Summary
Qui descriviamo un protocollo per multiplex immunohistochemical fluorescente di colorazione e di imaging per la localizzazione simultanea di più antigeni tumore-associati nel linfoma. Questo protocollo può essere esteso all'analisi di colocalizzazione dei biomarcatori all'interno di tutte le sezioni di tessuto.
Abstract
Metodi di immunoistochimica (IHC) per l'analisi in situ di espressione della proteina da microscopia chiara sono un potente strumento per la ricerca sia gli scopi diagnostici. Tuttavia, la visualizzazione e la quantificazione degli antigeni multipli in un singolo tessuto sezione utilizzando convenzionali cromogenico IHC è impegnativo. Multiplex imaging è particolarmente rilevante nella ricerca di linfoma e di diagnostica, dove gli indicatori devono essere interpretate nel contesto di un microambiente tumorale complesse. Qui descriviamo un protocollo per multiplex fluorescente IHC che macchia per permettere la valutazione quantitativa di bersagli multipli in tipi cellulari specifici di interesse nel linfoma. Il metodo copre gli aspetti della convalida dell'anticorpo, ottimizzazione dell'anticorpo, l'ottimizzazione multiplex con marcatori di sottotipi di linfoma, la colorazione dei vetrini di tessuto microarray (TMA) e la scansione delle diapositive, seguita da analisi dei dati, con specifico riferimento per linfoma. Spartiti per sia l'intensità media di un marcatore di interesse e la percentuale di positività, utilizzando questo metodo, vengono generati per facilitare ulteriormente l'analisi quantitativa. Multiplexing riduce al minimo l'utilizzo di esempio e vengono fornite informazioni spaziali per ogni indicatore di interesse.
Introduction
Neoplasie linfoidi sono causati dalla incontrollata proliferazione maligna dei linfociti. Queste cellule sono componenti fondamentali del sistema immunitario e si localizzano gli organi immuni primari e secondari, quali il midollo osseo, nei linfonodi, milza e altri sistema linfoide mucosa-collegato. Neoplasie linfoidi sono un gruppo eterogeneo di disordini che sono classificati basato su una costellazione di caratteristiche, tra cui morfologia, immunofenotipo, caratteristiche genetiche e presentazione clinica. Mentre ogni parametro svolge un ruolo, lignaggio rimane una caratteristica distintiva e costituisce la base per il sistema di classificazione del WHO che riconosce neoplasma derivati dalle cellule B, cellule T e natural killer (NK) cellule1.
Chiave per la classificazione di linfoma è stata la caratterizzazione degli anticorpi contro gli indicatori della superficie del leucocita dei vari sottotipi di linfociti2. Immunohistochemistry (IHC) è stato tradizionalmente usato per l'analisi di tali indicatori e si basa sul principio del riconoscimento antigene-anticorpo specifico per rilevare molecole cellulari e tissutali che possono essere visualizzati attraverso il microscopio ottico 3. Tuttavia, l'identificazione di bersagli multipli su una singola diapositiva di convenzionale campo chiaro cromogenico multisala IHC ha limitazioni perché spesso è difficile distinguere attendibilmente più segnali di colore su una sezione di tessuto singolo — soprattutto per gli antigeni con un' espressione molto bassa4. Valutazione visiva e quantificazione di colorazione può anche essere soggettivi, causando la variabilità nella interpretazione analisi e dati5.
Di conseguenza, IHC convenzionale su campioni di formalina-fisse, paraffina (FFPE) non è fattibile per la rilevazione simultanea di più destinazioni in immunologicamente diverse malattie come il linfoma. Inoltre, distinguendo i linfociti neoplastici dalle cellule immuni circostante è spesso impreciso. Questo ostacola studi esaminando la rilevanza di nuovi biomarcatori nel linfoma. In questo contesto, multisala fluorescente IHC (mf-IHC) rappresenta un'alternativa promettente poiché permette la valutazione quantitativa della coexpression di antigene e un rapporto spaziale con maggiore precisione, conservando limitato campioni6,7. Quando questa tecnologia di imaging è una partnership con il software di analisi di immagine digitale, l'interpretazione dei dati è reso più efficiente e facilita lo studio del tumore e microambiente eterogeneità8,9. In questo protocollo, un basati su microarray immunofluorescenza (IF) multiplexing metodo viene applicato per amplificare il segnale ed è compatibile con qualsiasi anticorpo IHC-convalidato da qualsiasi specie di ospiti, anche quelli sviluppati nella stessa specie5,7 , 10. il protocollo basato su microarray permette per la coniugazione diretta del fluoroforo al tessuto di interesse affinché l'anticorpo primario e secondario possa essere rimossi dopo ogni passaggio, consentendo l'applicazione sequenza di macchie multiple senza cross-reattività dell'anticorpo.
Una strategia di "multiplex" sarà utile per stimare la prognosi ed il trattamento risultati identificando obiettivi e loro modelli variant immunologiche nei linfomi. Multisala fluorescenti IHC è stato applicato nel nostro laboratorio per lo studio di un pannello di marcatori di T e dei linfociti B e T-follicolare helper nel linfoma a cellula T angioimmunoblastic (AITL), un sottotipo di un linfoma a cellula T periferico caratterizzato da aggressivo clinica comportamento e tumore eterogeneità11. L'utilità di questo metodo è illustrato anche nel linfoma diffuso della B-cellula grande (DLBCL) dove la segnalazione aumentata di un recettore della B-cellula con espressione simultanea di C-MYC e BCL-2 suggerisce il potenziale impiego terapeutico di inibizione di chinasi della tirosina di Bruton 12 .
