中清洗 2倍, 每次5分钟。
- 使用适当的安装试剂安装幻灯片。
6. 频谱库幻灯片的编制
注: 本协议第6-8 节是使用光谱相机成像的多路复用实验所独有的。
- 为同一控制组织上的每个荧光体、dapi 和自荧光创建库幻灯片 (单染色参考图像), 用于多光谱图像分析。
- 使用微体切割 2 x 3μm 薄的组织类型 (此处, 淋巴瘤样本或扁桃体作为对照), 并将切片放置在多 l-裂解物涂层显微镜玻璃滑梯上。
- 使用单点协议处理两张幻灯片 (包括所有剥离和洗涤步骤), 但没有抗体或荧光粉的添加。
- 按照步骤5.9 使用 dapi 染色一张幻灯片, 并使一张幻灯片不被染色 (用于组织自体荧光光谱的生成)。
注: 优化后的单点幻灯片 (使用单一荧光染料, 不含 dapi) 可用作光谱库幻灯片, 以生成每种荧光染料的光谱。
- 使用适当的筛选器扫描这些幻灯片集, 并将其上载到图像分析库中。
7. 光谱成像
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扫描单片机
- 从适用于所使用的荧光体的现有标准荧光滤光片 (dapi、fitc、cy3、texas red 和 cy5) 中选择过滤器。
注: 本示例中使用的特定荧光的推荐过滤多维数据集如表 215 所示。 - 检查相应荧光通道中的每个标记, 以确定合适的曝光时间, 从而获得干净的信号。聚焦在应该具有标记最强信号的组织成分上。
- 确定每种分析物的固定曝光时间 (抗体-荧光体组合), 以便对像素强度进行交叉样本比较 (尽管某些商业平台有归一化策略来考虑曝光的差异)。
- 要确定给定通道的固定曝光时间, 请使用实时摄像机设置调整曝光时间, 直到实时摄像机图像中没有过度曝光的区域, 并对所有通道重复此操作。
- 扫描单点幻灯片后, 生成模拟的明亮场图像 (如果所使用的软件中提供了该功能), 以便直观地与正常的 ihc 模式进行比较, 并确定染色模式是否正确 (图 1和图 2)).
- 从适用于所使用的荧光体的现有标准荧光滤光片 (dapi、fitc、cy3、texas red 和 cy5) 中选择过滤器。
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扫描多路样品 (tma 幻灯片/多个样本)
- 设置扫描单点图像所述的光学参数 (步骤 6.1)。首先, 手动或自动调整焦点 (按照特定图像扫描机的说明进行操作)。其次, 调整每个荧光通道的曝光时间, 以确保 tma 上的所有内核或幻灯片上的所有区域都有适当的曝光。
注: 为调整曝光时间而选择的区域很重要。用户需要为每个滤波器选择最强的信号区域 (即, 在扁桃体萌发中心区域, ki67 信号比在非生殖器中心区域更强; 因此, 用户应使用在适当曝光时设置的萌发中心区域时间)。用户还可以采用成像系统的过饱和校正功能 (如果有)。 - 使用适当的自动对焦算法, 在成像系统中可用的 tma 扫描模式下扫描 tma 幻灯片。
- 对于全组织切片, 请让合格的病理学家对幻灯片进行检查, 以便从最具代表性的肿瘤区域中选择最佳图像。
注: 此处描述的协议基于定义的显微镜/图像分析系统 (请参阅材料表)。还有其他机器和图像分析软件, 可以扫描和分析多重 ihc 幻灯片7。
- 设置扫描单点图像所述的光学参数 (步骤 6.1)。首先, 手动或自动调整焦点 (按照特定图像扫描机的说明进行操作)。其次, 调整每个荧光通道的曝光时间, 以确保 tma 上的所有内核或幻灯片上的所有区域都有适当的曝光。
8. 数据分析
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预测前评估和规划
- 使用自动荧光参考幻灯片从扫描的图像中减去自荧光进行分析。
- 分析前查看图像, 以确保图像处于焦点位置, 且没有染色伪影。
- 使用肿瘤标记 (例如, 本例中的 cd20) 来识别感兴趣的细胞, 并进行细胞分割、评分和批量分析方法。选择 cd20 阳性单元格进行分析。
注: 例如, 在此处分析的 dlbcl 样本中, 为细胞分割定义的设置和参数基于核大小和强度, 但特定于所使用的图像分析软件 (例如,dapi 的平均像素强度为最小 0.05;大小在80-320 像素之间, 分裂敏感性在 2 [这是一个软件特定的参数, 在很大程度上依赖于肿瘤的形态: 对于小肿瘤细胞, 分裂0.7-1 是适当的; 对于大肿瘤细胞, 分裂可以调整到 4])。 - 要求合格的病理学家审查单个图像, 并决定是否需要组织分割来选择肿瘤细胞丰富的区域, 并排除坏死区域和丰富的反应细胞的区域。如果需要额外的组织分割, 然后选择适当的控制区域 (如肿瘤细胞/细胞坏死), 并检查图像分析软件是否能够正确识别这些区域
