Summary
Hier beschrijven we een protocol voor multiplex fluorescerende immunohistochemische kleuring en imaging voor de gelijktijdige localisatie van meerdere kanker-geassocieerde antigenen in lymfoom. Dit protocol kan worden uitgebreid tot de colocalization analyse van biomarkers binnen alle weefselsecties.
Abstract
Immunohistochemische (IHC) methoden voor de analyse van de in-situ van eiwit expressie door de lichte microscopie is een krachtig hulpmiddel voor zowel onderzoek en diagnostische doeleinden. Echter is de visualisatie en de kwantificering van meerdere antigenen in een enkele weefselsectie met behulp van conventionele chromogenic IHC uitdagend. Multiplexed imaging is vooral relevant in lymfoom onderzoek en diagnostiek, waar markeringen moeten worden geïnterpreteerd in de context van een complexe tumor communicatie. Hier beschrijven we een protocol voor multiplexed fluorescerende IHC kleuring zodat de kwantitatieve beoordeling van meerdere doelen in specifieke celtypen belangstelling lymfoom. De methode omvat aspecten van validatie van antilichaam, antilichaam optimalisatie, de multiplex optimalisatie met markeringen van lymfoom subtypen, de kleuring van weefsel microarray (TMA) dia's en het scannen van dia's, gevolgd door data-analyse, met specifieke verwijzing naar lymfoom. Met behulp van deze methode, worden scores voor zowel het gemiddelde intensiteit van een marker van belang en het percentage positiviteit gegenereerd om verdere kwantitatieve analyse. Multiplexing minimaliseert monster benutting en ruimtelijke informatie voor iedere markeerdraad van belang.
Introduction
Lymfoïde gezwellen worden veroorzaakt door de ongecontroleerde kwaadaardige proliferatie van lymfocyten. Deze cellen zijn essentiële componenten van het immuunsysteem en lokaliseren naar de primaire en secundaire immuun organen, zoals het beenmerg, lymfeklieren, milt en andere mucosa-geassocieerde lymfoïde systeem. Lymfoïde gezwellen zijn een heterogene groep van stoornissen die worden geclassificeerd gebaseerd op een constellatie van functies, waaronder morfologie, immunophenotype, genetische kenmerken, en klinische presentatie. Terwijl elke parameter een rol speelt, afkomst blijft een kenmerkend en vormt de basis voor de WHO classificatiesysteem die gezwellen afgeleid van natural killer (NK) cellen1, B-cellen en T-cellen herkent.
Sleutel tot de classificatie van lymfoom is de karakterisatie van de antilichamen tegen leukocyten oppervlakte merkers van de verschillende subtypen van lymfocyten2. Immunohistochemistry (IHC) heeft van oudsher wordt gebruikt voor de analyse van deze markers en is gebaseerd op het beginsel van de erkenning van de specifieke antigeen-antilichaam aan de cel - en weefsel-gebaseerde moleculen die kunnen worden gevisualiseerd door de lichte Microscoop detecteren 3. de identificatie van meerdere doelen voor een enkele dia door conventionele helder-veld chromogenic multiplex IHC heeft echter beperkingen omdat het vaak moeilijk te onderscheiden van meerdere signalen van de kleur op een enkele weefselsectie betrouwbaar — met name voor antigenen met een zeer lage expressie4. Visuele beoordeling en kwantificering van kleuring kunnen ook subjectief, variabiliteit veroorzaakt in de analyse en data interpretatie5.
Conventionele IHC op monsters van formaline-vaste, paraffine-ingebedde (FFPE) dus niet haalbaar voor de simultane detectie van meerdere doelen in via het immuunsysteem veroorzaakte uiteenlopende ziekten zoals lymfoom. Bovendien is het vaak onnauwkeurig neoplastische lymfocyten van de omliggende immuuncellen onderscheid te maken. Dit belemmert de studies te kijken naar de relevantie van nieuwe biomarkers in lymfoom. In dit verband, multiplex fluorescerende IHC (mf-IHC) biedt een veelbelovend alternatief als hierdoor de kwantitatieve beoordeling van antigeen coexpression en een ruimtelijke relatie met hogere precisie terwijl het behoud van de beperkte monsters6,7. Wanneer deze imaging technologie is een partnerschap aangegaan met de software van de analyse van de digitale beelden, de data interpretatie bestaat efficiënter en vergemakkelijkt de studie van de tumor en communicatie heterogeniteit8,9. In dit protocol, een tyramide gebaseerde immunofluorescentie (IF) Multiplex methode wordt toegepast op het signaal versterken en is compatibel met elke IHC-gevalideerde antilichaam van elke soort die host, zelfs die zijn ontwikkeld in de dezelfde soort5,7 , 10. de tyramide-gebaseerd protocol voorziet in de directe Woordherkomst en-opbouw van de fluorophore aan het weefsel van belang zodat de primaire en secundaire antilichaam kan worden gestript na elke stap, waardoor de sequentiële toepassing van meerdere vlekken zonder antilichaam Kruisallergie.
Een multiplexed strategie zal zitten nuttig voor het voorspellen van de resultaten van de prognose en behandeling door het identificeren van doelstellingen en hun variant immunologische patronen in lymfomen. Multiplex TL IHC is toegepast in ons lab voor de studie van een panel van T en B-lymfocyt markers en T-folliculaire helper markeringen in angioimmunoblastic T-cel lymfoom (AITL), een subtype van een perifere T-cel lymfoom gekenmerkt door agressieve klinische gedrag en tumor heterogeniteit11. Het nut van deze methode wordt ook geïllustreerd in diffuus grote B-cel lymfoom (DLBCL) waar de toegenomen signalering van een B-cel receptor met gelijktijdige C-MYC en BCL-2 uitdrukking het potentiële therapeutische gebruik van Bruton van tyrosine kinase remming suggereert 12 .