Qui descriviamo l'intero protocollo dalla convalida dell'anticorpo alla selezione dei tessuti di controllo appropriato e multiplexing con linfoma FFPE tessuti, con un'eventuale analisi di vetrini colorati utilizzando una scansione automatizzata imaging quantitativo patologia sistema.
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Protocol
Tutti i tessuti utilizzati in questo protocollo sono stati ottenuti sotto Singapore NHG dominio specifico Review Board B studiare 2014/00693.
1. selezione e validazione degli anticorpi
Nota: Prima di procedere con la creazione di qualsiasi pannello multiplex, assicurarsi che tutti gli anticorpi macchiare robustamente, identificare solo l'antigene target di interesse. L'obiettivo è quello di selezionare gli anticorpi che riconoscono specificamente l'antigene di interesse in sezioni di tessuto.
- Per un anticorpo con una consolidata ricerca uso o uso clinico sistematico in IHC, confermare le condizioni come epitopo recupero e anticorpo diluizione eseguendo convenzionale IHC5,13 sul tessuto di controllo positivo e negativo sezioni. Per sezioni di tessuto di origine umana, assicurarsi che le distanze di etica appropriati siano a posto prima di iniziare gli esperimenti.
Nota: Controlli positivi sono tessuti che esprimono l'antigene di interesse ci si attende, e controlli negativi sono quelli che non lo fanno. Tessuto benigno tonsilla è scelto come un controllo di tessuto buona per gli antigeni di linfoma perché contiene una miscela di cellule immuni, compreso le cellule B, cellule T, cellule presentanti l'antigene, nonché e cellule stromali ed epiteliali. Quest'ultimo serve come utile controllo interno negativo. - Per destinazioni sconosciute o per gli anticorpi commerciali con i dati pubblicati insufficienti, eseguire la convalida di anticorpo creando abbinato positiva e delle cellule di controllo negativo FFPE blocca14, utilizzando CRISPR knock-out o siRNA knock-down dell'antigene di interesse in una linea di cella appropriata attraverso tecniche di biologia molecolare standard. Utilizzare questi blocchi di celle FFPE al posto di tessuti di controllo positivi e negativi per IHC convenzionale secondo passo 1.1.
Nota: Le cellule HeLa o 293T sono comunemente usate per gli antigeni che non sono il tipo di cella specifici, come linee cellulari di linfoma sono difficili a transfect. Per gli antigeni che sono specifici dei linfociti, linee cellulari di linfoma utilizzabile con trasduzione virale o elettroporazione come la modalità di consegna del gene (seppur con bassa efficacia).
2. pianificazione della sequenza degli anticorpi e fluorofori per il pannello Multiplex
- Pianificare la sequenza dei reagenti per la colorazione finale multiplex. Ad esempio, qui la sequenza per il protocollo multiplex è stato inizialmente progettata come in primo luogo, Bcl-6; in secondo luogo, Bcl-2; in terzo luogo, C-Myc; quarto, CD20; quinto, Ki67.
Nota: Per decidere la sequenza, gli anticorpi con una debole affinità che richiedono le più alte concentrazioni dovrebbero essere macchiati prima nella macchiatura multiplex finale. Anticorpi ad alta affinità che rischiano di essere resistente ai vari cicli di microonde stripping vengono applicati per ultimi nel protocollo multiplex ad evitare le macchie non specifici. - Pianificare il fluoroforo partner per ogni anticorpo nel pannello. Per le scelte in questo esempio, vedere tabella 1 e Tabella materiali .
Nota: Per decidere il fluoroforo partner per ogni anticorpo, scegliere fluorofori spettralmente distinta per gli anticorpi con modelli simili di localizzazione all'interno della cellula e all'interno del tessuto. Questo ridurrà la sovrapposizione spettrale e difficoltà con unmixing.
3. Levansucrasi Tyramide-base in caso di un pannello Multiplex simulato 5-plex
Nota: In questo esempio, il protocollo per CD20 è discussa, che è progettata come l'anticorpo quarto in una multisala sequenza appena descritta. Il numero di passaggi aggiuntivi di strippaggio sarà diverso per la posizione dell'anticorpo nella sequenza.
- Tagliare 3 µm-sottili sezioni di tessuto di controllo positivi e negativi utilizzando un microtomo e le sezioni sulle lastre di vetro del microscopio rivestiti con poli-L-lisina.
- Sparaffinatura le sezioni utilizzando una soluzione appropriata schiarimento 3 x per 4 minuti ciascuno. Reidratare le diapositive di alcole a 100%, 90% di alcool e alcool al 70%, 4 min ciascuno. Mettere i vetrini in acqua distillata per 2-3 min.
- Porre i vetrini in un vaso di vetro del forno a microonde in un buffer di recupero di antigene standard (disponibile in commercio) per immergere i vetrini. Eseguire il recupero di epitopo indotto da calore (HIER) utilizzando microonde adatto, in soluzione di recupero dell'antigene pH9 a 98 ° C per 25 min.
Nota: Qualsiasi forno a microonde con una pressione che varia da 800-1.100 watt può essere utilizzato, e possono essere ottimizzati di conseguenza. In questo caso, un processatore di forno a microonde multifunzione (aperto all'aria) è stato utilizzato per HIER e stripping. Le impostazioni iniziali per il recupero di un particolare epitopo si basano sulla conoscenza preventiva da IHC convenzionali. - Eseguire ulteriori giri di microonde stripping (tre in questo caso, per l'anticorpo di quarto in un pannello), ogni giro con 100% di potenza a 98 ° C e 20% di potenza per 10 min mantenere la stessa temperatura. Raffreddare i vetrini in acqua distillata per almeno 10 min.
