Summary
Aquí se describe un protocolo de immunohistochemical fluorescente multiplex la coloración y la proyección de imagen para la localización simultánea de múltiples antígenos asociados a cáncer de linfoma. Este protocolo puede ampliarse para el análisis de colocalización de marcadores biológicos en todas las secciones de tejido.
Abstract
Métodos de inmunohistoquímica (IHC) para el análisis in situ de la expresión de la proteína por microscopia ligera son una poderosa herramienta de investigación y diagnóstico. Sin embargo, la visualización y cuantificación de antígenos múltiples en una sección de tejido solo usando IHC cromogénico convencional es un reto. Proyección de imagen de multiplexado es especialmente relevante en linfoma investigación y diagnóstico, donde los marcadores tienen que interpretarse en el contexto de un microambiente tumoral compleja. Aquí se describe un protocolo para IHC fluorescente multiplexado tinción para posibilitar la evaluación cuantitativa de múltiples objetivos en tipos celulares específicos de interés en el linfoma. El método cubre aspectos de validación de anticuerpo, anticuerpo optimización, la optimización multiplex con marcadores de subtipos de linfoma, la tinción de tejido microarrays (TMA) y el escaneo de las diapositivas, seguido de análisis de datos, con específicas referencia a linfoma. Usando este método, partituras de la intensidad media de un marcador de interés y el porcentaje de positividad se generan para facilitar aún más el análisis cuantitativo. Multiplexación minimiza la utilización de la muestra y proporciona información espacial para cada marcador de interés.
Introduction
Neoplasias linfoides son causados por la incontrolada proliferación maligna de linfocitos. Estas células son componentes vitales del sistema inmune y localización a los órganos inmunes primarios y secundarios, como la médula ósea, ganglios linfáticos, bazo y otros sistema linfoide asociado a mucosa. Neoplasias linfoides son un grupo heterogéneo de trastornos que se clasifican basados en una constelación de características, incluyendo la morfología, immunophenotype, características genéticas y la presentación clínica. Mientras que cada parámetro desempeña un papel, sigue siendo una característica que define y constituye la base para el sistema de clasificación de la OMS que reconoce neoplasias derivadas de células B, células T y natural killer (NK) las células1.
Clave para la clasificación del linfoma ha sido la caracterización de los anticuerpos contra marcadores de superficie de leucocitos de los diversos subtipos de linfocitos2. Inmunohistoquímica (IHQ) se ha utilizado tradicionalmente para el análisis de estos marcadores y se basa en el principio del reconocimiento antígeno-anticuerpo específico para detectar moléculas basado en células y tejidos que pueden visualizarse con el microscopio de luz 3. sin embargo, la identificación de objetivos múltiples en una sola diapositiva por IHC multiplex cromogénico convencional de campo brillante tiene limitaciones porque a menudo es difícil distinguir múltiples señales de color en una sección de tejido único fiable — especialmente para los antígenos con una expresión muy baja de4. Evaluación visual y cuantificación de la coloración también pueden ser subjetivas, provocando variabilidad en la interpretación de datos y análisis5.
Por lo tanto, IHC convencional en las muestras (FFPE) formalina-fijos, parafina-encajado no es factible para la detección simultánea de múltiples objetivos en contra diversas enfermedades como el linfoma. Por otra parte, distinguir los linfocitos neoplásticos de las células inmunes circundantes es a menudo imprecisa. Esto impide estudios que la relevancia de nuevos biomarcadores en el linfoma. En este contexto, IHC fluorescente multiplex (mf-IHC) ofrece una alternativa prometedora que permite la evaluación cuantitativa de coexpression de antígeno y una relación espacial con mayor precisión mientras que la conservación limitada de las muestras6,7. Cuando esta tecnología está asociada con el software de análisis digital de imágenes, la interpretación de los datos es más eficiente y facilita el estudio del tumor y microambiente heterogeneidad8,9. En el presente Protocolo, una base de tyramide inmunofluorescencia (IF) método de multiplexación se aplica para amplificar la señal y es compatible con cualquier anticuerpo IHC-validado de cualquier especie, incluso los desarrollados en la misma especie5,7 , 10. el protocolo de tyramide permite la conjugación directa del fluoróforo al tejido de interés para que el anticuerpo primario y secundario puede ser despojado después de cada paso, permitiendo la aplicación secuencial de múltiples manchas sin reactividad cruzada del anticuerpo.
Una estrategia de multiplexado será útil para predecir el pronóstico y el tratamiento de los resultados mediante la identificación de objetivos y sus variante patrones inmunológicos en linfomas. MULTIPLEX fluorescente IHC se ha aplicado en nuestro laboratorio para el estudio de un panel de marcadores T y linfocitos B y T-folicular ayudante en linfoma angioimmunoblastic T-cell (AITL), un subtipo de linfoma T-cell periférico caracterizado por agresivas clínica comportamiento y tumor heterogeneidad11. La utilidad de este método se ilustra también en linfoma difuso de grandes células B (DLBCL) donde la mayor señalización de un receptor de células B con expresión simultánea de C-MYC y BCL-2 sugiere el posible uso terapéutico de la inhibición de la cinasa de tirosina de Bruton 12 .
