Summary
여기 우리는 다중 형광 immunohistochemical 얼룩 및 여러 암 관련 항 림프 종에서의 동시 지역화에 대 한 이미징에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 모든 조직 섹션에서 생체의 colocalization 분석을 확장할 수 있습니다.
Abstract
Immunohistochemical (IHC) 방법 가벼운 현미경 검사 법에 의해 단백질 표정에 현장 분석에 대 한 연구와 진단 목적을 위한 강력한 도구입니다. 그러나, 시각화 및 정량화 기존의 비 IHC를 사용 하 여 단일 조직 섹션에서 여러 개의 항 원에의 도전 이다. 멀티플렉스 이미징 관계가 특히 림프 종 연구와 진단, 마커 복잡 한 종양 microenvironment의 맥락에서 해석 될 수 있다. 여기 우리는 멀티플렉스 형광 IHC 림프 종에 대 한 관심의 특정 세포 유형에 여러 대상의 양적 평가 있도록 얼룩에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 방법 측면 커버 유효성 검사 항 체, 항 체 최적화, 림프의 표식이 있는 멀티플렉스 최적화, 데이터 분석, 특정 뒤 조직 microarray (TMA) 슬라이드 및 슬라이드, 스캔의 얼룩 림프 종 참조. 이 메서드를 사용 하 여 모두 관심과 백분율 양성의 감 적의 평균 강도 대 한 점수는 정량 분석을 더 촉진 하기 위하여 생성 됩니다. 멀티플렉싱 샘플 사용률을 최소화 하 고 각 표식에 대 한 관심의 공간 정보를 제공 합니다.
Introduction
림프 신생 세포의 억제 되지 않는 악성 확산에 의해 발생 합니다. 이 세포 면역 시스템의 중요 한 구성 요소 이며, 골 수, 림프절, 비장, 및 다른 점 막 관련 림프 시스템 등 기본 2 차 면역 기관에 지역화. 림프 신생 형태학, immunophenotype, 유전자 기능 및 임상 프레 젠 테이 션을 포함 하 여 특징의 별자리에 따라 분류는 누가 장애의 다른 유형의 그룹입니다. 각 매개 변수는 역할을, 하는 동안 혈통 정의 기능을 유지 하 고 인식 하는 B 세포, T 세포 및 자연적인 살인자 (NK) 세포1에서 파생 된 신생 WHO 분류 시스템에 대 한 기초를 형성.
림프 종의 분류에 키 림프 톨2의 다양 한 하위의 백혈구 표면 표식에 대 한 항 체의 특성화 되었습니다. Immunohistochemistry (IHC) 전통적으로 이러한 마커 분석에 사용 되었습니다과 가벼운 현미경 통해 구상 될 수 있다 세포 및 조직 기반 분자 검출에 특정 항 원-항 체 인식의 원리에 따라 그러나 3. 기존의 밝은 필드 비 멀티플렉스 IHC에서 단일 슬라이드에 여러 목표물의 식별 한계가 있기 때문에 그것은 종종 단일 조직 섹션에 여러 개의 색상 신호를 안정적으로 구분 하기 어려운-특히 매우 낮은 식4의 항 원에 대 한 육안 평가 및 정량화 얼룩의 주관적, 분석 및 데이터 해석5에 변화를 일으키는 될 수 있습니다.
따라서, 기존의 IHC에 포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) 샘플은 림프 종 같은 면역학 다양 한 질병에 여러 목표물의 동시 검색 가능 합니다. 또한, 주변의 면역 세포에서 종양 약 세포를 구별 하지 않습니다 정확 하 게. 이 림프 종에 소설 biomarkers의 관련성을 보고 하는 연구를 방해. 이러한 맥락에서 다중 형광 IHC (mf-IHC) 제공 유망한 대안 항 coexpression의 양적 평가 허용 및 제한 보존 하는 동안 더 높은 정밀도로 공간 관계6,7. 이 이미징 기술은 디지털 이미지 분석 소프트웨어와 제휴는 때 데이터 해석은 보다 효율적 및 종양과 microenvironment이8,9의 연구를 용이 하 게 한다. 이 프로토콜에는 tyramide 기반 면역 형광 (IF) 다중화 방법 신호를 증폭 하는 적용 되 고 같은 종5,7 에 개발도 그 어떤 호스트 종에서 어떤 IHC 검증 항 체와 호환 , 10. 1 차 및 이차 항 체는 여러 얼룩의 순차 응용 프로그램에 대 한 허용 하는 각 단계 후 박탈 될 수 있도록 관심의 조직에 fluorophore의 직접 활용에 대 한 tyramide 기반 프로토콜 허용 항 체 분 없이.
멀티플렉스 전략 목표 및 림프 종에서 그들의 변종 면역학 패턴을 식별 하 여 예 후와 치료 결과 예측 하는 데 유용 있을 것입니다. IHC T와 B 림프 구 마커 및 angioimmunoblastic T-세포 림프 종 (AITL)에서 T-follicular 도우미 마커 패널의 연구에 대 한 우리의 실험실에 적용 된 다중 형광 주변 T 세포 림프 종의 하위 공격적으로 임상 특징 동작 및 종양이11. 이 방법의 유틸리티는 또한 확산 큰 B-세포 림프 종 (DLBCL) 어디 Bruton의 티로신 키 니 아 제 억제의 잠재적인 치료 사용 제안 동시 C-MYC 및 BCL-2 식을 B 세포 수용 체의 신호 증가에 나와 있는 12 .