Hier beschrijven we het gehele protocol van antilichaam validatie bij de selectie van passende controlemaatregelen weefsels en multiplex met behulp van lymfoom FFPE weefsels, met een eventuele analyse van gebeitst dia's met behulp van een standaardscanoptie geautomatiseerde kwantitatieve pathologie imaging systeem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle weefsels in dit protocol gebruikt werden verkregen onder de Singapore NHG domein specifieke Review Board B 2014/00693 studie.
1. selectie en validatie van antilichamen
Opmerking: Voordat u verdergaat met de instelling van een multiplexed panel, zorgen dat alle antilichamen vlek krachtig, identificeren van alleen de doel-antigeen van belang. Het doel is het selecteren van antilichamen die specifiek het antigeen van belang in weefselsecties wordt herkend.
- Voor een antilichaam met een gevestigde onderzoek gebruik of klinische routinegebruik in IHC, aandoeningen zoals epitoop ophalen en antilichaam verdunning te bevestigen door het uitvoeren van conventionele IHC5,13 op positieve en negatieve controle weefsel secties. Voor weefselsecties van menselijke oorsprong, zorgen ervoor dat de juiste ethiek speling op plaats alvorens aan te vangen experimenten.
Opmerking: Positieve controles zijn weefsels die verwachting uitspreken het antigeen van belang, en negatieve controles zijn die dat niet doen. Goedaardige tonsillen weefsel is gekozen als een goede weefsel besturingselement voor lymfoom antigenen omdat het bevat een mengsel van immune cellen, met inbegrip van B-cellen, T-cellen, cellen antigeen-presenteren, alsmede stromale en epitheliale cellen. Deze laatste dienen als nuttig negatieve interne controles. - Voor onbekende doelen of voor commerciële antilichamen met onvoldoende gepubliceerde gegevens, uitvoeren van antilichaam validatie door het creëren van gecompenseerde positieve en negatieve controle FFPE cel blokkeert14, met behulp van CRISPR knock-out of siRNA knock-down van het antigeen van belang in een geschikte cellijn door standaard moleculaire biologietechnieken. Gebruik deze FFPE cel blokken in plaats van positieve en negatieve controle weefsels voor conventionele IHC per stap 1.1.
Opmerking: HeLa of 293T cellen worden vaak gebruikt voor antigenen die niet celtype specifieke, zoals lymphoma cellijnen moeilijk zijn te transfect. Voor antigenen die specifieke lymfocyt, lymphoma cellijnen bruikbaar met virale transductie of electroporation als de wijze van levering van het gen (zij het met lage effectiviteit).
2. planning van de volgorde van antilichamen en Fluorophores voor het Multiplex paneel
- Plan de volgorde van de reagentia voor de definitieve multiplex kleuring. Bijvoorbeeld, was hier de volgorde voor het multiplex protocol aanvankelijk gepland als eerste, Bcl-6; tweede, Bcl-2; Ten derde: C-Myc; vierde, CD20; Ten vijfde, Ki67.
Opmerking: Om te beslissen over de volgorde, antilichamen met een zwakke affiniteit vereisen hogere concentraties moeten worden gekleurd eerst in de definitieve multiplex kleuring. Hoge-affiniteit antilichamen die dreigen te worden resistent tegen meerdere rondes van magnetron strippen worden laatst in het multiplex protocol om te voorkomen dat niet-specifieke kleuring toegepast. - Plan de fluorophore partner voor elke antilichaam in het deelvenster. Zie tabel 1 en Tabel van materialen voor de keuzes in het volgende voorbeeld.
Opmerking: Om te beslissen over de fluorophore partner voor elke antilichaam, kies spectraal verschillende fluorophores voor antilichamen met vergelijkbare patronen van lokalisatie binnen de cel en weefsel. Dit zal minimaliseren spectrale overlap en moeite met randverwijdering.
3. Monoplex Tyramide gebaseerde als in een gesimuleerde 5-plex Multiplex Panel
Opmerking: In dit voorbeeld, het protocol voor CD20 is besproken, die is gepland als het vierde antilichaam in een multiplex volgorde zoals hierboven beschreven. Het aantal extra strippen stappen zullen verschillend zijn voor de positie van het antilichaam in de reeks.
- Knipt van 3 µm-dunne lagen van weefsel van de positieve en negatieve controle gebruikend microtome en plaatst u de secties op poly-L-lysine-coated Microscoop glas dia's.
- Dewax van de secties met behulp van een passende clearing oplossing 3 x voor elke 4 min. Hydrateren de dia's in 100% alcohol, alcohol van 90% en 70% alcohol, elke 4 min. Zet de dia's in gedestilleerd water gedurende 2-3 minuten.
- Plaats de dia's in een magnetron-safe glazen pot in een standaard antigeen ophalen buffer (Los verkrijgbaar) om het onderdompelen van de dia's. Uitvoeren van warmte-geïnduceerde epitoop ophalen (HIER) met behulp van een geschikte magnetron, in de oplossing van de gegevensherwinning van pH9 antigeen bij 98 ° C gedurende 25 minuten.
Opmerking: Een magnetron met een druk variërend van 800-1100 watt kan worden gebruikt, en HIER kan dienovereenkomstig worden geoptimaliseerd. In dit geval werd een multifunctionele magnetron weefsel processor (open lucht) gebruikt voor HIER en strippen. De begininstellingen voor het ophalen van een specifieke epitope zijn gebaseerd op de voorkennis van conventionele IHC. - Het uitvoeren van extra rondes van magnetron strippen (drie in dit geval, voor het vierde antilichaam in een deelvenster), elke ronde met 100% tot 98 ° C en 20% macht voor 10 min om op dezelfde temperatuur te houden. De dia's in gedestilleerd water gedurende minstens 10 minuten afkoelen.