Aquí describimos el conjunto del Protocolo de validación del anticuerpo a la selección de tejidos de control apropiado y multiplexación usando linfoma FFPE tejidos, con un eventual análisis de diapositivas manchadas, utilizando un análisis automatizado de imágenes de patología cuantitativa sistema.
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Protocol
Todos los tejidos utilizados en este protocolo se obtuvieron bajo el B Singapur NHG dominio específico de tablero de estudio 2014/00693.
1. selección y validación de los anticuerpos
Nota: Antes de proceder con el establecimiento de cualquier panel multiplexado, asegúrese de que todos los anticuerpos de la mancha enérgicamente, identificar sólo el antígeno blanco de interés. El objetivo es seleccionar anticuerpos que reconocen específicamente el antígeno de interés en las secciones de tejido.
- De un anticuerpo con un uso bien establecido de la investigación y uso clínico rutinario en IHC, confirmar las condiciones tales como dilución de anticuerpo y recuperación del epítopo realizando convencional IHC5,13 en el tejido de control positivo y negativo secciones. Para cortes de tejidos de origen humano, que sean los espacios de ética adecuada en el lugar antes de iniciar los experimentos.
Nota: Controles positivos son los tejidos que se esperan que expresan el antígeno de interés y controles negativos son los que no. Tejido benigno de la amígdala es elegido como un control de buen tejido para antígenos de linfoma porque contiene una mezcla de células inmunes incluyendo linfocitos B, células T y células presentadoras de antígeno, así como las células stromal y epiteliales. Este último servirá de útiles controles internos negativos. - Para objetivos desconocidos o anticuerpos comerciales con suficientes datos, realizar la validación de anticuerpo creando positivo coincidente y célula de control negativo FFPE bloques14, utilizando CRISPR knock-out o siRNA precipitación del antígeno de interés en una línea de células apropiadas a través de técnicas de biología molecular estándar. Utilizar estos bloques de celdas FFPE reemplaza los tejidos de control positivo y negativo para IHC convencional según el paso 1.1.
Nota: Las células HeLa o 293T son usadas comúnmente para antígenos que no son el tipo celular específico, como las líneas celulares de linfoma son difíciles a transfectar. Para los antígenos que son linfocitos específicos, líneas celulares de linfoma pueden utilizarse con transducción viral o electroporación como el modo de entrega de genes (aunque con baja eficacia).
2. planificación de la secuencia de anticuerpos y fluoróforos para el Panel de Multiplex
- Planificar la secuencia de reactivos para la coloración final de multiplex. Por ejemplo, aquí la secuencia para el protocolo multiplex fue planeada inicialmente como primero, Bcl-6; en segundo lugar, Bcl-2; en tercer lugar, C-Myc; cuarto, CD20; en quinto lugar, Ki67.
Nota: Para decidir sobre la secuencia, anticuerpos con una afinidad débil que requiere concentraciones más altas deben mancharse primero en la coloración final de multiplex. Anticuerpos de alta afinidad que suelen ser resistentes a múltiples rondas de microondas pelar se aplican última en el protocolo multiplex para evitar la tinción inespecífica. - Plan de la pareja de fluoróforo para cada anticuerpo en el panel. Ver tabla 1 y Tabla de materiales para las opciones en este ejemplo.
Nota: Para decidir sobre el socio de fluoróforo para cada anticuerpo, elija fluoróforos espectralmente distintos anticuerpos con patrones similares de localización dentro de la célula y tejido. Esto minimizará el solapamiento espectral y la dificultad de idear.
3. Monoplex Tyramide basada en un Panel Multiplex simulada 5-plex
Nota: En este ejemplo, el protocolo para CD20 se discute, que está prevista como anticuerpo cuarto en una secuencia multiplex descrito anteriormente. El número de pasos adicionales de desmontaje será diferente de la posición del anticuerpo en la secuencia.
- Cortar 3 μm-finas secciones de tejido de control positivo y negativo utilizando un micrótomo y coloque las secciones sobre poly-L-lisina-cubrió el portaobjetos de vidrio.
- Dewax las secciones con una solución apropiada claro 3 x 4 min. Rehidratar las diapositivas en alcohol 100%, 90% de alcohol y alcohol al 70%, 4 minutos cada uno. Poner los portaobjetos en agua destilada durante 2-3 minutos.
- Coloque los portaobjetos en un tarro de cristal apto para microondas en un búfer de recuperación de antígeno estándar (disponible comercialmente) para sumergir los portaobjetos. Realice por calor del epítopo (HIER) usando un microondas adecuado, en solución de recuperación de antígeno pH9 a 98 ° C durante 25 minutos.
Nota: Pueden utilizarse cualquier microondas con una presión que van desde 800-1.100 vatios y HIER puede optimizarse por consiguiente. En este caso, un procesador de tejido microondas multifunción (abierto al aire) fue utilizado para HIER y desmontaje. Los ajustes iniciales para la recuperación de un epitopo determinado se basan en el conocimiento previo de IHC convencional. - Realizar rondas adicionales de microondas pelar (tres en este caso, para el cuarto del anticuerpo en un panel), y cada ronda con 100% de potencia a 98 ° C y 20% de potencia durante 10 minutos mantener a la misma temperatura. Enfriar el portaobjetos en agua destilada durante al menos 10 minutos.