여기 우리는 적절 한 컨트롤 조직 선택 항 체 유효성 검사에서 전체 프로토콜 설명 및 림프 FFPE를 사용 하 여 멀티플렉싱 조직, 스캔을 사용 하 여 스테인드 슬라이드의 최종 분석 자동화 양적 병리학 이미징 시스템입니다.
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Protocol
이 프로토콜에서 사용 하는 모든 조직 싱가포르 NHG 도메인 특정 검토 보드 B에서 가져온 2014/00693 공부.
1. 선택과 항 체의 유효성 검사
참고: 어떤 멀티플렉스 패널의 설립을 계속 하기 전에 모든 항 체 얼룩이 튼튼하게, 관심의 대상 항만 식별 해야 합니다. 목표는 구체적으로 조직 단면도의 항 원 인식 하는 항 체를 선택 하는.
- 잘 설립 연구 사용, 또는 임상 사용 IHC에서 항 체에 대 한 긍정적이 고 부정적인 제어 조직에 기존의 IHC5,13 를 수행 하 여 epitope 검색 및 항 체 희석 등 조건 확인 섹션입니다. 인간 근원의 조직 단면도, 실험 시작 전에 장소에 적절 한 윤리 클리어런스는 확인 합니다.
참고: 긍정적인 통제는 관심사의 항 원을 표현 하는 것으로 예상 된다 조직 그리고 부정적인 컨트롤 하지 않는. B 세포 등 면역 세포, T 세포 항 원 선물 세포 뿐만 아니라 실질과 상피 세포의 혼합물을 포함 하기 때문에 양성 편도 선 조직 림프 종 항 원에 대 한 좋은 조직 제어로 선택 된다. 후자의 역할을 유용한 부정적인 내부 제어 합니다. - 알 수 없는 대상 또는 부족 한 게시 된 데이터와 함께 상업 항 체를 만들어 일치 긍정적인 항 체 유효성 검사를 수행 하 고 부정적인 제어 FFPE 셀 블록14, CRISPR 노크 아웃 또는 siRNA를 사용 하 여 관심의 항 원의 녹 다운 표준 분자 생물학 기법을 통해 적절 한 셀 라인. 단계 1.1에 의하여 기존의 IHC에 대 한 긍정적이 고 부정적인 제어 조직 대신 이러한 FFPE 셀 블록을 사용 합니다.
참고: 헬러 또는 293T 세포 항 세포 형 하지 않은 일반적으로 사용 됩니다 특정 림프 종 세포 라인은 transfect 어렵다. 있는 특정 림프 구 항 원에 대 한 림프 종 세포 선은 사용할 수 있습니다 바이러스 성 변환 또는 electroporation 유전자 배달의 모드와 (와 낮은 효능).
2. 다중 패널에 대 한 항 체 및 Fluorophores의 시퀀스 계획
- 최종 멀티플렉스 얼룩에 대 한 시 약의 순서를 계획 합니다. 예를 들어 여기 다중 프로토콜 시퀀스 처음 계획으로 첫째, Bcl-6; 두 번째, Bcl-2; 셋째, C-Myc; 넷째, CD20; 다섯째, Ki67입니다.
참고: 시퀀스에 대 한 결정, 항 체는 약한 선호도 높은 농도 요구 한다 얼룩이 질 먼저 최종 멀티플렉스 얼룩에. 전자 레인지 스트립의 여러 라운드에 저항력이 될 가능성이 높은 친 화력 항 체 마지막을 일반적인 얼룩이 지기 피하기 위해 다중 프로토콜에 적용 됩니다. - 패널에서 각 항 체에 대 한 fluorophore 파트너 계획. 이 예제에서 선택에 대 한 표 1 및 테이블의 자료 를 참조.
참고: 각 항 체의 fluorophore 파트너에 대 한 결정, 괴기 하 게 명료한 fluorophores 지역화 셀 및 조직 내에서 비슷한 패턴을 가진 항 체에 대 한 선택. 이 스펙트럼 오버랩 그리고 unmixing 문제가 최소화 됩니다.
3. 수염 Tyramide 기반 시뮬레이션된 5-플렉스 멀티플렉스 패널에 있는 경우
참고:이 예제에서는 CD20 위한 프로토콜은 논의 위에서 설명한 다중 순서로 4 항 체로 계획. 시퀀스에 있는 항 체의 위치에 대 한 추가 벗기는 단계 수가 다릅니다.
- 톰을 사용 하 여 양수 및 음수 제어 조직의 3 µ m 얇은 섹션을 잘라내어 현미경 폴 리-L-리 신-코팅 유리 슬라이드에 섹션을 배치.
- 3 하는 적절 한 청소 솔루션을 사용 하 여 섹션 dewax x 4 분. 100% 알코올, 90% 알코올, 및 70% 알코올, 4 분에 슬라이드 리하이드레이션 2-3 분 증류수에 슬라이드를 넣어.
- 표준 항 원 검색 버퍼 (상용)에 전자 레인지-안전 유리 항아리에 슬라이드를 잠글 슬라이드를 놓습니다. 25 분에 98 ° C에 pH9 항 원 검색 솔루션에 적합 한 전자 레인지를 사용 하 여 열 유도 epitope 검색 (여기)를 수행 합니다.
참고: 800-1100 와트에서 배열 하는 압력을 가진 모든 전자 레인지를 사용할 수 있습니다, 그리고 여기에 따라 최적화할 수 있습니다. 이 경우에, 다기능 전자 레인지 조직 프로세서 (공기에 오픈) 여기와 스트립 사용 되었다. 특정 epitope의 검색에 대 한 초기 설정은 기존의 IHC에서 사전 지식을 기반으로 합니다. - 전자 레인지 (3 패널에서 제 4 항 체에 대 한이 경우에) 스트립의 추가 라운드, 98 ° C에 100% 파워와 동일한 온도 10 분 20% 전원 각 라운드를 수행 합니다. 적어도 10 분 동안 증류수에 슬라이드 아래로 냉각 하십시오.