- 在组织分割后继续进行细胞分割 (如果有的话), 要求合格的病理学家查看细胞分割图, 以确保预期的分割方法5的保真度。
- 为特定的生物标志物 (例如, 阳性率或每个细胞的平均强度) 确定最适合于临床的生物学分析方法。
- 为每个标记选择一个正值 (对于百分比正)。
- 与病理学家一起确定每个标记的光学强度正截止值。通过在适当的统计软件中分析标记强度单元的频率分布来生成直方图 (参见材料表)。
注: 强度值直方图可以提供信号强度分布的概述。 - 确定直方图的近似截止点, 并通过病理学家的检查来验证这一点, 以便与选定图像上的手动确定的截止时间相关联。在某些情况下, 由于染色的可变性, 不可能有统一的单截止值, 因此需要为每个样品提供手动截止值。
注: 除非另有说明, 否则第8.1 节应在图像分析软件中完成 (请参见材料表)。
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标记阳性和阴性细胞
- 对于每个感兴趣的标记, 根据确定的截止编号 (通过直方图或手动), 使用 "if" 或类似的逻辑公式标记有标记值的正数和负数: 正单元格的数字 1, 负数单元格的数字0。
- 对于所有标记的正性, 请将每个标记 (1 或 0) 的标记值与产品在单独的列中相乘。如果产品等于 1, 则表示单元格对所有标记都是正数。对于特定标记的正性和负性, 请使用 if 逻辑算法。
注: 第8.2 节需要在统计软件中完成 (见材料表)。
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使用数据透视表生成百分比数据和数字数据
- 在定义的单元格 (例如, cd20 阳性单元格或 cd20 阴性单元格) 中生成特定感兴趣标记的百分比数据 (图 6)。
- 在数据表中插入数据透视表。
- 若要计算单个标记 (如 cd20) 的阳性百分比, 请在数据透视表的"值" 部分下选择sum函数, 使用 cd20+单元除以总细胞编号。其结果是一个核心或一个研究编号中的 cd20+单元格百分比 (取决于数据透视表行的选择)。
- 使用相同的方法计算多个标记的正百分比 (图 3).
- 生成数字数据。通过获取样本中所有研究细胞中每个标记的平均强度, 提取每个核心或每个研究数字的每个标记的中位归一化计数 (图 4)。
注: 中值不能直接在枢轴表中派生。它可以使用这个公式得出: median (研究编号列 = 特定的研究编号, 归一化值列)。
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在合适的图形中绘制数据
- 以适当的方式绘制感兴趣的细胞类型中每个标记的百分比阳性或中位强度的结果, 以便进一步进行统计测试和表示。
- 创建点图以提供数字和分布的可视化。
注: 用条形图表示数据不会传达有关分布的信息。估计图也被推荐为一种很好的数据表示方法, 重点是样本 16之间的差异大小。
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Representative Results
mf-ihc 图像的 dlbcl 样品与 c-myc 和 bcl2 基因重排 (双击淋巴瘤) 如图 1所示。图 2显示了模拟的光场免疫组织化学图像。图 3显示了百分比数据的生成。图 4显示了生成数值数据的中位公式的详细信息。图 5显示了 t 细胞面板 mf-ihc 在血管免疫细胞 t 细胞淋巴瘤中的应用。图 6显示了扁桃体控制样本的优化图像以及此示例的数据分析。
图1:b 细胞多路免疫荧光面板图像, 用于扩散大 b 细胞淋巴瘤 (dlbcl) 样本, 其 c-myc 和 cl2 基因重排 (双击淋巴瘤).洋红色 = cd20 (膜);白色 = bcl2 (细胞质);黄色 = ki67 (核);绿色 = c-myc (核);红色 = bcl6 (核), 蓝色 = dapi (核反液剂)。cd20 阳性肿瘤细胞在 c-myc (80%) 和 bcl2 (gt;90 和) 中的表达率较高, ki67 的增殖指数也很高 (90%)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 模拟明亮场免疫组织化学图像 (从图 1生成) 相同的 dlbcl 样本与 c-myc 和 bright-field 基因重排 (双击淋巴瘤).cd20 显示肿瘤细胞中的膜染色。