Nota: Realice múltiples rondas de microondas pelar durante la etapa de IF monoplex para exponer el antígeno blanco en el mismo número de pasos que en el complejo proyecto de calefacción. Puesto que CD20 está previsto como el anticuerpo de cuarta, microondas pelar 3 x antes y una hora después de la incubación del anticuerpo primario. - Verificar y reponer el búfer después de cada 5 min durante el desmontaje de microondas adicional. Lo importante, no deje que diapositivas secar durante los múltiples procedimientos de desmontaje. Cuando se toma el portaobjetos en el microondas, utilice pinzas y guantes resistentes al calor para colocar en un frasco separado de agua destilada. Espere a que la solución de recuperación de antígeno se enfríe naturalmente.
- Bloquear la actividad de peroxidasa del tejido mediante el uso de un bloque comercial de la peroxidasa durante 10 min (3% peróxido de hidrógeno puede utilizarse como reactivo alternativo). Lavado con solución salina tamponada con Tris (TBS) y un detergente no iónico 5 min.
Nota: TBS está compuesto por 50 mM de Tris-Cl, pH 7,5 y 150 mM NaCl.TBS para TBS-D. - Bloque con diluyente de anticuerpos o albúmina sérica bovina durante 15 min, seguido por la incubación con el anticuerpo primario del interés (e.g., CD20, dilución de 1:2,000 en diluyente de anticuerpos, véase Tabla de materiales) a temperatura ambiente durante 30 minutos lavar 3 x con Tampón TBS-D 5 min cada vez. Debe haber suficiente buffer TBS-D sumergir el portaobjetos totalmente en todos los pasos de lavado.
Nota: La albúmina de suero bovino puede utilizarse como un diluyente de anticuerpos alternativo. El volumen de diluyente de anticuerpos depende del tamaño del tejido, que van desde 50 μl (por biopsias) a 400 μL (para muestras de supresión o muestras de microarray de tejido). - Incubar con un apropiado peroxidasa (HRP)-anticuerpo secundario marcado con, elegido sobre la base de la especie de origen del anticuerpo primario por 15 min a temperatura ambiente. Lavar 3 veces con tampón TBS-D 5 min cada vez.
- Aplicar un reactivo fluorescente basado en tyramide apropiado (1: 100 en diluyente de amplificación) e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos, para permitir la conjugación de fluoróforo a la muestra de tejido en los sitios de unión del anticuerpo primario. Lavar 3 veces con tampón TBS-D 5 min cada vez.
- Realizar un adicional basada en microondas pelar para quitar el anticuerpo primario y secundario. Repita como sea necesario en función de la posición del anticuerpo en la secuencia.
- Colocar el portaobjetos en agua destilada que se enfríe. Incube con DAPI (dilución 1: 100 en diluyente de anticuerpos) durante 10 min, seguido de lavado 3 veces con tampón TBS-D 5 min cada vez. Secar el área de la diapositiva sin el tejido con toallitas y Monte la diapositiva con los medios de montaje apropiados.
- Imagen de la diapositiva (ver secciones 6 y 7 del presente Protocolo) y determinar la idoneidad de la tinción (como se define por la clara discriminación del tejido de control positivo y negativo).
Nota: Si el patrón de coloración es incorrecto, rehacer la monoplex coloración después de ajustar una o más de los siguientes parámetros: el número de recuperación de calor de pasos, la cantidad de recuperación de calor, el período de incubación o concentración de anticuerpos (primaria y secundaria), la posición de anticuerpo en la secuencia y la elección del fluoróforo. Monoplex tinción paso normalmente requiere múltiples rondas de optimización para obtener un conjunto adecuado de parámetros para la tinción adecuada. Es recomendable probar una gama de fluoróforos con cada anticuerpo primario, como esto le dará flexibilidad para decidir el sistema multiplex final.
4. repetición de Monoplex para cada anticuerpo en el protocolo Multiplex
- Repita la monoplex coloración para los otros anticuerpos de manera similar ajustando el número de pasos, en función de la posición del anticuerpo en la secuencia de desmontaje de microondas. Por ejemplo, al realizar monoplex para el tercer anticuerpo en un panel de seis-plex multiplex, realizar dos pasos de extracción de microondas antes y tres pasos de extracción de microondas después de la incubación del anticuerpo primario.
Nota: Es importante apreciar que la extracción basada en microondas de anticuerpos también expone la muestra a HIER. Si un anticuerpo específico requiere una estrategia de recuperación del epítopo diferente, esto debe tenerse en cuenta al planear la secuencia multiplex. En este ejemplo, la recuperación del epítopo de Ki67 requiere pH 9, durante 30 minutos. KI67 tinción en el protocolo secuencial, sólo un 5 minutos extra de HIER se necesitan desde 25 min de HIER se hará antes.