Nota: Eseguire più cicli di forno a microonde "stripping" durante il passaggio di IF Levansucrasi per esporre l'antigene bersaglio per lo stesso numero di passi come il multiplex proposto da riscaldamento. Dato che CD20 è programmato come l'anticorpo quarto, forno a microonde stripping 3x prima e una volta dopo aver fatto l'incubazione dell'anticorpo primario. - Verifica e riempire il buffer dopo ogni 5 minuti durante ulteriori microonde stripping. Soprattutto, non lasciare che scivoli asciugarsi durante le procedure multiple di strippaggio. Quando si scattano le diapositive dal microonde, utilizzare pinze e guanti anticalore per inserirli in un vaso separato di acqua distillata. Attendere che la soluzione di smascheramento dell'antigene a raffreddare naturalmente.
- Bloccare l'attività di perossidasi del tessuto utilizzando un blocco commerciale perossidasi per 10 min (3% di perossido di idrogeno può essere utilizzato come un reagente alternativo). Lavare con soluzione fisiologica tamponata (TBS) e un detergente non ionico per 5 min.
Nota: TBS è composto da 50 mM Tris-Cl, pH 7.5 e 150 mM NaCl.TBS per rendere TBS-D. - Blocco con diluente dell'anticorpo o albumina di siero bovino per 15 min seguita da incubazione con anticorpo primario di interesse (ad es., CD20, 1:2,000 diluizione con il diluente dell'anticorpo, Vedi Tabella materiali) a temperatura ambiente per 30 min. lavare 3 volte con TBS-D buffer per 5 minuti ogni volta. Ci dovrebbe essere sufficiente buffer di TBS-D per immergere il vetrino completamente in tutte le fasi di lavaggio.
Nota: Albumina di siero bovino può essere utilizzato come un anticorpo alternativo diluente. Il volume di diluente anticorpo dipende dalle dimensioni del tessuto, che vanno da 50 µ l (per i campioni di biopsia) a 400 µ l (per l'asportazione campioni o campioni di tessuto microarray). - Incubare un appropriato alla perossidasi di rafano (HRP)-anticorpo secondario etichettato, scelto in base alle specie d'origine dell'anticorpo primario per 15 min a temperatura ambiente. Lavare 3 volte con tampone di TBS-D per 5 minuti ogni volta.
- Applicare un appropriato basato su microarray fluorescente reattivo (1: 100 in amplificazione diluente) e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti, per consentire il fluoroforo coniugazione per il campione di tessuto presso i siti di legame dell'anticorpo primario. Lavare 3 volte con tampone di TBS-D per 5 minuti ogni volta.
- Eseguire un ulteriore basati su microonde stripping per rimuovere l'anticorpo primario e secondario. Ripetere come richiesto basato sulla posizione dell'anticorpo nella sequenza.
- Porre il vetrino in acqua distillata per raffreddare. Incubare con DAPI (diluizione 1: 100 con il diluente di anticorpo) per 10 min, seguita da lavare 3 volte con tampone di TBS-D per 5 minuti ogni volta. Asciugare la zona sulla diapositiva senza il tessuto con salviettine e montare il vetrino con mezzi di montaggio appropriato.
- Immagine della diapositiva (Vedi sezioni 6 e 7 del presente protocollo) e determinare l'appropriatezza della colorazione (come definito da chiara discriminazione del tessuto controllo positivo e negativo).
Nota: Se il modello di macchiatura è corretto, rifare la Levansucrasi colorazione dopo la regolazione di uno o più dei seguenti parametri: il numero di recupero calore passi, la quantità di recupero di calore, il periodo di incubazione/concentrazione di anticorpi (primaria e secondaria), la posizione dell'anticorpo in sequenza e la scelta del fluoroforo. La levansucrasi macchiatura passo in genere richiede più cicli di ottimizzazione per ottenere un adeguato set di parametri per una colorazione adeguata. Si consiglia di testare una serie di fluorofori con ogni anticorpo primario, come questo fornirà la flessibilità nel decidere il set finale di multiplex.
4. ripetizione di Levansucrasi per ogni anticorpo nel protocollo Multiplex
- Ripetere la Levansucrasi macchiatura per gli altri anticorpi in un modo simile regolando il numero di microonde stripping passaggi, basati sulla posizione dell'anticorpo nella sequenza. Per esempio, quando si esegue Levansucrasi che macchia per l'anticorpo terzo in un pannello multiplex sei-plex, è necessario eseguire due passaggi di spogliatura di forno a microonde prima e tre passaggi di spogliatura di forno a microonde dopo l'incubazione dell'anticorpo primario.
Nota: È importante apprezzare che il forno a microonde-based stripping di anticorpi espone anche il campione da HIER. Se un anticorpo specifico richiede una strategia di recupero diverso epitopo, questo deve essere presi in considerazione quando si pianifica la sequenza multiplex. In questo esempio, Ki67 dell'epitopo richiede pH 9, per 30 min. Poiché 25 min di HIER sarà fatto prima di KI67 macchiatura nel protocollo sequenza, solo un extra 5 min di HIER sono necessarie.