참고: 마이크로파 난방 제안 된 멀티플렉스에서 단계의 동일한 수에 대상 항 원 노출 수염 경우 단계 스트립의 여러 라운드를 수행 합니다. CD20 4 항 체로 계획, 이후 스트립 전에 3 배 및 1 차적인 항 체 외피를 하 고 후 한 번 전자 레인지 할. - 확인 하 고 추가 전자 레인지 스트립 하는 동안 5 분 마다 후 버퍼를 보충. 중요 한 것은, 슬라이드 여러 스트립 절차 동안 완전히 말리 게 하지 마십시오. 전자 레인지에서 슬라이드를 찍을 때 사용 하 여 집게 및 내 열 장갑 증류수의 별도 항아리에 그들을 배치. 자연스럽 게 냉각 항 원 검색 솔루션에 대 한 기다립니다.
- 10 분 동안 상업 과산화 효소 블록을 사용 하 여 조직 과산화 효소 활동을 차단 (3%의 과산화 수소는 다른 시 약으로 사용할 수 있습니다). Tris 버퍼 염 분 (TBS)와 5 분 동안 비 세제 세척.
참고: TBS 50 mM Tris Cl, pH 7.5, 및 150 mM NaCl.TBS TBS. 수 있도록 구성 되어 - 항 체 희석 액 또는 관심의 1 차적인 항 체를 가진 외피 다음 15 분 동안 소 혈 청 알 부 민 블록 (예를 들어, CD20, 1:2,000 항 체 희석 액에 희석 재료의 표참조) 30 분에 대 한 실 온에서 3 x 세척 TBS-D 5 분 각 시간에 대 한 버퍼입니다. 충분 한 TBS 차원 버퍼 슬라이드 모든 세척 단계에 완전히 몰입할 수 있어야 합니다.
참고: 소 혈 청 알 부 민 대체 항 체 희석제로 사용할 수 있습니다. 항 체 희석 액의 볼륨 (위해 절단 샘플 조직 microarray) 400 µ L까지 (대 한 생 검 견본) 50 µ L에서 조직의 크기에 따라 달라 집니다. - 적절 한 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 품 어-실 온에서 15 분에 대 한 1 차적인 항 체 근원의 종 기초 선택 이라는 2 차 항 체. 워시 5 분 TBS 차원 버퍼와 3 배 각 시간.
- 적절 한 tyramide 기반 형광 시 약 (증폭 희석제에 1: 100)을 적용 하 고 5 분 동안 실 온에 fluorophore 1 차적인 항 체 바인딩 사이트에서 조직 샘플을 활용 수 있도록 품 어. 워시 5 분 TBS 차원 버퍼와 3 배 각 시간.
- 수행 하는 추가 전자 레인지 기반 스트립 차 및 2 차 항 체를 제거 하. 시퀀스에 있는 항 체의 위치에 따라 필요에 따라 반복 합니다.
- 장소를 증류수에 슬라이드. 10 분 뒤에 씻어 DAPI에서 (항 체 희석 액 1: 100 희석)와 품 어 5 분 각 시간에 대 한 TBS 차원 버퍼와 3 배. 물티슈와 티슈 없이 슬라이드에 영역을 건조 하 고 적절 한 설치 미디어와 슬라이드를 탑재.
- 이미지 슬라이드 (참조 섹션 6과 7이이 프로토콜의) 얼룩 (으로 긍정적이 고 부정적인 제어 조직의 분명 차별에 의해 정의 된)의 적합성을 결정 하 고.
참고: 얼룩 패턴 올바르지 않으면, 다시 다음 매개 변수 중 하나 이상을 조정 후 얼룩 수염: 열 검색 수 단계, 열 검색, 부 화 기간/항 체의 농도의 금액 (기본 및 보조), 시퀀스, 그리고 fluorophore의 선택에서 항 체의 위치. 단계를 일반적으로 얼룩이 수염 적합 한 적절 한 얼룩에 대 한 매개 변수 집합을 얻기 위해 최적화의 여러 라운드를 필요 합니다. 그것은이 마지막 다중 집합 결정에 유연성을 제공 합니다 각 1 차 항 체로 fluorophores의 범위를 테스트 하는 것이 좋습니다.
4. 각 항 체는 다중 프로토콜에 대 한 수염의 반복
- 시퀀스에 있는 항 체의 위치에 따라 단계를 제거 하는 전자 레인지의 수를 조정 하 여 비슷한 방법으로 다른 항 체에 대 한 얼룩 수염을 반복 합니다. 예를 들어, 6-플렉스 멀티플렉스 패널에 제 3 항 체에 대 한 얼룩 수염을 수행할 때 수행 하기 전에 두 전자 렌지 스트립 단계 및 3 전자 레인지 벗기는 단계 1 차적인 항 체 외피 후.
참고: 그것은 그도 여기에 샘플을 제공 항 체의 전자 레인지 기반 스트립을 감사 하는 것이 중요입니다. 경우 특정 항 체는 다른 epitope 검색 전략,이 다중 시퀀스를 계획할 때 고려 될 필요가 있다. 이 예제에서는 Ki67 epitope 검색 pH 9, 30 분 필요합니다. 여기의 25 분 이전에 할 수 때문에 필요는 KI67 순차적 프로토콜, 여기만 있는 여분의 5 분에에서 얼룩.