5. Protocolo de tinción de multiplex
Nota: Proceda con el complejo protocolo de tinción sólo después de que todos los componentes han sido optimizados utilizando monoplex si manchas. Revisar los resultados de la tinción monoplex y diseñar una tabla que muestra el diseño final del orden de multiplex y la elección del fluoróforo para cada anticuerpo. Los detalles de la concentración de anticuerpos, la duración de la coloración y la secuencia y naturaleza de la recuperación de calor para cada anticuerpo usado aquí se proporcionan en la tabla 1.
- Corte 3 μm-finas secciones de tejido de control positivo y negativo, así como el tejido de la blanco de interés (aquí, FFPE muestras del linfoma), usando un micrótomo y colocar los elementos en poly-L-lisina-revestido vidrio portaobjetos (véase Tabla de materiales).
Nota: Inclusión de los controles positivos y negativos para cada anticuerpo en el panel es aconsejable, junto con las muestras reales de multiplex. Esto permite una confirmación de que el protocolo de tinción se realizó correctamente. - Dewax, realizar la recuperación por calor del epítopo (HIER) y bloquear la actividad de la peroxidasa del tejido como en los pasos de protocolo monoplex 3.3-3.5.
- Incubar con el anticuerpo primario primero de la secuencia multiplex optimizado, determinado previamente mediante el paso de IF monoplex. En este ejemplo, BCL-6, en una 1:30 dilución de anticuerpo diluyente a temperatura ambiente durante 60 minutos (véase Tabla de materiales), fue el primer paso del protocolo multiplex. Lavar con tampón TBS-D 5 min.
- Incuban con un anticuerpo secundario marcado con HRP apropiado basado en la especie del anticuerpo primario utilizado en el anterior paso (véase Tabla de materiales) a temperatura ambiente durante 10 minutos lavado con tampón TBS-D 5 min.
- Aplique el optimizado basado en la tyramide fluorescente reactivo (Cy5 en este ejemplo, 1: 100 en diluyente de amplificación, véase Tabla de materiales) con incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de la incubación, lavar con tampón TBS-D 5 min.
Nota: La elección del reactivo fluorescente basado en tyramide se basa en el monoplex optimizado si. - Comprobar la eficacia de la coloración del primer anticuerpo utilizando un microscopio apropiado (véase Tabla de materiales).
Nota: Tanto controles de imagen puede hacerse con facilidad si la muestra es un TMA o una sola diapositiva. Si, sin embargo, la mancha está llevando a cabo en varias diapositivas, esto puede ser impráctico, y este paso puede ser omitido. - Realizar microondas pelar para el segundo anticuerpo en el protocolo, utilizando las condiciones optimizadas en el paso de monoplex. Luego, proceder a la tinción del segundo anticuerpo primario (aquí, BCL2) con el anticuerpo secundario marcado con HRP y reactivo fluorescente basado en tyramide (aquí, 520, véase Tabla de materiales). Controlar la eficiencia de coloración bajo un microscopio de fluorescencia después de la terminación de la segunda ronda de la coloración.
- Asimismo, repita el procedimiento con el tercero, cuarto y quinto los anticuerpos en la secuencia (aquí, c-Myc, CD20 y ki67, respectivamente, con fluoróforos 570 540 y 620, respectivamente). Verifica la imagen entre cada paso si es posible.
- Añadir una contratinción nuclear (DAPI, dilución 1: 100 en diluyente de anticuerpos) durante 10 minutos y, luego, lavar 2 x en TBS-D durante 5 minutos.
- Montar las diapositivas utilizando un reactivo de montaje apropiado.
6. preparación de diapositivas biblioteca espectral
Nota: Las secciones 6-8 del presente Protocolo son exclusivos para experimentos multiplexados que son imágenes utilizando una cámara espectral.
- Crear diapositivas de biblioteca (solo mancha referencia imágenes) para cada fluoróforo, DAPI y autofluorescencia en el mismo tejido de control, que se utilizará para el análisis de imágenes multiespectrales.
- Cortar 2 x 3 μm-finas secciones del tipo de tejido de interés (aquí, una muestra del linfoma o una amígdala como control) usando un micrótomo y colocar los elementos en poly-L-lisina-cubrió el portaobjetos de vidrio.
- Proceso tanto las diapositivas usando el protocolo monoplex (con desmontaje y lavado de pasos), pero sin la adición del anticuerpo o fluoróforo.
- Una diapositiva con DAPI según paso 5.9 de la mancha y dejar una diapositiva sin mancha (para la generación del espectro de Autofluorescencia de tejido).
Nota: Las diapositivas monoplex optimizado (con un colorante de fluorescencia sola, sin DAPI) pueden utilizarse como biblioteca espectral diapositivas para generar espectros de cada colorante de fluorescencia.
- Analizar esta serie de diapositivas, utilizando los filtros adecuados y subir a la biblioteca de análisis de imagen.
7. espectral imagen
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Escanear diapositivas monoplex
- Seleccionar los filtros de los filtros disponibles estándar epi-fluorescencia (DAPI, FITC, CY3, Texas Red y CY5) apropiados para el fluoróforo empleado.
Nota: Los cubos de filtro recomendada para fluoróforos específicos utilizados en este ejemplo se muestran en la tabla 215. - Examinar cada marcador en su canal correspondiente de la fluorescencia para identificar un tiempo de exposición adecuado para obtener una señal limpia. Se centran en el componente de tejido que se supone que tiene la señal más fuerte para el marcador.