Opmerking: Voer meerdere rondes van magnetron strippen tijdens de monoplex als stap om de doel-antigeen tot hetzelfde aantal stappen zoals in de voorgestelde multiplex verwarming bloot te stellen. Aangezien CD20 is gepland als het vierde antilichaam, magnetron strippen 3 x vóór en één keer na het doen van de incubatie met primair antilichaam. - Controleren en aanvullen van de buffer na elke 5 min tijdens het strippen van de extra magnetron. Nog belangrijker is, laat geen dia's tijdens de meerdere strippen procedures uitdrogen. Bij het nemen van de dia's uit de magnetron, gebruik pincet en hittebestendige handschoenen om ze te plaatsen in een aparte pot gedestilleerd water. Wacht tot de oplossing van de gegevensherwinning antigeen afkoelen natuurlijk.
- Blokkeer de weefsel peroxidase activiteit met behulp van een commerciële peroxidase blok voor 10 min (3% waterstofperoxide kan worden gebruikt als een alternatieve reagens). Wassen met Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) en een nonionic wasmiddel voor 5 min.
Nota: TBS is samengesteld uit 50 mM Tris-Cl, pH 7.5 en 150 mM NaCl.TBS te maken van de TBS-D. - Blok met antilichaam verdunningsmiddel of bovien serumalbumine gedurende 15 minuten gevolgd door incubatie met het primaire antilichaam van belang (b.v.CD20, 1:2,000 verdunning in antilichaam verdunningsmiddel, Zie Tabel van materialen) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten wassen 3 x met TBS-D buffer voor 5 minuten elke keer. Er moet voldoende TBS-D buffer om onder te dompelen de dia volledig in alle stappen van het wassen.
Opmerking: Bovien serumalbumine kan worden gebruikt als een alternatieve antilichaam verdunningsmiddel. Het volume van antilichaam verdunningsmiddel hangt af van de grootte van het weefsel, variërend van 50 µL (voor biopsie monsters) tot 400 µL (voor excisie weefsel microarray monsters of). - Incubeer met een passende horseradish peroxidase (HRP)-gelabelde secundair antilichaam, gekozen op basis van de soort van oorsprong van het primaire antilichaam gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Wassen 3 x met TBS-D buffer voor 5 minuten elke keer.
- Toepassing van een geschikt tyramide gebaseerde fluorescerende reagens (1:100 in versterking verdunningsmiddel) en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten, zodat de geconjugeerde van de fluorophore aan het weefsel monster op de sites van primair antilichaam binding. Wassen 3 x met TBS-D buffer voor 5 minuten elke keer.
- Een extra magnetron gebaseerde strippen om het verwijderen van de primaire en secundaire antilichaam uitvoeren Herhaal zo vaak als nodig op basis van de positie van het antilichaam in de reeks.
- Plaats de dia in gedistilleerd water om af te koelen. Incubeer met DAPI (1:100 verdunning in antilichaam verdunningsmiddel) gedurende 10 min, gevolgd door wassen 3 x met TBS-D buffer voor 5 minuten elke keer. Droog het gebied op de dia zonder het weefsel met doekjes en monteer de dia met de juiste montage media.
- Afbeelding van de dia (Zie de punten 6 en 7 van dit protocol) en het bepalen van de geschiktheid van de kleuring (zoals gedefinieerd door duidelijke discriminatie van het weefsel van de positieve en negatieve controle).
Opmerking: Als de kleuring patroon onjuist is, opnieuw de monoplex kleuring na het aanpassen van een of meer van de volgende parameters: het aantal warmte ophalen stappen, de hoeveelheid warmte ophalen, de incubatie periode/concentratie van antilichamen (primaire en secundaire), de positie van antilichaam in de reeks en de keuze van de fluorophore. De monoplex kleuring stap meestal vereist meerdere rondes van optimalisering te verkrijgen van een geschikt aantal parameters voor de juiste kleuring. Het is raadzaam om het testen van een aantal fluorophores met elke primair antilichaam, zoals dit voor flexibiliteit zorgen zal bij het bepalen van de uiteindelijke set van multiplex.
4. herhaling van de Monoplex voor elke antilichaam in het Multiplex Protocol
- Herhaal de monoplex kleuring voor de andere antistoffen op een vergelijkbare manier door het aantal magnetron strippen stappen, op basis van de positie van het antilichaam in de volgorde aan te passen. Bijvoorbeeld, bij het uitvoeren van monoplex voor het derde antilichaam in een zes-plex multiplex panel kleuring, voeren twee magnetron strippen stappen vóór en drie magnetron strippen stappen na de incubatie met primair antilichaam.
Opmerking: Het is belangrijk te begrijpen dat de magnetron gebaseerde strippen van antilichamen ook bloot van het monster, tot HIER. Als een specifiek antilichaam een verschillende epitoop ophalen strategie vereist, moet dit rekening worden gehouden bij de planning van de multiplex volgorde. In dit voorbeeld vereist Ki67 epitoop ophalen pH 9, voor 30 min. Sinds 25 min van HIER zal gebeuren vóór KI67 vlekken in het protocol van de sequentiële, alleen een extra 5 min van HIER zijn nodig.
5. multiplex kleuring Protocol
Opmerking: Ga verder met de multiplex kleuring protocol pas nadat alle onderdelen zijn geoptimaliseerd met behulp van monoplex als kleuring. Bekijk de resultaten van de kleuring van de monoplex en het ontwerp van een tabel met de uiteindelijke lay-out van de orde van multiplex en de keuze van fluorophore voor elke antilichaam. De details van antilichaam concentratie, de duur van de kleuring, en de volgorde en de aard van warmte ophalen voor elke antilichaam die hier gebruikt wordt gegeven in tabel 1.