bcl2 显示细胞质染色在 & gt;90% 的肿瘤细胞。c-myc 阳性率约为80%。bcl6 显示约20% 的细胞有核染色。在90% 的细胞中, ki67 呈阳性。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 数据透视表, 显示如何根据研究编号生成百分比数据.请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 根据研究编号计算的归一化 ki67 od 值的中值公式.if 语句找到所有等于特定研究编号的研究编号 (在此图中为 52)。然后, 返回相应的 ki67 归一化值。ctrl + shift + enter组合键可用于计算这些返回值的中值 (ki67 中值), 对于研究编号 52, 这是11.56。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 血管免疫细胞 t 细胞淋巴瘤 (aitl) 样本的多路免疫荧光面板图像.综合图像显示了 aitl 样本的细胞异质性。洋红色 = cd20 (膜);黄色 = cd4 (膜);绿色 = pd1 (膜);红色 = bcl6 (核);青素 = cd8 (膜);蓝色 = dapi (核反液剂)。(b) 图像的上一行显示在面板 a的白框中选定的区域的放大视图。下一行图像显示了相应的分段细胞掩码: 黄/红绿分别显示单个 cdncch-bcl6.pd1 阳性细胞。蓝色表示负细胞, 白色表示双阳性细胞。图像显示, 50% 的 cd4+细胞为 pd1+ (左, 白色), 20% 的 cd4 + 细胞对 bcl6 (中, 白)也是阳性。pd1 和 bcl6 的双阳性率约为 10% (右, 白色)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 扁桃体对照组织的多路免疫荧光优化图像.(a) 合成图像显示扁桃体对照样品的萌发中心区域。黄色 = c-myc (核);红色 = bcl6 (核);青色 = bcl2 (细胞质);洋红色 = cd20 (膜);绿色 = ki67 (核);蓝色 = dapi (核反液剂)。c-myc 只有在少数细胞中是阳性的。bcl6 和 ki67 主要在萌发中心内呈阳性, 而 bcl2 主要在萌发中心外呈阳性。cd20 在萌发中心内外呈扩散阳性。(b) 表显示, 萌发中心 cd20 阳性细胞对 bcl6 和 ki67 也是阳性, 但对 bcl2 呈阴性。请点击这里查看此图的较大版本.
| 抗体染色序列 | 初级抗体 (见材料表) | 所需总费用 | 实际预染色 | 二级抗体 | 荧光 | 后 tsa 抗体剥离 |
| 1 | 鼠标防 bcl6 (1:30, 60分钟 rt) | 25分钟, ph9 | 25分钟, ph9 | hrp 共轭反鼠标, 1:1000 ' 为 10 ' | opal cy5 在1:100 | 1轮100%power 功率 1分钟, 20% 10分钟 |
| 2 | 鼠标防 Bcl2(1:50,60 分钟 rt) | 25分钟, ph9 | 没有 | hrp 共轭反鼠标, 1:1000 ' 为 10 ' | opal 520 在 1: 100 | 1轮100%power 功率 1分钟, 20% 10分钟 |
| 3个 | 兔子抗 c MYC(1:50,30 分钟 rt) | 25分钟, ph9 | 没有 | hrp 共轭反兔子, 1:1000 ' 为 10 ' | opal 570 在 1: 100 | 1轮100%power 功率 1分钟, 20% 10分钟 |
| 4个 | 鼠标防 CD20(1:2000,30 分钟 rt) | 25分钟, ph9 | 没有 | hrp 共轭反鼠标, 1:1000 ' 为 10 ' | opal 540 在 1: 100 | 1轮100%power 功率 1分钟, 20% 10分钟 |
| 5 | 鼠标反基 67 (1:50, 45分钟 rt) | 30分钟, ph9 | 5分钟 ph9 | hrp 共轭反鼠标, 1:1000 ' 为 10 ' | opal 620 在 1: 100 | 1轮100%power 功率 1分钟, 20% 10分钟 |
表 1: 多重 if 染色的最终布局示例.此表提供了一个示例, 说明一旦单分子污渍得到优化, 如何指定在每个步骤中要进行的 hier 和基于微波的剥离的数量。
表 2: 荧光滤清器选择指南.此表提供了一个关于可在指定设备上使用的适当过滤器的粗略指南, 以可视化感兴趣的荧光。建议检查所使用的显微镜与所用氟化物的发射-激发剖面有关的过滤规范。