- Determinar un tiempo de exposición fijo para cada analito (combinación de anticuerpo-fluoróforo), para permitir la comparación de la muestra de Cruz de intensidad del píxel (aunque algunas plataformas comerciales tienen estrategias de normalización para tener en cuenta las diferencias en la exposición).
- Para decidir en un tiempo de exposición fijo para un canal dado, utilizar un entorno vivo de la cámara para ajustar el tiempo de exposición hasta que no existen áreas sobreexpuestas de la imagen de la cámara en directo y repetir este proceso para todos los canales.
- Después de escanear las diapositivas monoplex, generar imágenes de brightfield simulada (si la función está disponible en el software utilizado) para comparar visualmente con el patrón normal de IHC y para determinar si el patrón de coloración es correcto (figura 1 y figura 2 de ).
- Seleccionar los filtros de los filtros disponibles estándar epi-fluorescencia (DAPI, FITC, CY3, Texas Red y CY5) apropiados para el fluoróforo empleado.
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Análisis de muestras de multiplexores (TMA diapositivas / múltiples muestras)
- Configurar los parámetros ópticos como se describe para el escaneo de imágenes monoplex (paso 6.1). En primer lugar, ajuste el enfoque manualmente o automáticamente (siga las instrucciones de la imagen específica análisis de máquina). En segundo lugar, ajustar el tiempo de exposición para cada canal fluorescente para asegurar que todos los corazones en un TMA o todas las áreas de una diapositiva, se exponen adecuadamente.
Nota: El área seleccionada para ajustar el tiempo de exposición es importante. Los usuarios deben elegir la región de señal más fuerte de cada filtro (es decir, la señal de Ki67 es más fuerte en la región de centro germinal de amígdalas que en el centro nongerminal; por lo tanto, los usuarios deben utilizar la región de centro germinal de una exposición adecuada tiempo). Los usuarios también pueden adoptar una función de corrección de sobresaturación del sistema imagen si está disponible. - Escanear diapositivas TMA bajo una modalidad de análisis de TMA Si está disponible en el sistema de proyección de imagen, con un algoritmo de enfoque adecuado.
- Para las diapositivas de la sección de tejido conjunto, obtener las diapositivas revisadas por un patólogo calificado para seleccionar imágenes óptima de las áreas más representativas del tumor.
Nota: El protocolo descrito aquí se basa en un sistema de análisis de imagen microscopio definidos (véase Tabla de materiales). Hay otras máquinas y software de análisis de imagen que pueda escanear y analizar multiplex IHC portaobjetos7.
- Configurar los parámetros ópticos como se describe para el escaneo de imágenes monoplex (paso 6.1). En primer lugar, ajuste el enfoque manualmente o automáticamente (siga las instrucciones de la imagen específica análisis de máquina). En segundo lugar, ajustar el tiempo de exposición para cada canal fluorescente para asegurar que todos los corazones en un TMA o todas las áreas de una diapositiva, se exponen adecuadamente.
8. Análisis de datos
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Planificación y evaluación de preanálisis
- Utilice la diapositiva referencia de Autofluorescencia para restar la autofluorescencia de las imágenes escaneadas para el análisis.
- Revisar las imágenes antes del análisis para asegurarse de que están en foco y sin artefactos de tinción.
- Use un marcador de tumor (p. ej., CD20 en este ejemplo) para identificar las células de interés y proceder con análisis de lote, puntuación y segmentación de la célula se acerca. Seleccionar las células de CD20-positive para el análisis.
Nota: por ejemplo, en el DLBCL muestras analizadas aquí, la configuración y parámetros que se definen para la segmentación de la célula se basan en el tamaño nuclear y la intensidad pero son específicos para el software de análisis de imagen utilizado (p. ej., una DAPI significa intensidad de pixel de en menos de 0.05; tamaño entre 80-320 píxeles, con una sensibilidad de división en 2 [este es un parámetro de software específico que depende de la morfología del tumor: para las células tumorales pequeñas, partir de 0,7 - 1 es apropiado, para las células grandes del tumor, división puede ajustarse hasta 4]). - Solicitud de un patólogo calificado revisar imágenes individuales y decidir si la segmentación del tejido es necesaria para seleccionar células tumorales enriquece regiones y excluir con necrosis arearegion orand abundantes las células reactivas. Si segmentación del tejido adicional se requiere, entonces seleccione las regiones de control apropiado (por ejemplo, las células de tumor, tejido conectador/necrosis) y compruebe que el software de análisis de imagen puede identificar correctamente tales regiones
- Proceder a la segmentación de la célula después de la segmentación del tejido (si existe), solicitud de un patólogo calificado para revisar el mapa de segmentación de la célula para asegurar la fidelidad de la segmentación prevista acercarse5.
- Determinar más biológicamente/clínico método apropiado de análisis para un biomarcador dado de interés (p. ej., porcentaje de positividad o intensidad media por célula).
- Seleccione un valor de corte para cada marcador (para porcentaje de positividad).