- Knippen 3 µm-dunne secties van positieve en negatieve controle weefsel, alsmede als het doelweefsel van belang (hier, FFPE monsters van lymfoom), gebruikend microtome, en plaats van de secties op poly-L-lysine-coated Microscoop glas dia's (Zie Tabel van materialen).
Opmerking: De opneming van de positieve en negatieve controles voor elke antilichaam in het deelvenster is aan te raden, samen met de werkelijke monsters voor multiplex. Dit zorgt voor een bevestiging dat de kleuring protocol correct is uitgevoerd. - Dewax, uitvoeren van warmte-geïnduceerde epitoop ophalen (HIER) en blokkeren van weefsel peroxidase activiteit zoals in het monoplex protocol stappen 3.3-3.5.
- Incubeer met de eerste primair antilichaam van de geoptimaliseerde multiplex reeks, zoals eerder bepaald met behulp van de monoplex als stap. In dit voorbeeld, BCL-6, op een 1:30 verdunning in antilichaam verdunningsmiddel bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten (Zie Tabel of Materials), was de eerste stap van het multiplex protocol. Wassen met TBS-D buffer voor 5 min.
- Incubeer met een passende HRP-gelabeld secundair antilichaam gebaseerd op de soorten het primaire antilichaam gebruikt in de voorafgaande stap (Zie Tabel van materialen) bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten wassen met TBS-D buffer voor 5 min.
- Toepassing van de geoptimaliseerde tyramide gebaseerde fluorescerende reagens (Cy5 in dit voorbeeld, 1:100 in versterking verdunningsmiddel, Zie Tabel van materialen) met incubatie bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Na de incubatie, wassen met TBS-D buffer voor 5 min.
Opmerking: De keuze van de tyramide gebaseerde fluorescerende reagens is gebaseerd op de geoptimaliseerde monoplex als. - Controleren van de doeltreffendheid van de kleuring van het eerste antilichaam met behulp van een passende Microscoop (Zie Tabel van materialen).
Opmerking: Interim imaging controles kan worden gedaan met gemak als het monster een TMA of één dia. Als de vlek wordt echter uitgevoerd op meerdere dia's, wellicht is dit onpraktisch, en deze stap kan worden weggelaten. - Magnetron strippen voor het tweede antilichaam in het protocol, met behulp van voorwaarden geoptimaliseerd in de monoplex stap uitvoeren Ga vervolgens verder met de kleuring van de tweede primaire antilichaam (hier BCL2) met de HRP-gelabeld secundair antilichaam en tyramide gebaseerde fluorescerende reagens (hier, 520, Zie Tabel van materialen). Controleer de efficiëntie van de kleuring onder een fluorescente microscoop na de voltooiing van de tweede ronde van de kleuring.
- Evenzo, herhaalt u de procedure met behulp van de derde, vierde en vijfde antilichamen in de reeks (hier, c-Myc CD20 en ki67, respectievelijk met fluorophores 570, 540 en 620, respectievelijk). Controles beeldvorming tussen elke stap indien mogelijk.
- Toevoegen van een nucleaire counterstain (DAPI, 1:100 verdunning in antilichaam verdunningsmiddel) gedurende 10 minuten en daarna 2 x wassen in TBS-D voor elke 5 minuten.
- Monteer de dia's met behulp van een juiste montage reagens.
6. bereiding van spectrale bibliotheek dia 's
Opmerking: Secties 6-8 van dit protocol zijn uniek voor multiplexed experimenten die zijn beeld met behulp van een spectrale camera.
- Maak bibliotheek dia's (single-vlek referentie afbeeldingen) voor elke fluorophore, DAPI en autofluorescence op de dezelfde controle-weefsel, moet worden gebruikt voor beeldanalyse van het multispectrale.
- 2 x 3 µm-dunne secties van het weefseltype van belang (hier, een lymfoom monster of een tonsillen als besturingselement) gesneden gebruikend microtome en plaats van de secties op poly-L-lysine-coated Microscoop glas dia's.
- Proces beide dia's met behulp van het monoplex-protocol (met alle strippen en wassen stappen), maar zonder antilichaam of fluorophore toevoeging.
- Vlekken van één dia met DAPI per stap 5,9 en laat één dia onbevlekt (voor de generatie van het weefsel autofluorescence spectrum).
Opmerking: De geoptimaliseerde monoplex dia's (met een enkele fluorescentie kleurstof, zonder DAPI) kunnen worden gebruikt als spectrale bibliotheek dia's voor het genereren van spectra van elke kleurstof fluorescentie.
- Scan deze set dia's met behulp van geschikte filters en hen te uploaden naar de beeldbank van de analyse.
7. spectrale Imaging
-
Scannen van monoplex dia 's
- Kies de filters uit beschikbare standaard epi-fluorescentie filters (DAPI, FITC CY3, Texas Red en CY5) geschikt is voor de werknemer fluorophore.
Opmerking: De aanbevolen filter kubussen voor specifieke fluorophores gebruikt in dit voorbeeld worden weergegeven in tabel 215. - Onderzoeken van iedere markeerdraad in haar overeenkomstige fluorescentie kanaal te identificeren van een geschikte belichtingstijd te verkrijgen van een schoon signaal. Focus op het weefsel-onderdeel dat wordt verondersteld om het sterkste signaal voor de markering.
- Een vaste belichtingstijd voor elke analyt (antilichaam-fluorophore combinatie), bepalen dat kruis-monster vergelijking van pixel intensiteit (hoewel sommige commerciële platformen heb normalisatie strategieën ter verantwoording voor verschillen in blootstelling).