5. 다중 프로토콜을 얼룩이 지기
참고: 모든 구성 요소 얼룩 경우 수염을 사용 하 여 최적화 된 후에 프로토콜을 얼룩이 지는 멀티 플렉스 진행. 수염 얼룩의 결과 검토 하 고 멀티 플렉스 및 각 항 체에 대 한 fluorophore의 선택 순서는 최종 레이아웃을 보여 주는 테이블을 디자인 합니다. 항 체 농도의 세부 사항을, 얼룩, 그리고 시퀀스의 기간 및 여기에 사용 된 각 항 체에 대 한 열 검색의 표 1에 제공 됩니다.
- 긍정적이 고 부정적인 제어 조직의 컷 3 µ m 얇은 섹션 (여기, 림프 종의 FFPE 샘플) 관심의 대상 조직으로는 톰을 사용 하 고 현미경 폴 리-L-리 신-코팅 유리 슬라이드 ( 재료의 표참조)에 섹션을 놓습니다.
참고: 패널에서 각 항 체에 대 한 긍정적이 고 부정적인 컨트롤의 포함은 권장, 멀티 플렉스에 대 한 실제 예제와 함께. 얼룩 프로토콜 올바르게 수행한 확인 가능 합니다. - Dewax, 열 유도 epitope 검색 (여기)를 수행 하 고 수염 프로토콜 단계 3.3-3.5에서 조직 과산화 효소 활동을 차단.
- 이전 수염 경우 단계를 사용 하 여 결정 하는 최적화 된 다중 시퀀스의 첫 번째 주 항 체와 함께 품 어. 이 예제에서 BCL-6, 1시 30분에 60 분 동안 실내 온도에 희석제 항 체에 희석 ( 재료의 표참조), 다중 프로토콜의 첫 번째 단계를 했다. 5 분 동안 TBS 차원 버퍼 씻어.
- 적절 한 HRP 붙인 2 차 항 체로 사전에 사용 되는 기본 항 체의 종류에 따라 품 어 TBS 차원 버퍼 5 분 10 분 세척에 대 한 실 온에서 ( 재료의 표참조) 단계.
- 최적화 된 tyramide 기반 형광 시 약 (증폭 희석제에 1: 100이 예에서 Cy5 재료의 표참조) 5 분 동안 실 온에서 부 화와 함께 적용 합니다. 부 화 후 5 분 동안 TBS 차원 버퍼 씻어.
참고: tyramide 기반 형광 시 약의 선택은에 따라 최적화 된 수염 경우. - 적절 한 현미경을 사용 하 여 첫 번째 항 체의 얼룩의 효율성을 확인 ( 재료의 표참조).
참고: 중간 검사 이미징 샘플 TMA 또는 단일 슬라이드 경우 쉽게 할 수 있습니다. 그러나 경우,, 얼룩 여러 슬라이드에 수행 되 고, 두 일 수 있습니다 그리고이 단계를 생략할 수 있다. - 전자 레인지 수염 단계에서 최적화 된 조건을 사용 하 여 프로토콜에서 두 번째 항 체에 대 한 스트립을 수행 합니다. 그런 다음, 두 번째 주 항 체의 얼룩과 진행 (여기, BCL2) HRP에 꼬리표를 붙이는 이차 항 체와 형광 시 약 tyramide 기반 (여기, 520, 재료의 표참조). 얼룩이 지기의 두 번째 라운드의 완료 후에 형광 현미경 얼룩의 효율성을 확인 하십시오.
- 마찬가지로, 세 번째를 사용 하 여 프로시저를 반복 시퀀스에서 제 4, 및 5 항 체 (여기, c-Myc, CD20와 ki67, fluorophores 570, 540, 및 620와 각각, 각각). 가능한 경우 각 단계 사이 이미징 검사를 수행 합니다.
- 10 분 동안 핵 counterstain (DAPI, 희석제 항 체에서 1: 100 희석)를 추가 하 고, 다음, 5 분 동안 TBS d에서 2 x을 씻어.
- 적절 한 장착 시 약을 사용 하 여 슬라이드를 탑재 합니다.
6. 준비 스펙트럼 라이브러리의 슬라이드
참고: 섹션 6-8이이 프로토콜의 스펙트럼 카메라를 사용 하 여 몇 군데는 멀티플렉스 실험 독특합니다.
- Multispectral 이미지 분석에 사용할 동일한 제어 조직에 각 fluorophore, DAPI, 및 autofluorescence에 대 한 라이브러리 슬라이드 (단일 얼룩 참조 이미지)를 만듭니다.
- (여기, 림프 종 샘플 또는 제어로 편도 선)의 조직 형식의 2 x 3 µ m 얇은 섹션 잘라내기는 톰을 사용 하 여 및 현미경 폴 리-L-리 신-코팅 유리 슬라이드에 섹션을 배치.
- 두 프로세스 (와 모든 스트립 단계 세척), 수염 프로토콜을 사용 하 여 슬라이드 항 체 또는 fluorophore 추가 하지 않고.
- 얼룩 DAPI 단계 5.9 당 하나의 슬라이드와 떠나 한 슬라이드 흠 없는 (조직 autofluorescence 스펙트럼의 생성)에 대 한.
참고: (DAPI 없이 단일 형광 염료)와 최적화 된 수염 슬라이드 사용할 수 있습니다으로 스펙트럼 라이브러리 슬라이드 각 형광 염료의 스펙트럼 생성 하.
- 이러한 적절 한 필터를 사용 하 여 슬라이드의 스캔 하 고 이미지 분석 라이브러리에 그들을 업로드.