- Determinar el valor de corte positivo de intensidad óptica para cada marcador junto con un patólogo. Generar histogramas mediante el análisis de la distribución de frecuencia de la intensidad del marcador/célula en software estadístico apropiado (véase Tabla de materiales).
Nota: Un histograma del valor de intensidad puede ofrecer un resumen de la distribución de las intensidades de señal. - Determinar un corte aproximado de histograma y comprobar esto con una revisión del patólogo, a correlacionar con cortes manualmente determinados en las imágenes. En algunas situaciones, un corte uniforme único no será posible debido a la variabilidad en la coloración, y un valor de corte manual para cada muestra será necesario.
Nota: Sección 8.1 debe realizarse en software de análisis de imagen (véase Tabla de materiales) a menos que se especifique lo contrario.
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Células positivas y negativas de la marca
- Para cada marcador de interés, según el número de corte determinado (a través de histogramas o manualmente), utilizar un "IF" o fórmula similar lógica para marcar las células positivas y negativas con marcado valor: número 1 de las células positivas, número 0 para las células negativas.
- Para la positividad de los marcadores, multiplicar el valor marcado de cada marcador (ya sea 1 o 0) con los productos en columnas separadas. Si el producto es igual a 1, significa que la célula es positiva para todos los marcadores. Para la positividad y la negatividad de un marcador específico, utilice un algoritmo de lógica IF.
Nota: Sección 8.2 debe hacerse en software estadístico (véase Tabla de materiales).
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Generar datos de porcentaje y datos numéricos utilizando una tabla dinámica
- Generar datos de porcentaje de marcadores específicos de interés, dentro de las células definidas (por ejemplo, las células de CD20-positive o células CD20 negativa) (figura 6).
- Inserte una tabla dinámica en la hoja de datos.
- Para calcular el porcentaje de positividad de un solo marcador, como CD20, seleccione la función suma en la parte de valor de la tabla pivote para contar el número total de células de CD20-positive mediante la suma de los CD20+ las células se dividen por el número total de la célula. El resultado es el CD20+ porcentaje dentro de una base o un estudio número (depende de la selección de la fila de la tabla pivote) de la célula.
- Calcular el porcentaje de positividad de marcadores múltiples utilizando el mismo método (figura 3).
- Generar datos numéricos. Extracto de la cuenta promedio normalizada para cada marcador de cada núcleo o cada número de estudio mediante la obtención de la intensidad media de cada marcador de interés en todas las células estudiadas dentro de una muestra (figura 4).
Nota: El valor medio no se puede derivar de la tabla pivote directamente. Pueden ser derivada usando esta fórmula: mediana (IF (columna de estudio número = número de estudio específico, columna del valor normalizado)).
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Trazar los datos en un gráfico adecuado
- Parcela los resultados del porcentaje de positividad o de mediana intensidad por marcador de un tipo de células de interés de manera apropiada para pruebas estadísticas adicionales y presentación.
- Crear parcelas de punto para proporcionar una visualización de los números y distribución.
Nota: Representación de datos con gráficos de barra no transmiten información sobre la distribución. Parcelas de estimación también se recomiendan como un buen método para la representación de datos, con énfasis en la magnitud de la diferencia entre las muestras16.
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Representative Results
MF-IHC imágenes una muestra de DLBCL con C-MYC y el cambio de gene de BCL2 (doble golpe linfoma) se muestran en la figura 1. La figura 2 ilustra las imágenes simuladas campo brillante de immunohistochemical. Figura 3 indica la generación de datos de porcentaje. Figura 4 muestra los detalles de una fórmula mediana para la generación de datos numéricos. La figura 5 muestra la aplicación de mf-IHC de un panel de células T en linfomas de células T de Linfoadenopatía. La figura 6 muestra la imagen de la optimización de la muestra de control de la amígdala y el análisis de los datos de este ejemplo.