5. protocollo di colorazione di multiplex
Nota: Procedere con il multiplex protocollo di colorazione solo dopo che tutti i componenti sono stati ottimizzati utilizzando Levansucrasi se la macchiatura. Esaminare i risultati della colorazione Levansucrasi e progettazione di una tabella che mostra il layout finale dell'ordine di multiplex e la scelta del fluoroforo per ogni anticorpo. I dettagli della concentrazione di anticorpi, la durata della colorazione e la sequenza e la natura di recupero di calore per ogni anticorpo usato qui è forniti nella tabella 1.
- Taglio 3 µm-sottili sezioni di tessuto di controllo positivo e negativo, così come il tessuto dell'obiettivo di interesse (qui, campioni FFPE di linfoma), utilizzando un microtomo e inserire le sezioni su vetrini microscopio rivestiti con poli-L-lisina (Vedi Tabella materiali).
Nota: L'inclusione dei controlli positivi e negativi per ogni anticorpo nel pannello è consigliabile, insieme a campioni reali per multiplex. Questo consente di confermare che il protocollo di colorazione è stato eseguito correttamente. - Sparaffinatura, eseguire smascheramento dell'epitopo indotto da calore (HIER) e bloccare l'attività di perossidasi del tessuto come la procedura di protocollo Levansucrasi 3.3-3.5.
- Incubare con l'anticorpo primario primo della sequenza multisala ottimizzata, come precedentemente determinato utilizzando l'istruzione di IF Levansucrasi. In questo esempio, BCL-6, presso un 01:30 diluizione degli anticorpi diluente a temperatura ambiente per 60 min (Vedi Tabella materiali), fu il primo passo del protocollo multiplex. Lavare con tampone TBS-D per 5 min.
- Incubare con un anticorpo secondario marcato con HRP appropriato basato sulla specie dell'anticorpo primario utilizzato nella prima fase (Vedi Tabella materiali) a temperatura ambiente per 10 min. lavaggio con buffer di TBS-D per 5 min.
- Applicare l'ottimizzata basata su microarray fluorescente reagente (Cy5 in questo esempio, 1: 100 con il diluente di amplificazione, Vedi Tabella materiali) con incubazione a temperatura ambiente per 5 min. Dopo l'incubazione, lavare con tampone TBS-D per 5 min.
Nota: La scelta del reagente fluorescente basati su microarray è basata sulla Levansucrasi ottimizzato se. - Verificare l'efficienza di macchiatura dell'anticorpo primo utilizzando un microscopio appropriato (Vedi Tabella materiali).
Nota: Interim controlli di imaging può essere fatto con facilità se il campione è un TMA o singola diapositiva. Se, tuttavia, la macchia viene eseguita su più diapositive, questo può essere poco pratico, e questo passaggio può essere omesso. - Eseguire a microonde nuda per il secondo anticorpo nel protocollo, utilizzando condizioni ottimizzate nel passaggio Levansucrasi. Quindi, procedere con la colorazione del secondo anticorpo primario (qui, BCL2) con l'anticorpo secondario marcato con HRP e basati su microarray fluorescente reagente (qui, 520, Vedi Tabella materiali). Verificare l'efficienza di macchiatura sotto un microscopio a fluorescenza dopo il completamento del secondo turno di macchiatura.
- Allo stesso modo, ripetere la procedura utilizzando il terzo, quarto e quinto anticorpi nella sequenza (qui, c-Myc, CD20 e ki67, rispettivamente, con fluorofori 570, 540 e 620, rispettivamente). Eseguire controlli di imaging tra ogni passaggio, se fattibile.
- Aggiungere una colorazione nucleare (DAPI, diluizione 1: 100 in anticorpo diluente) per 10 min e, quindi, lavare 2x in TBS-D per 5 minuti ciascuno.
- Montare i vetrini di un reagente apposito materiale di montaggio.
6. preparazione dei vetrini libreria spettrale
Nota: Le sezioni 6-8 del presente protocollo sono univoci per multiplexati esperimenti che sono Imaging utilizzando una fotocamera spettrale.
- Creare Libreria diapositive (immagini di riferimento singolo-macchia) per ogni fluoroforo, DAPI e autofluorescenza sul tessuto stesso controllo, per essere utilizzato per analisi di immagini multispettrali.
- Taglio 2 x 3 µm-sottili sezioni del tipo tessuto di interesse (qui, un campione di linfoma o una tonsilla come controllo) utilizzando un microtomo e inserire le sezioni sulle lastre di vetro del microscopio rivestiti con poli-L-lisina.
- Processo sia diapositive utilizzando il protocollo Levansucrasi (con tutti stripping e fasi di lavaggio), ma senza aggiunta dell'anticorpo o fluorophore.
- Macchia una diapositiva con DAPI secondo passo 5.9 e lasciare una diapositiva senza macchia (per la generazione dello spettro di autofluorescenza del tessuto).
Nota: Le diapositive Levansucrasi ottimizzata (con una tintura di fluorescenza singola, senza DAPI) utilizzabile come libreria spettrale diapositive per generare gli spettri di ogni colorante di fluorescenza.
- La scansione di questi set di diapositive utilizzando filtri appropriati e caricarli nella libreria di analisi di immagine.
7. spectral Imaging
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Scansione di diapositive Levansucrasi
- Scegliere i filtri filtri disponibili standard epi-fluorescenza (DAPI, FITC, Texas Red, CY3 e CY5) appropriati per il fluoroforo autonomo.