7. 스펙트럼 이미징
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수염 슬라이드 스캔
- 사용 가능한 표준 피 형광 필터 (DAPI, FITC, CY3, 텍사스 레드와 CY5) 고용된 fluorophore 적합에서 필터를 선택 하십시오.
참고:이 예제에 사용 된 특정 fluorophores에 대 한 권장된 필터 큐브 표 215에 표시 됩니다. - 깨끗 한 신호를 적당 한 노출 시간을 식별 하는 해당 형광 채널에서 각 표식을 검사 합니다. 표식에 대 한 강한 신호 되어 조직 구성 요소에 초점을.
- (비록 일부 상용 플랫폼 표준화 전략 노출에서 차이 담당 하는) 픽셀 강도의 간 샘플 비교를 허용 하도록 각 분석 (항 체 fluorophore 조합)에 대 한 고정된 노출 시간을 결정 합니다.
- 특정된 채널에 대 한 고정된 노출 시간에 대 한 결정, 라이브 카메라 설정을 사용 하 여 라이브 카메라 이미지에 아무 설쳐 영역까지 노출 시간을 조정 하 고 모든 채널에 대 한 이것을 반복 합니다.
- 수염 슬라이드를 스캔 생성 시뮬레이션된 명시 이미지 (함수가 사용 하는 소프트웨어에서 사용할 수 있는 경우에) 정상적인 IHC 패턴으로 시각적으로 비교 하 고정확한 (그림 1 및 그림 2 얼룩 패턴 인지 확인 하려면 ).
- 사용 가능한 표준 피 형광 필터 (DAPI, FITC, CY3, 텍사스 레드와 CY5) 고용된 fluorophore 적합에서 필터를 선택 하십시오.
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다중 샘플 스캔 (TMA 슬라이드 / 여러 샘플)
- 수염 이미지 (단계 6.1) 스캔에 대 한 설명 된 대로 광학 매개 변수를 설정 합니다. 첫째, 초점을 조정 하는 수동 또는 자동으로 (특정 이미지 검색 시스템의 지시에 따라). 둘째,는 TMA에 모든 코어 또는 모든 슬라이드에 적절 하 게 노출 되도록 형광 각 채널에 대 한 노출 시간을 조정 합니다.
참고: 영역 노출 시간을 조절 하려면 선택이 중요 합니다. 사용자가 각 필터에 대 한 강한 신호 영역을 선택 해야 (즉, Ki67 신호는 nongerminal 센터 지역 보다 편도 선 어린 싹 센터 지역에 강한, 따라서, 사용자는 적절 한 노출에서 설정 새싹 센터 영역을 사용 해야 시간)입니다. 사용자가 또한 사용 가능한 경우 이미징 시스템의 oversaturation 보정 기능을 채택할 수 있다. - TMA 스캐닝 모드 경우 이미징 시스템과 적절 한 자동 초점 알고리즘에서에서 사용할 수 있는 TMA 슬라이드를 스캔 합니다.
- 전체 조직 섹션 슬라이드, 슬라이드 가장 대표적인 종양 분야에서 최적의 이미지를 선택 하는 자격 갖춘된 병리학 자에 의해 검토를 얻을.
참고: 여기에 설명 된 프로토콜 기반 정의 현미경/이미지 분석 시스템 ( 재료의 표참조). 다른 기계 및 이미지 분석 소프트웨어를 스캔 하 고 멀티플렉스 IHC 슬라이드7을 분석할 수 있다.
- 수염 이미지 (단계 6.1) 스캔에 대 한 설명 된 대로 광학 매개 변수를 설정 합니다. 첫째, 초점을 조정 하는 수동 또는 자동으로 (특정 이미지 검색 시스템의 지시에 따라). 둘째,는 TMA에 모든 코어 또는 모든 슬라이드에 적절 하 게 노출 되도록 형광 각 채널에 대 한 노출 시간을 조정 합니다.
8. 데이터 분석
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Preanalysis 평가 및 계획
- Autofluorescence에 대 한 참조 슬라이드를 사용 하 여 분석에 대 한 스캔 한 이미지에서 autofluorescence를 뺍니다.
- 아티팩트를 얼룩 없이 그들에 초점을 분석 하기 전에 이미지를 검토 합니다.
- 종양 마커 (예를 들어,이 예제에서 CD20) 관심사의 세포를 사용 하 여와 셀 분할, 점수, 및 배치 분석 진행을 접근. CD20-긍정적인 분석에 대 한 셀을 선택 합니다.
참고: 예를 들어는 DLBCL에서 샘플 분석 여기, 설정 및 핵 크기를 기반으로하는 셀 세분화 하 고 강렬 하지만 사용 하는 이미지 분석 소프트웨어에는 정의 된 매개 변수 (예를 들어는 DAPI 의미에서 픽셀 강도 최소 0.05; 2 분할 감도 80-320 픽셀 사이 크기 [이것이 종양의 형태에 크게 의존 하는 소프트웨어 특정 매개 변수: 작은 종양 세포, 분할에 대 한의 0.7-1 적절 한 이며 큰 종양 세포에 대 한 분할 조정 될 수 있다 최대 하 4]). - 개별 이미지를 검토 하 여 조직 세분화 종양 농축 셀 영역을 선택 하 고 괴 사 arearegion orand 풍부한 반응 셀 영역을 제외 하는 데 필요한 여부 결정 된 병리학 자에 대 한 요청입니다. 추가 조직 세분화가 필요한 경우 다음 적절 한 제어 영역 (예: 종양 세포/기질/괴 사)를 선택 하 고 이미지 분석 소프트웨어 같은 영역을 식별 올바르게 수 확인
- 조직 세분화 (있을 경우), 후 셀 분할 진행 의도 세분화의 충실도 보장 하기 위해 셀 분할 지도 검토 된 병리학 접근5요청.