- Gebruik een live camera-instelling aan te passen de belichtingstijd zolang er geen overbelichte gebieden niet te in de live camera beeld zijn om te beslissen over een vaste belichtingstijd voor een bepaald kanaal, en herhaal dit voor alle zenders.
- Na het scannen van monoplex dia's, gesimuleerde helderveld afbeeldingen genereren (als deze functie beschikbaar in de software gebruikt is) naar visueel vergelijken met het normale patroon van de IHC en om te bepalen als de kleuring patroon correcte (Figuur 1 en figuur 2 is ).
- Kies de filters uit beschikbare standaard epi-fluorescentie filters (DAPI, FITC CY3, Texas Red en CY5) geschikt is voor de werknemer fluorophore.
-
Scannen van multiplex monsters (TMA dia's / meerdere monsters)
- De optische parameters instellen zoals beschreven voor het scannen van monoplex beelden (stap 6.1). Ten eerste, het aanpassen van de focus handmatig of automatisch (volg de instructies van de specifieke afbeelding scannen van de machine). Ten tweede, pas de belichtingstijd voor elk fluorescerende kanaal om ervoor te zorgen dat alle de cores op een TMA of alle gebieden op een dia, op de juiste manier worden blootgesteld.
Opmerking: Het gebied geselecteerd om de blootstellingstijd is belangrijk. Gebruikers moeten kiezen van het sterkste signaal regio voor elk filter (dat wil zeggen, het Ki67 signaal is sterker in de tonsillen germinal center regio dan in de nongerminal center regio; vandaar gebruikers de germinal center regio vastgesteldop een passende belichting moeten gebruiken tijd). Gebruikers kunnen ook het aannemen van een functie van de correctie van het overbelichtingseffecten van de imaging systeem indien beschikbaar. - Scan TMA dia's onder een TMA scanmodus indien beschikbaar in de imaging systeem, met een passende autofocus-algoritme.
- Voor geheel-weefselsectie dia's, krijgt u de dia's beoordeeld door een gekwalificeerde patholoog optimale om afbeeldingen te selecteren uit de meest representatieve gebieden van de tumor.
Opmerking: Het protocol hier beschreven is gebaseerd op een gedefinieerde Microscoop/image analysesysteem (Zie Tabel van materialen). Er zijn andere machines en software van de analyse van het beeld die kan scannen en analyseren van multiplex IHC dia's7.
- De optische parameters instellen zoals beschreven voor het scannen van monoplex beelden (stap 6.1). Ten eerste, het aanpassen van de focus handmatig of automatisch (volg de instructies van de specifieke afbeelding scannen van de machine). Ten tweede, pas de belichtingstijd voor elk fluorescerende kanaal om ervoor te zorgen dat alle de cores op een TMA of alle gebieden op een dia, op de juiste manier worden blootgesteld.
8. de gegevensanalyse
-
Preanalysis evaluatie en planning
- Gebruik de referentie dia voor autofluorescence aftrekken van de autofluorescence van de afbeeldingen die zijn gescand voor analyse.
- Controleer of de beelden vóór de analyse om ervoor te zorgen dat ze in-focus en zonder kleuring van artefacten.
- Gebruik een tumormarker (bijvoorbeeldCD20 in dit voorbeeld) cellen van belang worden geïdentificeerd en om verder te gaan met de segmentering van de cel, scoren en batchanalyse benadert. Selecteer CD20-positieve cellen voor de analyse.
Opmerking: bijvoorbeeld in de DLBCL monsters geanalyseerd hier, de instelling en de parameters die zijn gedefinieerd voor de segmentering van de cel zijn gebaseerd op de grootte van de nucleaire en intensiteit, maar zijn specifiek voor de afbeelding analysesoftware gebruikt (bijvoorbeeldeen DAPI bedoel pixel intensiteit van op minste 0.05; omvang tussen 80-320 pixels, met een splitsing gevoeligheid op 2 [dit is een software-specifieke parameter die op de morfologie van de tumor leunt: voor kleine tumorcellen, splitsing van 0,7 - 1 past; voor grote tumorcellen splitsen kan worden aangepast op tot en met 4]). - Verzoek om gekwalificeerde patholoog afzonderlijke beelden bekijken en beslissen of weefsel segmentatie is vereist om te selecteren tumor cel verrijkt regio's en regio's met necrose arearegion orand overvloedige reactieve cellen uitsluiten. Als extra weefsel segmentatie vereist is, dan selecteert u passende controlemaatregelen regio's (zoals tumor cellen/stroma/necrose) en controleer dat de software van de analyse van de afbeelding correct dergelijke regio's herkent
- Doorgaan met de segmentering van de cel na weefsel segmentatie (indien aanwezig), een gekwalificeerde patholoog te herzien van de cel segmentatie kaart om ervoor te zorgen de getrouwheid van de segmentering van de beoogde aanpak5verzoek.
- Het bepalen van de meest biologisch/klinisch passende analysemethode voor een bepaalde biomarker van belang (b.v., percentage positiviteit of gemiddelde intensiteit per cel).
- Selecteer een cut-off waarde voor iedere markeerdraad (voor percentage positiviteit).
- Bepaal de optische intensiteit positief cut-off waarde voor iedere markeerdraad in combinatie met een patholoog. Histogrammen te genereren door het analyseren van de frequentieverdeling van de marker intensiteit/cel in relevante statistische gegevens software (Zie Tabel van materialen).
Opmerking: Een histogram van de waarde intensiteit kan bieden een overzicht van de verdeling van de intensiteit van het signaal. - Bepalen van een geschatte licht-donkerscheiding van het histogram en controleer of dit door een patholoog te correleren met handmatig bepaald cut-offs op geselecteerde afbeeldingen. In sommige situaties een uniforme interne cut-off zal niet mogelijk zijn als gevolg van de variabiliteit in de kleuring en een handmatige cut-off waarde voor elk monster zal worden vereist.