Nota: I cubi di filtraggio raccomandato per specifici fluorofori utilizzati in questo esempio sono mostrati in tabella 215. - Esaminare ogni marcatore nel suo corrispondente canale di fluorescenza per identificare un tempo di esposizione adatto per ottenere un segnale pulito. Concentrarsi sul componente di tessuto che si suppone di avere il segnale più forte per il marcatore.
- Determinare un tempo di esposizione fisso per ciascun analita (anticorpo-fluoroforo combinazione), per consentire il confronto di croce-campione di intensità di pixel (anche se alcune piattaforme commerciali hanno strategie di normalizzazione per tenere conto delle differenze di esposizione).
- Per decidere su un tempo di esposizione fisso per un determinato canale, utilizzare un'impostazione telecamera live per regolare il tempo di esposizione fino a quando non esistono aree sovraesposta nell'immagine live della telecamera e ripetere questa operazione per tutti i canali.
- Dopo la scansione le diapositive Levansucrasi, generare immagini simulate campo chiaro (se la funzione è disponibile nel software utilizzato) per confrontare visivamente con il normale modello IHC e per determinare se il modello di macchiatura è corretta (Figura 1 e figura 2 ).
- Scegliere i filtri filtri disponibili standard epi-fluorescenza (DAPI, FITC, Texas Red, CY3 e CY5) appropriati per il fluoroforo autonomo.
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Scansione campioni multiplex (TMA diapositive / campioni multipli)
- Impostare i parametri ottici come descritto per la scansione di immagini Levansucrasi (punto 6.1). In primo luogo, regolare il fuoco manualmente o automaticamente (seguire le istruzioni dell'immagine specifica macchina di scansione). In secondo luogo, regolare il tempo di esposizione per ogni canale fluorescente per assicurare che tutti i core su un TMA, o tutte le aree in una diapositiva, sono esposti in modo appropriato.
Nota: L'area selezionata per regolare il tempo di esposizione è importante. Gli utenti devono scegliere la regione di segnale più forte per ogni filtro (cioè, il segnale di Ki67 è più forte nella regione centro germinale della tonsilla che nella regione centro di nongerminal; quindi, gli utenti dovrebbero utilizzare la regione centro germinale fissato a un'esposizione appropriata tempo). Gli utenti possono anche adottare una funzione di correzione di sovrasaturazione del sistema di imaging se disponibile. - Scansione di diapositive TMA in una modalità di scansione TMA se disponibili per il sistema di imaging, con un algoritmo di messa a fuoco automatica appropriato.
- Per le diapositive intero-tessuto sezione, ottenere le diapositive recensione da un patologo qualificato per selezionare immagini ottimali dalle zone più rappresentative del tumore.
Nota: Il protocollo qui descritto si basa su un sistema di analisi del microscopio/immagine definita (Vedi Tabella materiali). Ci sono altre macchine e software di analisi di immagine che può eseguire la scansione e analizzare multisala IHC diapositive7.
- Impostare i parametri ottici come descritto per la scansione di immagini Levansucrasi (punto 6.1). In primo luogo, regolare il fuoco manualmente o automaticamente (seguire le istruzioni dell'immagine specifica macchina di scansione). In secondo luogo, regolare il tempo di esposizione per ogni canale fluorescente per assicurare che tutti i core su un TMA, o tutte le aree in una diapositiva, sono esposti in modo appropriato.
8. analisi dei dati
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Preanalysis valutazione e pianificazione
- Utilizzare la diapositiva di riferimento per autofluorescenza per sottrarre autofluorescence dalle immagini digitalizzate per l'analisi.
- Rivedere le immagini prima di analisi per garantire che essi siano a fuoco e senza artefatti di colorazione.
- Utilizzare un marcatore tumorale (ad es., CD20 in questo esempio) per identificare le celle di interesse e per procedere con la segmentazione delle cellule, segnando e analisi dei lotti si avvicina. Selezionare cellule CD20-positive per l'analisi.
Nota: ad esempio, nel DLBCL campioni analizzati qui, l'impostazione e i parametri definiti per la segmentazione di cella si basano sulla dimensione nucleare e intensità ma sono specifiche per il software di analisi di immagine utilizzato (ad es., un DAPI media intensità di pixel di a almeno 0.05; dimensioni tra 80-320 pixel, con una sensibilità scissione a 2 [si tratta di un parametro specifico del software che si basa fortemente sulla morfologia del tumore: per le cellule di piccolo tumore, spaccare di 0,7 - 1 è appropriato; per grandi cellule del tumore, la scissione può essere regolata fino 4]). - Richiesta di patologo qualificato per esaminare singole immagini e decidere se segmentazione di tessuto è necessario selezionare regioni arricchita delle cellule del tumore ed escludere le regioni con cellule reattive abbondanti orand necrosi arearegion. Se la segmentazione tessuto supplementare è richiesta, quindi selezionare le regioni di controllo appropriato (ad esempio cellule/stroma/necrosi del tumore) e verifica che il software di analisi di immagine può identificare correttamente tali regioni
- Procedere con la segmentazione delle cellule dopo la segmentazione del tessuto (se presente), richiesta un patologo qualificato per rivedere la mappa di segmentazione delle cellule per garantire la fedeltà della segmentazione del prevista approccio5.
- Determinare il più biologicamente/clinicamente appropriato metodo di analisi per un biomarcatore dato di interesse (ad es., percentuale di positività o intensità media per cella).
- Selezionare un valore di cut-off per ogni indicatore (per la percentuale di positività).