Figura 1: células B multiplexado imágenes panel de inmunofluorescencia de una difusa muestra grande de linfoma (DLBCL) de células B con cambio de gene C-MYC y CL2 (linfoma de doble golpe). Magenta = CD20 (membrana); blanco = BCL2 (citoplasma); amarillo = Ki67 (nuclear); verde = C-MYC (nuclear); rojo = BCL6 (nuclear), azul = DAPI (contratinción nuclear). Las células del tumor de CD20-positive mostrar una alta expresión de C-MYC (80%) y BCL2 (> 90%), y el índice de proliferación Ki67 es también alto (90%). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: simular imágenes de campo claro immunohistochemical (generadas de la figura 1) de la misma muestra DLBCL con cambio de gene C-MYC y BCL2 (linfoma de doble golpe). CD20 muestra membrana tinción en las células del tumor. Bcl2 muestra citoplasma tinción en > 90% de las células del tumor. Positividad de C-MYC es alrededor del 80%. BCL6 muestra coloración en aproximadamente el 20% de las células nucleares. Ki67 es positivo en el 90% de las células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: tabla dinámica que muestra cómo generar datos de porcentaje según número de estudio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: fórmula de la mediana para el valor de OD Ki67 normalizado según estudio número. La instrucción IF encuentra todos los números de estudio que son iguales a un número de estudio específico (que es el 52 en esta figura). A continuación, devuelve el valor de Ki67 normalizado correspondiente. Ctrl + Shift + Enter las combinaciones de teclas pueden utilizarse para calcular la mediana (Mediana de Ki67) para estos valores devueltos, 11.56 estudio número 52. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: multiplexado de imágenes del panel de inmunofluorescencia para una muestra de angioimmunoblastic t-célula linfoma (AITL). (A) la imagen compuesta muestra la heterogeneidad celular de una muestra AITL. Magenta = CD20 (membrana); amarillo = CD4 (membrana); verde = PD1 (membrana); rojo = BCL6 (nuclear); Cyan = CD8 (membrana); azul = DAPI (contratinción nuclear). (B) la fila superior de las imágenes muestra una vista ampliada de la región seleccionada en el cuadro blanco en el panel A. La fila inferior de imágenes muestra el correspondiente segmentado máscaras celular: amarillo/rojo/verde muestra las células CD4, BCL6/PD1-positivo, respectivamente. Azul representa las células negativas y blanco indica células doble positivas. Las imágenes revelan que el 50% de CD4+ las células son PD1+ (izquierda, blanco), mientras que el 20% de CD4+ las células también son positivas para BCL6 (centro, blanco). La tasa de positividad doble para PD1 y BCL6 es alrededor del 10% (derecho, blanco). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: multiplexado imágenes optimización de inmunofluorescencia de tejido de control amígdala. (A) la imagen compuesta muestra el área de centro germinal de una muestra de control de la amígdala. Amarillo = C-Myc (nuclear); rojo = BCL6 (nuclear); Cyan = BCL2 (citoplasma); magenta = CD20 (membrana); verde = Ki67 (nuclear); azul = DAPI (contratinción nuclear). C-Myc es positiva solamente en algunas células. BCL6 y Ki67 están positivo principalmente en el centro germinal, BCL2 positivo principalmente fuera del centro germinal. CD20 es difusamente positiva dentro y fuera del centro germinal. (B) la tabla muestra que las células del centro germinal de CD20-positive son también positivas para BCL6 y Ki67 pero negativas para BCL2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Secuencia de la tinción de anticuerpos | Anticuerpo primario (véase tabla de materiales) | HIER total necesaria | Mancha Real pre HIER | Anticuerpo secundario | Fluoróforo | Extracción de anticuerpos post-TSA |
| 1 | Mouse anti-Bcl6 (1:30, 60 min RT) | 25 minutos, Ph9 | 25 minutos, Ph9 | HRP-conjugado anti-ratón, 1: 1000 ' por 10' | Cy5 de ópalo en el 1: 100 | 1 ronda el 100% de potencia 1 minuto, 20% de potencia durante 10 minutos |
| 2 | Mouse anti-Bcl2(1:50,60 min RT) | 25 minutos, Ph9 | Ninguno | HRP-conjugado anti-ratón, 1: 1000 ' por 10' | OPAL 520 a 1: 100 | 1 ronda el 100% de potencia 1 minuto, 20% de potencia durante 10 minutos |
| 3 | Rabbit anti-c-MYC(1:50,30 min RT) | 25 minutos, Ph9 | Ninguno | HRP-conjugado anti-conejo, 1: 1000 ' por 10' | OPAL 570 a 1: 100 | 1 ronda el 100% de potencia 1 minuto, 20% de potencia durante 10 minutos |
| 4 | Mouse anti-CD20(1:2000,30 min RT) | 25 minutos, Ph9 | Ninguno | HRP-conjugado anti-ratón, 1: 1000 ' por 10' | OPAL 540 a 1: 100 | 1 ronda el 100% de potencia 1 minuto, 20% de potencia durante 10 minutos |
| 5 | Mouse anti-Ki-67(1:50,45 min RT) | 30 minutos, Ph9 | 5 minutos pH9 | HRP-conjugado anti-ratón, 1: 1000 ' por 10' | OPAL 620 a 1: 100 | 1 ronda el 100% de potencia 1 minuto, 20% de potencia durante 10 minutos |
Tabla 1: ejemplo de un diseño finalizado para multiplex si tinción. Esta tabla proporciona un ejemplo de cómo especificar la cantidad de HIER y basadas en microondas pelar a realizar en cada paso, una vez que se han optimizado las manchas monoplex.
Tabla 2: Guía para la selección del filtro para fluoróforos. Esta tabla proporciona a una guía áspera hacia filtros adecuados que pueden utilizarse en el equipo especificado, visualizar fluoróforos de interés. Se recomienda verificar las especificaciones de filtro del microscopio se utiliza en relación con el perfil de excitación/emisión de los fluoróforos utilizado.
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Discussion
MF-IHC tiene el potencial para permitir que los patólogos perfeccionando diagnosticcriteria en patología linfoide y analizar el papel de los biomarcadores en tipos específicos de la célula hacia una predicción del resultado clínico. Como un nuevo método de investigación, mf-IHC se aplica cada vez más a la identificación cuantitativa y espacial de múltiples parámetros inmunes de las células de tumor17. La detección de mf-IHC de la coexpresión de marcadores biológicos de tumor ha demostrado ser reproducible y confiable5. Sin embargo, la tecnología sigue siendo incipiente y sometidas a variabilidad de reactivos o factores relacionados con el tejido, tales como debido a la inconsistencia en la fijación de tejido y procesamiento.