Opmerking: Sectie 8.1 moet gebeuren in de software van de analyse van de afbeelding (Zie Tabel van materialen) tenzij anders aangegeven.
-
Positieve en negatieve cellen markeren
- Voor iedere markeerdraad van belang, volgens het nummer van de licht-donkerscheiding bepaald (door histogrammen of handmatig), gebruiken een "IF" of soortgelijke logica formule naar aanleiding van de positieve en negatieve cellen met waarde aangegeven: nummer 1 voor positieve cellen, nummer 0 voor negatieve cellen.
- Voor de positiviteit van alle markeringen, vermenigvuldigt u de gemarkeerde waarde van iedere markeerdraad (1 of 0) met de producten in afzonderlijke kolommen. Als het product gelijk is aan 1, betekent het dat de cel is positief voor alle markeerders. Gebruik een algoritme van de logica als voor de positiviteit en negativiteit van een specifieke marker.
Opmerking: Punt 8.2 vallen dient te gebeuren in statistieken software (Zie Tabel van materialen).
-
Genereren van percentage en numerieke gegevens met behulp van een draaitabel
- Genereren van gegevens van het percentage voor specifieke markers van belang, binnen de gedefinieerde cellen (bijvoorbeeld, CD20-positieve cellen of CD20-negatieve cellen) (Figuur 6).
- Een draaitabel in het gegevensblad invoegen.
- Voor de berekening van het percentage van de positiviteit van een enkele gegevensmarkering, zoals CD20, selecteert u de functie som onder het deel van de waarde van de draaitabel te tellen het totale aantal CD20-positieve cellen met behulp van de som van de CD20+ cellen gedeeld door de het nummer van de cel totaal. Het resultaat is de CD20+ cel percentage binnen één core of een studie nummer (afhankelijk van de selectie van de pivot tabelrij).
- Bereken het percentage van de positiviteit van meerdere markeringen gebruikend de zelfde methode (Figuur 3).
- Numerieke gegevens te genereren. Pak de gemiddelde genormaliseerde tellen voor iedere markeerdraad van elke core of elk studie-nummer door het verkrijgen van de gemiddelde intensiteit van iedere markeerdraad van belang in alle cellen binnen een steekproef (Figuur 4) studeerde.
Opmerking: De mediane waarde kan niet worden afgeleid in de draaitabel direct. Kan worden afgeleid met behulp van deze formule: mediaan (IF (kolom van studie getal = specifieke studie nummer, kolom van genormaliseerde waarde)).
-
De gegevens in een geschikt grafiek plotten
- Uitzetten van de resultaten van het percentage positiviteit of gemiddelde intensiteit per markering in een celtype van belang op passende wijze voor verdere statistische testen en presentatie.
- Maak dot plots te verstrekken een visualisatie van aantallen en distributie.
Opmerking: Vertegenwoordigen van gegevens met staafdiagrammen doet niet overbrengen informatie over de distributie. Schatting percelen worden ook aanbevolen als een goede methode voor gegevens representatie, met nadruk op de omvang van het verschil tussen monsters16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MF-IHC beelden voor een DLBCL monster met C-MYC en BCL2 gen omlegging (dubbel-hit lymfoom) worden weergegeven in Figuur 1. Figuur 2 illustreert de gesimuleerde helder-veld immunohistochemische beelden. Figuur 3 geeft de generatie van percentage gegevens. Figuur 4 geeft de details van een mediane formule voor de generatie van numerieke gegevens. Figuur 5 toont de toepassing van mf-IHC van een T-cel-panel in angioimmunoblastic T-cel lymfomen. Figuur 6 toont het beeld van de optimalisatie van de tonsillen controlemonster en de data-analyse voor dit voorbeeld.
Figuur 1: B-cel multiplexed immunofluorescentie deelvenster afbeeldingen voor een diffuus grote B-cel lymfoom (DLBCL) monster met C-MYC en CL2 gene omlegging (dubbel-hit lymfoom). Magenta = CD20 (membraan); wit = BCL2 (cytoplasma); geel = Ki67 (nucleaire); groen = C-MYC (nucleaire); rood = BCL6 (nucleaire), blauw = DAPI (nucleaire counterstain). De tumorcellen CD20-positieve Toon een hoge expressie voor C-MYC (80%) en BCL2 (> 90%), en de Ki67 proliferatie index is ook hoog (90%). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: helder-veld immunohistochemische beelden (gegenereerd uit Figuur 1) gesimuleerd van hetzelfde DLBCL monster met C-MYC en BCL2 gen omlegging (dubbel-hit lymfoom). CD20 toont membraan vlekken in de tumorcellen. BCL2 toont cytoplasma kleuring > 90% van de tumorcellen. C-MYC positiviteit is ongeveer 80%. BCL6 toont nucleaire vlekken in ongeveer 20% van de cellen. Ki67 is positief in 90% van de cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Pivot tabel waarin wordt beschreven hoe Genereer percentage gegevens volgens studie nummer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: mediaan formule voor de genormaliseerde Ki67 OD-waarde volgens studie nummer. De instructie als alle getallen van de studie die gelijk is aan een aantal specifieke studie (dat is 52 in deze afbeelding) aangetroffen. Vervolgens wordt de overeenkomstige Ki67 genormaliseerde waarde geretourneerd. CTRL + Shift + Enter toetsencombinaties kunnen worden gebruikt voor de berekening van de mediaan (Ki67 mediaan) voor deze geretourneerde waarden, oftewel 11.56 voor studie nummer 52. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Multiplexed immunofluorescentie deelvenster afbeeldingen voor een monster angioimmunoblastic T-cel lymfoom (AITL). (A) de samengestelde afbeelding toont de cellulaire heterogeniteit van een AITL monster. Magenta = CD20 (membraan); geel = CD4 (membraan); groen = PD1 (membraan); rood = BCL6 (nucleaire); cyaan = CD8 (membraan); blauw = DAPI (nucleaire counterstain). (B) de bovenste rij van beelden toont een vergrote weergave van de regio die is geselecteerd in het witte vak in deelvenster A. De onderste regel van beelden toont de overeenkomstige gesegmenteerde cel maskers: geel/rood/groen tonen enkele CD4/BCL6/PD1-positieve cellen, respectievelijk. Negatieve cellen vertegenwoordigt die op blauw en wit geeft dubbel-positieve cellen. De beelden openbaren dat 50% van CD4+ cellen zijn PD1+ (links, wit), terwijl 20% van CD4+ cellen zijn ook positief voor BCL6 (midden, wit). De dubbele positiviteit tarief voor PD1 en BCL6 is ongeveer 10% (rechts, wit). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Multiplexed immunofluorescentie optimalisatie beelden voor tonsillen controle weefsel. (A) de samengestelde afbeelding toont de germinal centrum-gebied van een controlemonster tonsillen. Geel = C-Myc (nucleaire); rood = BCL6 (nucleaire); cyaan = BCL2 (cytoplasma); magenta = CD20 (membraan); groen = Ki67 (nucleaire); blauw = DAPI (nucleaire counterstain). C-Myc is positief alleen in een paar cellen. BCL6 en Ki67 zijn positief voornamelijk binnen het germinal center, terwijl BCL2 positief voornamelijk buiten het germinal center is. CD20 is diffuus positief binnen en buiten de germinal center. (B) de tabel toont dat germinal center CD20-positieve cellen ook positief voor BCL6 en Ki67 zijn maar negatief voor BCL2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Volgorde van antilichaam kleuring | Primair antilichaam (zie tabel van materialen) | Totale HIER vereist | Werkelijke pre vlek HIER | Secundair antilichaam | Fluorophore | Post-TSA antilichaam strippen |
| 1 | Muis anti-Bcl6 (1:30, 60min RT) | 25minutes, Ph9 | 25minutes, Ph9 | HRP-geconjugeerde anti-muis, 1:1000' voor 10' | OPAAL Cy5 op 1:100 | 1 ronde 100% stroom 1 min, 20% kracht gedurende 10 minuten |
| 2 | Muis anti-Bcl2(1:50,60 min RT) | 25minutes, Ph9 | Geen | HRP-geconjugeerde anti-muis, 1:1000' voor 10' | OPAL 520 op 1:100 | 1 ronde 100% stroom 1 min, 20% kracht gedurende 10 minuten |
| 3 | Konijn anti-c-MYC(1:50,30 min RT) | 25minutes, Ph9 | Geen | Anti-konijn, 1:1000 HRP-geconjugeerde ' voor 10' | OPAL 570 op 1:100 | 1 ronde 100% stroom 1 min, 20% kracht gedurende 10 minuten |
| 4 | Muis anti-CD20(1:2000,30 min RT) | 25minutes, Ph9 | Geen | HRP-geconjugeerde anti-muis, 1:1000' voor 10' | OPAL 540 op 1:100 | 1 ronde 100% stroom 1 min, 20% kracht gedurende 10 minuten |
| 5 | Muis anti-Ki-67(1:50,45 min RT) | 30minutes, Ph9 | 5 minuten pH9 | HRP-geconjugeerde anti-muis, 1:1000' voor 10' | OPAL 620 op 1:100 | 1 ronde 100% stroom 1 min, 20% kracht gedurende 10 minuten |
Tabel 1: voorbeeld van een gefinaliseerde lay-out voor multiplex als kleuring. Deze tabel bevat een voorbeeld van het opgeven van de hoeveelheid HIER en magnetron gebaseerde strippen bij elke stap worden gedaan zodra de monoplex vlekken zijn geoptimaliseerd.
Tabel 2: gids naar de selectie van de filter voor fluorophores. Deze tabel geeft een ruwe leidraad naar passende filters die kunnen worden gebruikt op de opgegeven apparatuur, om te visualiseren fluorophores van belang. Het is raadzaam om te controleren de filterspecificaties van de Microscoop wordt gebruikt met betrekking tot de emissie/excitatie-Profiel van de fluorophores gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MF-IHC heeft het potentieel om pathologen verfijnen diagnosticcriteria lymfoïde pathologie en analyseren van de rol van biomarkers in specifieke celtypen richting een voorspelling van klinische resultaten. Als een nieuwe onderzoeksmethode, wordt mf-IHC steeds meer toegepast op de kwantitatieve en ruimtelijke identificatie van meerdere immuun parameters van tumor cellen17. De detectie van mf-IHC voor de co expressie van tumor biomarkers gebleken reproduceerbaar zijn en betrouwbare5. De technologie blijft echter ontluikende en onderworpen aan variabiliteit die voortvloeien uit reagens - en/of weefsel-gerelateerde factoren, zoals die als gevolg van inconsistentie in weefsel fixatie en verwerking.
Cruciaal belang voor de techniek is het gebruik van goed gevalideerde antilichamen die specifiek zijn, gevoelige en reproduceerbare resultaten geven. Er zijn voorbeelden in de literatuur van antilichamen oorspronkelijk beschreven om specifiek voor hun antigenen en later aangetoond om te herkennen van ongerelateerde eiwitten door middel van knock-out modellen14. De knock-out / knock-down validatiemethode wordt gebruikt die in welk wild-type of de cellen met overexpressie antigenen dienen als positieve controle terwijl cellen met de doelen knock-out of neergeslagen door siRNA of CRISPR methoden zijn gebruikt als negatieve controles.