- 가장 생물학/임상 적절 한 분석 방법 (예를 들어, 백분율 양성, 또는 셀 당 평균 강도)의 주어진된 biomarker에 대 한 확인 합니다.
- 컷오프 값 (백분율 양성)에 대 한 각 마커를 선택 합니다.
- 병리학 자와 함께에서 각 표식에 대 한 광 강도 긍정적인 컷오프 값을 결정 합니다. 적절 한 통계 소프트웨어의 강도/셀 표식의 주파수 분포를 분석 하 여 히스토그램을 생성 ( 재료의 표참조).
참고: 강도 값 히스토그램 신호 농도의 분포에 대 한 개요를 제공할 수 있습니다. - 히스토그램에서 대략적인 인하를 결정 하 고 병리학 자 검토, 선택 된 이미지에 수동으로 결정된 컷 오프와 상관 관계를이 확인 합니다. 경우에 따라 균일 한 단일 잘라 얼룩, 다양성 때문에 가능한 되지 않습니다 하 고 각 샘플에 대 한 수동 컷오프 값이 요구 될 것 이다.
참고: 섹션 8.1에서에서 이루어져야 한다 이미지 분석 소프트웨어 ( 재료의 표참조) 별도로 지정 하지 않는 한.
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긍정적이 고 부정적인 셀 표시
- (히스토그램을 통해 또는 수동으로) 결정, 차단 번호에 따라 관심의 각 마커를 사용 하 여 "IF" 또는 비슷한 논리 수식을 표시와 함께 긍정적이 고 부정적인 셀 값 표시: 1 긍정적인 세포에 대 한 숫자, 번호 0 부정적인 세포에 대 한.
- 모든 마커의 양성을 위해 각 마커 (1 또는 0) 별도 열에 제품의 표시 값을 곱하면 됩니다. 제품 1 인, 셀은 모든 표시에 대 한 긍정적인 의미 합니다. 양성 및 특정 마커의 부정에 대 한 IF 논리 알고리즘을 사용 합니다.
참고: 섹션 8.2 통계 소프트웨어에서 일을 해야 ( 재료의 표참조).
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백분율 데이터 및 피벗 테이블을 사용 하 여 숫자 데이터를 생성
- 백분율 데이터 정의 된 셀 (예를 들어, CD20 양성 세포, 또는 CD20-부정적인 세포) 내 관심의 특정 마커를 생성 (그림 6).
- 데이터 시트에는 피벗 테이블을 삽입 합니다.
- 단일 마커, CD20, 등의 양성 비율을 계산 하는 CD20의 합계를 사용 하 여 CD20 양성 세포의 총 수를 계산 하려면 피벗 테이블의 값 부분에서 SUM 함수를 선택+ 세포로 나눈는 총 셀 수입니다. 결과는 CD20+ 세포 하나의 코어 또는 (피벗 테이블 행의 선택에 따라) 한 연구 수 비율.
- 같은 방법 (그림 3). 을 사용 하 여 여러 마커의 양성 비율을 계산
- 숫자 데이터를 생성 합니다. 각 마커는 샘플 (그림 4)에서 공부 하는 모든 셀의 평균 강도 취득 하 여 각 코어 또는 각 연구 수의 각 표식에 대 한 중간 정규화 된 수를 추출 합니다.
참고: 중앙값 수 없습니다 파생 될 피벗 테이블에서 직접. 이 수식을 사용 하 여 파생 될 수 있다: 중간 (IF (열 연구 수의 = 특정 연구 번호, 정규화 된 값의 열)).
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적합 한 그래프에 데이터 플롯
- 백분율 양성 또는 추가 통계 테스트 및 프레 젠 테이 션에 대 한 적절 한 방식으로 관심 유형의 셀에 표식 당 평균 강도 결과 플롯 합니다.
- 숫자와 분포의 시각화를 제공 하기 위해 점 플롯을 만듭니다.
참고: 막대 그래프와 데이터를 나타내는지 않습니다 전달 하지 배포에 대 한 정보. 추정 플롯 또한 샘플16사이의 차이의 크기에 중점을 두고 데이터 표현 위한 좋은 방법으로 권장 됩니다.
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Representative Results
mf IHC BCL2 유전자 재배열 (더블 히트 림프 종)와 C-MYC DLBCL 샘플에 대 한 이미지는 그림 1에 표시 됩니다. 그림 2 에서는 시뮬레이션된 밝은 필드 immunohistochemical 이미지를 보여 줍니다. 그림 3 백분율 데이터의 생성을 나타냅니다. 그림 4 는 숫자 데이터의 생성에 대 한 중간 공식의 세부 정보를 표시합니다. 그림 5 angioimmunoblastic T-세포 림프 종에서 T-셀 패널의 mf IHC의 응용 프로그램을 보여 줍니다. 그림 6 편도 선 컨트롤 샘플 및이 샘플에 대 한 데이터 분석의 최적화 이미지를 보여준다.