Crítico a la técnica es el uso de anticuerpos bien validados específicos, sensibles y da resultados reproducibles. Hay ejemplos en la literatura de anticuerpos descritos originalmente para ser específicos para los antígenos y demostrado más adelante para reconocer proteínas sin relación con el uso de modelos knock-out14. El método de validación de knock-out / precipitación en que tipo de salvaje o células con antígenos overexpressed sirven como controles positivos mientras que las células con los objetivos noqueado o derribado por siRNA o CRISPR métodos se usan como controles negativos.
Al igual que la IHC convencional, mf-IHC tiene muchas variables críticas que necesitan ser optimizados para cada experimento, para tinción óptima y los resultados. Estos incluyen el pH de la solución de recuperación de antígeno, la dilución del anticuerpo, la asignación de un fluoróforo para cada marcador y la concentración del fluoróforo. Las soluciones de recuperación de antígenos utilizados son de pH 6 y 9. Vale la pena probar que pH da el patrón de tinción óptima y la intensidad con menos fondo.
Hay no hay directrices específicas para decidir sobre la secuencia de aplicación del anticuerpo en el experimento de multiplex, depende no sólo de la afinidad del anticuerpo, sino también sobre la fortaleza de los fluoróforos de ópalo. En general, los anticuerpos con una afinidad débil a menudo requieren concentraciones más altas, basadas en la tinción de monoplex y se aplican primero en la secuencia multiplex. Anticuerpos de gran afinidad que están probable que sean resistentes a la extracción se aplican, para evitar la tinción inespecífica. En cuanto a la elección de un fluoróforo específico, es preferible evitar el uso de fluoróforos con longitudes de onda espectrales similares para antígenos que colocalize en los compartimientos celulares del mismo. Antígenos con niveles bajos de expresión se asignan con el más brillante fluoróforos y viceversa. Si en la muestra del estudio, la intensidad de la señal es débil, ajustando la dilución de la TSA de ópalo puede hacerse para alcanzar la señal18. En algunos casos, tratar de métodos de recuperación de diferentes antígenos o aumento de la concentración del anticuerpo primario puede funcionar. La dilución inicial del anticuerpo primario puede ser igual a la establecida en un experimento convencional de IHC. Sin embargo, si la señal de IF no está claro, la prueba de otras diluciones de anticuerpos deberá, como las condiciones optimizadas para IHC no siempre se traducen a IF. Intensidad de la señal es afectada por el orden o secuencia de inmunotinción. Algunos epitopos sobreexpuestas después de dos o tres rondas de MWT, mientras que algunos pueden degradarse debido a exceso MWT. Algunos fluoróforos también pueden verse afectada por MWT y necesitan ser probado para atenuación.
Este protocolo se centra en la colocalización y medición de la intensidad de marcadores dentro de subconjuntos de células de un linfoma de células B maligna. Los desafíos clave en el desarrollo del protocolo actual implican la generación de un panel de multiplex optimizado para antígenos que colocalize en los compartimientos celulares del mismo. Tiene que haber un preciso idear de fluoróforos de cuantificación precisa. Una vez el panel multiplex, proyección de imagen de las diapositivas manchadas es relativamente sencilla. El siguiente obstáculo implica el análisis de los datos de imagen. A diferencia de en los estudios de infiltración inmunes, donde la cuantificación de los tipos de célula inmune específica dentro de un tumor epitelial es sencilla, estudios de colocalización en linfoma dependen en gran medida la definición de positividad por un patólogo entrenado para cada marcador de interés. Derivar en un corte diagnóstico apropiado que puede ser aplicado a la práctica clínica habitual, sigue siendo un trabajo en progreso. Más mejoras en los métodos de normalización de datos y la triangulación de corte automatizado será necesarios antes de que esta técnica puede ser integrada en el diagnóstico rutinario.
A pesar de las limitaciones actuales, las aplicaciones potenciales de mf-IHC y los conocimientos que pueden extraerse del estudio de las células del tumor y su relación espacial con el microambiente que sea una herramienta atractiva, especialmente para impugnar histológica cánceres como malignidad linfoide. Más trabajo es necesario establecer protocolos de fijación de tejido y procesamiento de tejido que son óptimas para el flujo de trabajo propuesto, así como una mejora en tinciones, para permitir el análisis simultáneo de un mayor número de objetivos.
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Disclosures
A.D.J. ha recibido financiación de PerkinElmer hacia viajes para reuniones de grupos de usuario. Los autores no tienen ningún otro conflicto de interés divulgar.
Acknowledgments
S.-B.N. y A.D.J. son apoyados por el médicos investigación Consejo transición premios de Ministerio de salud Singapur nacionales (NMRC/TA/0020/2013 y NMRC/TA/0052/2016). Los autores reconocen una beca de investigación Yoon Yong Siew a A.D.J. de la Universidad Nacional cáncer Institute de Singapur hacia la compra de un microscopio de proyección de imagen espectral de Vectra. Este estudio es aprobado por el Singapur NHG dominio específico de Junta B (2014/00693).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
References
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