Zoals de conventionele IHC heeft mf-IHC vele kritische variabelen die moeten worden geoptimaliseerd voor elk experiment, voor optimale kleuring en resultaten. Het gaat hierbij om de pH van de oplossing van de gegevensherwinning antigeen, de verdunning van de antilichamen, de toewijzing van een fluorophore om iedere markeerdraad en de concentratie van de fluorophore. De gebruikte antigeen ophalen oplossingen zijn van pH 6 en 9. Het is de moeite waard om te testen welke pH geeft de optimale kleuring patroon en intensiteit met minder achtergrond.
Er zijn geen specifieke richtlijnen om te beslissen over de volgorde van antilichaam toepassing in het multiplex experiment, aangezien het niet alleen afhangt van de affiniteit van het antilichaam, maar ook op de sterkte van de opaal fluorophores. In het algemeen, antilichamen met een zwakke affiniteit vaak vereisen hogere concentraties op basis van de monoplex kleuring en eerst toegepast in de volgorde van multiplex. Sterke affiniteit antilichamen die dreigen te worden tegen strippen zijn laatste, toegepast om te voorkomen dat niet-specifieke kleuring. Met betrekking tot de keuze van een specifieke fluorophore is het beter om te voorkomen dat met behulp van fluorophores met gelijkaardige spectrale golflengten voor antigenen die colocalize in de dezelfde cellulaire compartimenten. Antigenen met lage expressie niveaus worden toegewezen met de helderste fluorophores en vice versa. Als, in de steekproef studie de signaalsterkte zwak is, kan passen de opaal TSA verdunning worden gedaan om te bereiken van het gewenste signaal18. In sommige gevallen kan proberen verschillende antigeen ophalen methoden of verhoging van de concentratie van het primaire antilichaam werken. De eerste verdunning van het primaire antilichaam kunnen dezelfde zijn als die in een conventionele IHC experiment opgericht. Als het als signaal niet duidelijk is, zullen het testen van andere antilichaam verdunningen echter vereist, zoals de voorwaarden die zijn geoptimaliseerd voor IHC doen niet altijd wordt omgezet naar als. Signaalsterkte wordt beïnvloed door de volgorde of de volgorde van immunokleuring. Sommige epitopes zijn overbelicht na twee of drie rondes van MWT, terwijl sommige als gevolg van overtollige MWT afnemen kunnen. Bepaalde fluorophores kan ook worden beïnvloed door MWT en moeten worden getest voor demping.
Dit protocol is gericht op de colocalization en de meting van de intensiteit van markeringen binnen deelverzamelingen van cellen in een kwaadaardige B-cel lymfoom. De belangrijkste uitdagingen bij de ontwikkeling van het huidige protocol betrekking hebben op de generatie van een geoptimaliseerde multiplex panel voor antigenen die colocalize in de dezelfde cellulaire compartimenten. Er moet een nauwkeurige randverwijdering van fluorophores voor precieze kwantificering. Zodra de multiplex Configuratiescherm wordt gestart in plaats, is beeldvorming van de gekleurde dia's relatief eenvoudig. De volgende hindernis omvat de analyse van de verbeelde gegevens. In tegenstelling tot immuun infiltratie studies, waar de kwantificatie van specifieke immuun celtypes binnen een epitheliale tumor eenvoudig is, colocalization studies in lymfoom zijn sterk afhankelijk van de definitie van positiviteit door een opgeleide patholoog voor iedere markeerdraad van belang. Voortvloeiende op een passende diagnostische cut-off die kan worden toegepast op de gangbare klinische praktijk blijft een work in progress. Verdere verfijningen in de methoden van gegevens normaliseren en geautomatiseerde cut-off triangulatie zal nodig zijn voordat deze techniek kan worden geïntegreerd in de routine diagnostiek.
Ondanks de huidige beperkingen maken de potentiële toepassingen van mf-IHC en de wetenschap dat de studie van tumorcellen en hun ruimtelijke relatie met de communicatie kan worden opgedaan het een aantrekkelijk instrument, met name voor uitdagende histologische kankers zoals lymfoïde maligniteit. Verdere werkzaamheden is toegangpunt vereist om protocollen in weefsel fixatie en weefsel verwerking die voor de voorgestelde workflow, evenals een verbetering in de kleuring technieken, met het oog op de gelijktijdige analyse van een toenemend aantal doelen optimaal zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
A.D.J. heeft financiering ontvangen van PerkinElmer richting reizen naar gebruikersgroep vergaderingen. De auteurs hebben geen andere conflict van belang om te vermelden.
Acknowledgments
S.-B.N. en A.D.J. worden ondersteund door de Singapore ministerie van volksgezondheid nationale medische onderzoek Raad overgang Awards (NMRC/TA/0020/2013 en NMRC/TA/0052/2016). De auteurs erkennen een onderzoeksbeurs van Yong Siew Yoon aan A.D.J. van de nationale universiteit kanker instituut van Singapore naar de aankoop van een Vectra spectrale imaging Microscoop. Deze studie is goedgekeurd door de Singapore NHG domein specifieke Review Board B (2014/00693).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
References
- Swerdlow, S. H., et al. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , Revised Fourth Edition, Stylus Pub LIc. (2017).
- Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
- Dabbs, D. J. Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , Saunders. (2010).
- Kim, S. -W., Roh, J., Park, C. -S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Anderson, M. W., Natkunam, Y. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. Jones, D. , Humana Press. 21-44 (2010).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
- Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Tóth, Z. E., Mezey, É Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Ng, S. -B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
- Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).
- Kalyuzhny, A. E. Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , Humana Press. (2011).
- Bordeaux, J., et al.
- PerkinElmer. Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User's Manual. , PerkinElmer, Inc. (2012).
- Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
- Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
- PerkinElmer. Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , PerkinElmer, Inc. (2017).