그림 1: B 세포 면역 형광 패널 이미지 C-MYC 및 CL2 유전자 재배열 (더블 히트 림프 종)와 확산 큰 B-세포 림프 종 (DLBCL) 샘플에 대 한 다중화. 마젠타 = CD20 (멤브레인); 흰색 = BCL2 (세포질); 노란색 = Ki67 (핵); 녹색 = C-MYC (핵); 빨간 BCL6 (핵), 블루 = = DAPI (핵 counterstain). CD20 양성 종양 세포 C-MYC (80%) 및 BCL2 높은 식 표시 (> 90%), Ki67 확산 색인은 또한 높은 (90%). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: C-MYC 및 BCL2 유전자 재배열 (더블 히트 림프 종)와 같은 DLBCL 샘플의 밝은 필드 immunohistochemical 이미지 ( 그림 1에서 생성 된)를 시뮬레이션. CD20 막 종양 세포에 얼룩을 보여줍니다. BCL2 세포질에 얼룩을 보여줍니다 > 종양 세포의 90%. C-MYC 양성 약 80%입니다. BCL6 보여줍니다 핵 세포의 약 20%에서 얼룩. Ki67 세포의 90%에 긍정적 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 연구 번호 백분율 데이터를 생성 하는 방법을 보여 주는 피벗 테이블. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 연구 번호에 따라 정규화 Ki67 OD 값에 대 한 중간 공식. IF 문은 모든 연구 번호를 (즉,이 그림에서 52) 특정 연구 번호를 찾습니다. 다음, 그것은 해당 Ki67 정규화 값을 반환합니다. Ctrl + Shift + Enter 키 조합을 연구 번호 52 11.56이 반환 된 값에 대 한 중간값 (Ki67 중간값) 계산에 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 면역 형광 패널 이미지는 angioimmunoblastic T-세포 림프 종 (AITL) 샘플에 대 한 다중화. (A) 합성 이미지는 AITL 샘플의 세포질이 보여 줍니다. 마젠타 = CD20 (멤브레인); 노란색 = CD4 (멤브레인); 녹색 PD1 = (멤브레인); 빨간색 = BCL6 (핵); 하늘색 = CD8 (멤브레인); 블루 = DAPI (핵 counterstain). (B) 이미지의 위쪽 행 패널 A에 백색 상자에서 선택한 영역의 확대 보기를 보여 줍니다. 이미지의 아래쪽 행 표시 셀 마스크 세그먼트 해당: 황색/적색/녹색 각각 단일 CD4/BCL6/PD1-긍정적인 세포를 보여주는. 블루 부정적인 세포, 나타내고 백색 두 배 긍정적인 세포를 나타냅니다. 이미지 공개는 CD4의 50%+ 세포는 PD1+ (왼쪽된, 화이트), CD4의 20%를 동안+ 세포는 또한 BCL6에 대 한 긍정적인 (중, 화이트). PD1 및 BCL6 이중 양성 속도가 약 10% (오른쪽, 흰색)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 편도 선 제어 조직 면역 형광 최적화 이미지 다중화. (A) 합성 이미지 편도 선 컨트롤 샘플의 어린 싹 센터 영역 표시. 노란색 = C-Myc (핵); 빨간색 = BCL6 (핵); 녹청 BCL2 = (세포질); 마젠타 = CD20 (멤브레인); 녹색 = Ki67 (핵); 블루 = DAPI (핵 counterstain). C-Myc만 몇 셀에에서 긍정적 이다. BCL2는 어린 싹 센터 밖에 서 주로 긍정적인 BCL6와 Ki67는 어린 싹 센터 내 주로 긍정적 이다. CD20 새싹 센터 내외 만들어진다 긍정적 이다. (B) 테이블 새싹 센터 CD20 양성 세포는 또한 BCL6와 Ki67 긍정적인 보여줍니다 하지만 BCL2에 대 한 부정적인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 항 체 얼룩이 지기의 순서 | 1 차적인 항 체 (재료의 표 참조) | 필요한 총 여기 | 실제 사전 얼룩 여기 | 이차 항 체 | Fluorophore | 포스트-TSA 항 체 스트립 |
| 1 | 마우스 안티-Bcl6 (1:30, 60 분 RT) | 25minutes, Ph9 | 25minutes, Ph9 | 반대로 마우스 1:1000 HRP 활용 ' 10'에 대 한 | 1: 100에 오 팔 Cy5 | 1 라운드 1 분, 10 분 동안 20% 전원 100% 전원 |
| 2 | 마우스 안티-Bcl2(1:50,60 min RT) | 25minutes, Ph9 | 없음 | 반대로 마우스 1:1000 HRP 활용 ' 10'에 대 한 | 1: 100에서 520 오 팔 | 1 라운드 1 분, 10 분 동안 20% 전원 100% 전원 |
| 3 | 토끼 반-c-MYC(1:50,30 min RT) | 25minutes, Ph9 | 없음 | HRP 활용 된 반대로 토끼, 1:1000' 10'에 대 한 | 오 팔 570 1: 100 | 1 라운드 1 분, 10 분 동안 20% 전원 100% 전원 |
| 4 | 마우스 안티-CD20(1:2000,30 min RT) | 25minutes, Ph9 | 없음 | 반대로 마우스 1:1000 HRP 활용 ' 10'에 대 한 | 오 팔 540 1: 100 | 1 라운드 1 분, 10 분 동안 20% 전원 100% 전원 |
| 5 | 마우스 안티-기-67(1:50,45 min RT) | 30 분, Ph9 | 5 분 pH9 | 반대로 마우스 1:1000 HRP 활용 ' 10'에 대 한 | 오 팔 620 1: 100 | 1 라운드 1 분, 10 분 동안 20% 전원 100% 전원 |
표 1: 얼룩 경우 멀티 플렉스에 대 한 최종된 레이아웃의 예. 이 표에서 여기와 스트립 전자 레인지-기반 해야 할 각 단계에서 일단 수염 얼룩 최적화 된 금액을 지정 하는 방법의 예를 제공 합니다.