- Determinare il valore di cut-off positivo di intensità ottica per ogni indicatore in combinazione con un patologo. Generare istogrammi analizzando la distribuzione di frequenza dell'indicatore intensità/cella di software di statistiche adeguate (Vedi Tabella materiali).
Nota: Un istogramma del valore di intensità in grado di offrire una panoramica della distribuzione delle intensità di segnale. - Determinare un taglio approssimativo dall'istogramma e verificarlo con una recensione di patologo, per correlare con cut-off manualmente determinati su immagini selezionate. In alcune situazioni, un cut-off singolo uniforme non sarà possibile a causa della variabilità nella macchiatura e un valore di cut-off manuale per ogni campione sarà richiesto.
Nota: La sezione 8.1 deve essere eseguita nel software di analisi di immagine (Vedi Tabella materiali) se non diversamente specificato.
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Marcatura di cellule positive e negative
- Per ogni indicatore di interesse, secondo il numero di cut-off determinato (attraverso istogrammi o manualmente), utilizzare un "se" o formula logica simile per marcare le cellule positive e negative con profondo valore: numero 1 per cellule positive, numero 0 per cellule negative.
- Per la positività di tutti i marcatori, moltiplicare il valore contrassegnato di ogni segno (1 o 0) con i prodotti in colonne separate. Se il prodotto è uguale a 1, significa che la cella è positiva per tutti gli indicatori. Per la positività e la negatività di un indicatore specifico, utilizzare un algoritmo di logica di IF.
Nota: Deve essere fatto in software di statistiche sezione 8.2 (Vedi Tabella materiali).
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Generazione di dati percentuale e dati numerici utilizzando una tabella pivot
- Generare dati di percentuale per gli indicatori specifici di interesse, all'interno di celle definite (ad es., cellule CD20-positive o cellule CD20-negative) (Figura 6).
- Inserire una tabella pivot nel foglio dati.
- Per calcolare la percentuale di positività di un singolo indicatore, ad esempio CD20, selezionare la funzione somma sotto la parte di valore della tabella pivot per contare il numero totale delle cellule CD20-positive utilizzando la somma del CD20+ cellule dividono per la numero totale delle cellule. Il risultato è il CD20+ cell percentuale all'interno di un core o numero uno studio (dipende dalla selezione della riga della tabella pivot).
- Calcolare la percentuale di positività dei marcatori multipli utilizzando lo stesso metodo (Figura 3).
- Generare dati numerici. Estrarre il conteggio normalizzato mediano per ogni marcatore di ogni core o ogni numero di studio ottenendo l'intensità media di ogni segno di interesse in tutte le cellule studiato all'interno di un campione (Figura 4).
Nota: Il valore mediano non può essere derivato direttamente nella tabella pivot. Può essere derivato utilizzando questa formula: mediana (IF (colonna di studio numero = numero di studio specifico, colonna del valore normalizzato)).
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Tracciare i dati in un grafico adatto
- Rappresentare graficamente i risultati della percentuale di positività o intensità mediana al marcatore in un tipo di cella di interesse in modo appropriato per ulteriori test statistici e presentazione.
- Creare grafici dot per fornire una visualizzazione dei numeri e la distribuzione.
Nota: Che rappresenta i dati con grafici a barre non trasmette le informazioni sulla distribuzione. Trame di stima sono consigliati anche come un buon metodo per la rappresentazione dei dati, con enfasi sulla grandezza della differenza tra i campioni16.
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Representative Results
immagini di MF-IHC per un campione DLBCL con C-MYC e riorganizzazione di gene BCL2 (doppio-colpisca linfoma) sono mostrati nella Figura 1. La figura 2 illustra le immagini simulate campo chiaro immunohistochemical. Figura 3 indica la generazione dei dati di percentuale. Figura 4 Visualizza i dettagli di una formula mediana per la generazione di dati numerici. Figura 5 Mostra l'applicazione di mf-IHC di un pannello di T-cellula in linfomi a cellule T angioimmunoblastico. Figura 6 Mostra l'immagine di ottimizzazione del campione di controllo tonsilla e l'analisi dei dati di questo esempio.