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Discussion
mf-ihc 有可能使病理学家能够改进淋巴病理诊断标准, 并分析生物标志物在特定细胞类型中的作用, 以预测临床结果。mf-ihc 作为一种新的研究方法, 越来越多地应用于肿瘤细胞17的多重免疫参数的定量和空间识别。mf-ihc 检测肿瘤生物标志物的共表达已被证明是可重现和可靠的5。然而, 这项技术仍然是新生的, 并受到由于反应和组织相关因素而产生的变异性, 例如由于组织固定和加工不一致而产生的变异性。
该技术的关键是使用经过验证的抗体, 这些抗体具有特异性、敏感性, 并可提供可重现的结果。在文献中有一些例子, 最初描述为其抗原的特异性, 后来被证明通过使用淘汰赛模型14 来识别无关的蛋白质。在这种击倒/击倒验证方法中, 具有过度表达抗原的野生类型或细胞作为阳性对照, 而目标被 sirna 或 crispr 方法击倒或击倒的细胞则被用作负对照。
与传统的 ihc 一样, mf-ihc 也有许多关键变量, 需要针对每个实验进行优化, 以获得最佳染色和结果。这些包括抗原回收溶液的 ph 值、抗体稀释、每个标记物的荧光体分配以及荧光体的浓度。常用的抗原回收溶液为 ph 值6和9。在较少背景的情况下, 测试哪种 ph 值给出了最佳的染色模式和强度是值得检验的。
在多路实验中, 没有具体的指南来决定抗体的应用顺序, 因为它不仅取决于抗体的亲和力, 还取决于蛋白石荧光素的强度。一般情况下, 亲和力较弱的抗体通常需要更高的浓度基于单细胞染色, 并首先应用于多重序列。可能具有抗剥离性的强亲和力抗体最后施用于非特异性染色。关于特定荧光体的选择, 最好避免使用具有类似光谱波长的荧光体作为抗原, 这些抗原在相同的蜂窝中同地排列。表达水平低的抗原被分配为最亮的荧光,反之亦然。如果在研究样本中, 信号强度较弱, 可以调整蛋白石 tsa 稀释, 以达到所需的信号18。在某些情况下, 尝试不同的抗原回收方法或增加初级抗体浓度可能会奏效。初级抗体的初始稀释可能与常规 ihc 实验中建立的稀释相同。但是, 如果 if 信号不明确, 则需要检测其他抗体稀释, 因为针对 ihc 的优化条件并不总是转化为 if。信号强度受免疫染色顺序或顺序的影响。有些表位在两轮或三轮 mwt 后过度暴露, 而有些表位可能由于 mwt 过多而退化。某些荧光也会受到 mwt 的影响, 需要进行衰减测试。
该方案的重点是共联和测量标记的强度在细胞亚群的恶性 b 细胞淋巴瘤。在开发当前协议的关键挑战涉及到生成一个优化的多路面板的抗原, 共联在相同的细胞隔间。需要精确地解混荧光管, 以便进行精确的定量。一旦多路面板就位, 彩色幻灯片的成像就相对简单。下一个障碍涉及对成像数据的分析。与免疫浸润研究不同的是, 在上皮肿瘤中特定免疫细胞类型的定量很简单, 淋巴瘤的共化研究在很大程度上依赖于训练有素的病理学家对每个肿瘤的阳性定义。兴趣。在适当的诊断切断, 可适用于常规临床实践的派生仍然是一项正在进行的工作。在将此技术集成到常规诊断中之前, 需要进一步改进数据规范化和自动截断三角测量的方法。
尽管目前存在局限性, 但 mf-ihc 的潜在应用以及从肿瘤细胞的研究中可能获得的知识及其与微环境的空间关系使其成为一个有吸引力的工具, 特别是对于具有挑战性的组织学癌症, 如淋巴恶性肿瘤。需要进一步开展工作, 建立最适合拟议工作流程的组织固定和组织处理协议, 并加强染色技术, 以便同时分析更多的目标。
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Disclosures
a. d. j. 已收到 perkinelmer 提供的资金, 用于前往用户小组会议。提交人没有其他利益冲突需要披露。
Acknowledgments
s. b. n. 和 a. d. j. 得到新加坡卫生部国家医学研究委员会过渡奖 (nmrc/2013 和 nmrc 00.塔/00 2016) 的支持。作者承认新加坡国立大学癌症研究所向 a. d. j. 提供的用于购买 vectra 光谱成像显微镜的永秀 yoon 研究赠款。这项研究获得新加坡 nhg 领域特定审查委员会 b (2014/00693) 的批准。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
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