Figura 1: B-cellula multiplexed immagini pannello immunofluorescenza per un campione di linfoma (DLBCL) B-cellula diffuso grande con riorganizzazione di gene C-MYC e CL2 (doppio-colpisca linfoma). Magenta = CD20 (membrana); bianco = BCL2 (citoplasma); giallo = Ki67 (nucleare); verde = C-MYC (nucleare); rosso = BCL6 (nucleare), blu = DAPI (colorante di contrasto nucleare). Le cellule del tumore di CD20-positive mostrano un'alta espressione di C-MYC (80%) e BCL2 (> 90%), e l'indice di proliferazione Ki67 è elevata (90%). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: simulato immagini campo chiaro immunohistochemical (generate dalla Figura 1) dello stesso campione di DLBCL con riorganizzazione di gene C-MYC e BCL2 (doppio-colpisca linfoma). CD20 dimostra membrana colorazione nelle cellule del tumore. BCL2 Mostra citoplasma macchiatura > 90% delle cellule del tumore. La positività di C-MYC è circa l'80%. BCL6 Mostra nucleare colorazione in circa il 20% delle cellule. KI67 è positivo nel 90% delle cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: tabella Pivot illustra come generare dati di percentuale in base al numero di studio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: formula mediana per il valore normalizzato di Ki67 OD in base al numero di studio. L'istruzione IF individua tutti i numeri di studio che sono uguali a un numero di studio specifico (ovvero 52 in questa figura). Quindi, restituisce il valore corrispondente di Ki67 normalizzato . CTRL + MAIUSC + invio le combinazioni di tasti possono essere utilizzate per calcolare la mediana (Ki67 mediana) per questi valori restituiti, ovvero 11,56 per studio numero 52. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Multiplexed immagini pannello immunofluorescenza per un campione di linfoma (AITL) di angioimmunoblastic T-cell. (A) l'immagine composita dimostra l'eterogeneità cellulare di un campione AITL. Magenta = CD20 (membrana); giallo = CD4 (membrana); verde = PD1 (membrana); rosso = BCL6 (nucleare); ciano = CD8 (membrana); blu = DAPI (colorante di contrasto nucleare). (B) la riga superiore delle immagini Mostra una vista ingrandita della regione selezionata nella casella bianca in pannello A. La riga inferiore delle immagini Mostra il corrispondente segmentato maschere cella: giallo/rosso/verde che mostrano singole cellule CD4/BCL6/PD1-positive, rispettivamente. Il blu rappresenta le cellule negative, e bianco indica cellule doppio-positive. Le immagini rivelano che il 50% di CD4+ cellule sono PD1+ (sinistra, bianco), mentre il 20% di CD4+ cellule sono anche positive per BCL6 (medio, bianco). Il tasso di positività doppia per PD1 e BCL6 è circa il 10% (a destra, bianco). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Multiplexed immunofluorescenza ottimizzazione immagini per tessuto di controllo di tonsilla. (A) l'immagine composita Mostra l'area di centro germinale di un campione di controllo di tonsille. Giallo = C-Myc (nucleare); rosso = BCL6 (nucleare); ciano = BCL2 (citoplasma); Magenta = CD20 (membrana); verde = Ki67 (nucleare); blu = DAPI (colorante di contrasto nucleare). C-Myc è positivo solo in alcune cellule. BCL6 e Ki67 è positivo principalmente all'interno del centro germinale, mentre BCL2 è positivo soprattutto di fuori del centro germinativo. CD20 è diffuso positivo dentro e fuori il centro germinale. (B) la tabella mostra che cellule del centro germinativo CD20-positive sono anche positive per BCL6 e Ki67 ma la negazione per BCL2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Sequenza di macchiatura dell'anticorpo | Anticorpo primario (Vedi tabella dei materiali) | HIER totale richiesto | Macchia di effettivo pre HIER | Anticorpo secondario | Fluoroforo | Post-TSA anticorpo stripping |
| 1 | Mouse anti-Bcl6 (01:30, 60 min RT) | 25minuti, Ph9 | 25minuti, Ph9 | HRP-coniugato anti-topo, 1: 1000 ' per 10' | OPAL Cy5 a 1: 100 | 1 giro 100% potenza 1 min, 20% di potenza per 10min |
| 2 | Mouse anti-Bcl2(1:50,60 min RT) | 25minuti, Ph9 | Nessuno | HRP-coniugato anti-topo, 1: 1000 ' per 10' | OPAL 520 a 1: 100 | 1 giro 100% potenza 1 min, 20% di potenza per 10min |
| 3 | Rabbit anti-c-MYC(1:50,30 min RT) | 25minuti, Ph9 | Nessuno | HRP-coniugato anti-coniglio, 1: 1000 ' per 10' | OPAL 570 a 1: 100 | 1 giro 100% potenza 1 min, 20% di potenza per 10min |
| 4 | Mouse anti-CD20(1:2000,30 min RT) | 25minuti, Ph9 | Nessuno | HRP-coniugato anti-topo, 1: 1000 ' per 10' | OPAL 540 a 1: 100 | 1 giro 100% potenza 1 min, 20% di potenza per 10min |
| 5 | Mouse anti-Ki-67(1:50,45 min RT) | 30 minuti, Ph9 | 5 minuti pH9 | HRP-coniugato anti-topo, 1: 1000 ' per 10' | OPAL 620 a 1: 100 | 1 giro 100% potenza 1 min, 20% di potenza per 10min |
Tabella 1: esempio di un layout finalizzato per multiplex se macchiatura. Questa tabella fornisce un esempio di come specificare la quantità di HIER e basati su microonde stripping per essere fatto ad ogni passo, una volta che le macchie di Levansucrasi sono state ottimizzate.
Tabella 2: Guida verso la selezione del filtro per fluorofori. Questa tabella fornisce una guida approssimativa verso filtri appropriati che può essere utilizzato su apparecchiature specificate, di visualizzare fluorofori di interesse. Si raccomanda di controllare le specifiche del filtro del microscopio utilizzato in relazione il profilo di emissione/eccitazione di fluorofori utilizzati.
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Discussion
MF-IHC ha il potenziale per abilitare i patologi per perfezionare diagnosticcriteria in patologia linfoide e di analizzare il ruolo dei biomarcatori in tipi cellulari specifici verso un pronostico del risultato clinico. Come un nuovo metodo di ricerca, mf-IHC è sempre più applicate all'identificazione quantitativa e spaziale dei parametri immuni multipli del tumore le cellule17. La rilevazione di mf-IHC per la co-espressione di biomarcatori del tumore ha dimostrata di essere affidabile e riproducibile5. Tuttavia, la tecnologia rimane nascente e sono soggetti alla variabilità derivanti da reagente e/o fattori di tessuto-correlati, quali quelle dovute a un'incoerenza nella fissazione del tessuto e lavorazione.
Critica alla tecnica è l'uso di anticorpi e validati che sono specifici, sensibili e danno risultati riproducibili. Ci sono esempi nella letteratura degli anticorpi originariamente descritta per essere specifici per loro antigeni e più successivamente ha dimostrato di riconoscere proteine indipendenti attraverso l'uso di modelli knock-out14. Il metodo di convalida knock-out / knock-down in cui selvaggio-tipo o cellule con antigeni iperespresso servire come controlli positivi mentre le cellule con il target eliminato o abbattuto da siRNA o CRISPR vengono utilizzati come controlli negativi.
Come il convenzionale IHC, mf-IHC ha molte variabili critiche che devono essere ottimizzate per ogni esperimento, per la colorazione ottimale e risultati. Questi includono il pH della soluzione di smascheramento dell'antigene, la diluizione dell'anticorpo, l'assegnazione di un fluoroforo per ogni indicatore e la concentrazione del fluoroforo. Le soluzioni di recupero di antigene comunemente usati sono di pH 6 e 9. Vale la pena di verificare quali pH dà il pattern di colorazione ottimale e con meno priorità bassa intensità.
Non esistono specifiche linee guida per decidere sulla sequenza di applicazione anticorpo nell'esperimento multiplex in quanto dipende non solo l'affinità dell'anticorpo, ma anche sulla forza fluorophores opale. In generale, gli anticorpi con una debole affinità spesso richiedono le più alte concentrazioni basate sulla macchiatura Levansucrasi e vengono applicati per primi nella sequenza di multiplex. Gli anticorpi di forte affinità che rischiano di essere resistente alla spogliatura vengono applicati per ultimi, per evitare macchie non specifici. Per quanto riguarda la scelta di un fluoroforo specifico, è preferibile evitare l'uso di fluorofori con lunghezze d'onda spettrale simile per gli antigeni che colocalize nei compartimenti cellulari stessi. Antigeni con livelli di espressione bassa sono assegnati con la più brillante fluorofori e viceversa. Se, nel campione di studio, l'intensità del segnale è debole, la diluizione di TSA opale di regolazione può essere fatto per ottenere il segnale desiderato18. In alcuni casi, potrebbe funzionare cercando metodi di recupero differenti dell'antigene o l'aumento della concentrazione di anticorpo primario. La diluizione iniziale dell'anticorpo primario può essere lo stesso di quello stabilito in un esperimento IHC convenzionale. Tuttavia, se il segnale IF non è chiaro, la sperimentazione di altre diluizioni di anticorpo sarà richiesta, come le condizioni ottimizzate per IHC non sempre tradurre a se. L'intensità del segnale è influenzata dall'ordine o sequenza di immunostaining. Alcuni epitopi sono sovraesposte dopo due o tre turni di MWT, mentre alcuni possono degradare a causa di eccesso MWT. Alcuni fluorofori possono anche essere influenzata da MWT e devono essere testati per l'attenuazione.
Questo protocollo si concentra sulla colocalizzazione e la misurazione dell'intensità dei marcatori all'interno di sottopopolazioni di cellule in un linfoma maligno della B-cellula. Le sfide chiave nello sviluppo dell'attuale protocollo implicano la generazione di un pannello multiplex ottimizzata per gli antigeni che colocalize nei compartimenti cellulari stessi. Ci deve essere un'accurata unmixing di fluorofori per quantificazione precisa. Dopo aver effettuato il pannello multiplex, imaging di vetrini colorati è relativamente semplice. Il prossimo ostacolo comporta l'analisi dei dati acquisiti. A differenza negli studi di infiltrazione immuni, dove la quantificazione di tipi delle cellule immuni specifiche all'interno di un tumore epiteliale è semplice, gli studi di colocalizzazione nel linfoma si basano molto sulla definizione di positività da un patologo qualificato per ogni indicatore di interesse. La derivazione a un cut-off diagnostici appropriati che possono essere applicati alla pratica clinica di routine rimane un work in progress. Ulteriori perfezionamenti nei metodi di triangolazione di taglio automatizzato e normalizzazione dei dati sarà richiesti prima di questa tecnica può essere integrata nella diagnostica di routine.
Nonostante i limiti attuali, le potenziali applicazioni di mf-IHC e la conoscenza che può essere dedotta dallo studio delle cellule del tumore e le loro relazioni spaziali con il microambiente ne fanno uno strumento attraente, soprattutto per sfidare istologico tumori come malignità linfoide. Ulteriore lavoro è necessario stabilire protocolli nella fissazione del tessuto e lavorazione di tessuto che sono ottimali per il flusso di lavoro proposto, nonché un potenziamento nella macchiatura tecniche, per consentire l'analisi simultanea di un numero maggiore di obiettivi.
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Disclosures
A.d.j. ha ricevuto un finanziamento da PerkinElmer verso viaggi per riunioni di gruppo di utenti. Gli autori non hanno nessun altro conflitto di interessi di divulgare.
Acknowledgments
S.-B.N. e a.d.j. sono supportati da National Medical Research Consiglio transizione Awards di Singapore Ministero della salute (NMRC/TA/0020/2013 e NMRC/TA/0052/2016). Gli autori riconoscono un Yong Siew Yoon Research Grant per A.D.J National University Cancer Institute di Singapore verso l'acquisto di un microscopio di imaging spettrale di Vectra. Questo studio è approvato dal Singapore NHG dominio specifico Review Board B (2014/00693).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
References
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