표 2: fluorophores에 대 한 필터 선택으로 가이드. 이 표에서 fluorophores 관심의 시각화를 지정 된 장비에 사용할 수 있는 적절 한 필터를 향해 거친 가이드를 제공 합니다. 현미경 사용 fluorophores의 방출/여기 프로 파일에 관하여 사용 되 고 필터 사양을 확인 하는 것이 좋습니다.
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Discussion
mf IHC 병리학 림프 병 리에 diagnosticcriteria를 수정 하 고 임상 결과의 예측으로 특정 세포 유형에서 바이오 마커의 역할 분석을 사용 하도록 가능성이 있다. 새로운 연구 방법으로 mf IHC 점점 종양 세포17의 여러 면역 매개의 양적 및 공간 확인에 적용 됩니다. 종양 마커의 공동 식 mf IHC의 검출 재현성 및 신뢰성5표시 되었습니다. 그러나, 기술은 초기와 시 약 및 조직 고정 및 처리에 불일치 때문에 그들에 같은 조직 관련 요인에서 발생 하는 변화를 복종 남아 있습니다.
기술에 중요 한 특정, 잘 검증 된 항 체 사용 하는 민감하고 재현 가능한 결과 제공. 원래 그들의 항 원에 대 한 구체적 설명 및 나중 시연 노크 아웃 모델14사용 없는 단백질을 인식 하는 항 체의 문학에서 예입니다. 어떤 야생-타입에 노크 아웃 / 눕 유효성 검사 메서드 또는 기 절 또는 siRNA 또는 CRISPR 메서드 뜨 목표와 셀 부정적인 컨트롤로 사용 하는 동안 긍정적인 컨트롤로 overexpressed 항 서브로 셀.
기존의 IHC mf IHC 최적의 얼룩 및 결과 대 한 모든 실험에 대 한 최적화 하는 데 필요한 많은 중요 한 변수는. Antigen 검색 솔루션, 항 체 희석, 각 표시에 fluorophore의 임무와 fluorophore의 농도의 산도 포함 됩니다. 일반적으로 사용된 항 검색 솔루션은 pH 6과 9의. 그것은 어떤 pH 제공 최적의 얼룩 패턴 및 적은 배경으로 강도 시험을 가치가입니다.
그것 뿐 아니라 오 팔 fluorophores 강도 뿐만 아니라, 항 체의 선호도에 따라 다중 실험에서 항 체의 응용 프로그램의 시퀀스에 대 한 결정 구체적인 지침은 없습니다. 일반적으로, 약한 선호도와 항 체 자주 수염 얼룩에 따라 높은 농도 요구 하 고 멀티플렉스 시퀀스에서 먼저 적용 됩니다. 스트립에 저항력이 있는 강한 친 화력 항 체는 일반적인 얼룩을 피하기 위해 마지막으로, 적용 됩니다. 특정 fluorophore의 선택에 관한 동일한 세포질 구획에서 colocalize는 항 원에 대 한 유사한 스펙트럼 파장 fluorophores를 사용 하지 않도록 바람직합니다. 낮은 식 수준의 항와 밝은 fluorophores 반대로할당 됩니다. 경우, 연구 샘플에서 신호 강도 약한, 오 팔 TSA 희석 조정 원하는 신호18를 달성 하기 위해 할 수 있습니다. 경우에 따라 1 차 항 체 농도 증가 또는 다른 항 원 검색 방법을 시도 작동 수 있습니다. 1 차적인 항 체의 초기 희석 같은 기존의 IHC 실험에 설립 될 수 있습니다. 그러나, IF 신호는 명확 하지 않습니다, 경우 다른 항 체 희석의 테스트 될 것입니다 필요, IHC 최적화 조건에 항상 번역 하지 않습니다. 신호 강도 순서 또는 immunostaining의 순서에 의해 영향을 받습니다. 일부 초과 MWT 인해 저하 될 수 있습니다 반면 일부 epitopes MWT의 2 개 또는 3 라운드 후 설쳐는. 특정 fluorophores MWT에 의해 영향을 받을 수 및 감쇠에 대 한 테스트 해야.
이 프로토콜은 colocalization 및 마커 악성 B 세포 림프 종에 있는 셀의 하위 집합 내에서 농도의 측정에 집중 한다. 현재 프로토콜의 개발에 핵심 과제 같은 세포질 구획에 colocalize 항 원에 대 한 최적화 된 다중 패널의 세대를 포함 한다. 정확한 정량화를 위한 fluorophores의 정확한 unmixing 될 필요 합니다. 멀티플렉스 패널 자리에 일단 얼룩진된 슬라이드의 이미지는 상대적으로 간단 합니다. 다음 장애물 이미지 데이터의 분석을 포함 한다. 달리 면역 침투 연구에서 특정 면역 세포 유형 상피 종양 내에서 정량은 간단 림프 종에서 colocalization 연구에 크게 의존의 각 표식에 대 한 숙련 된 병리학 자에 의해 양성의 정의 관심입니다. 일상적인 임상 연습에 적용할 수 있는 적절 한 진단 컷오프에서 파생 진행 중인 작업에 남아 있다. 이 기술은 일상 진단에 통합 될 수 있습니다 전에 데이터 표준화 및 자동화 된 컷오프 삼각 측량의 방법에 더 수정 필요 있을 것입니다.
현재 한계에도 불구 하 고 종양 세포의 연구는 microenvironment과의 공간 관계에서 얻을 수 있는 지식과 mf IHC의 잠재적인 응용 프로그램은 조직학 도전 위한 특히 매력적인 도구 림프 종은 같은 암. 추가 작업은 조직 고정 하 고 얼룩 기법, 대상의 증가 수의 동시 분석을 허용 하기에 있는 증진 뿐만 아니라 제안 된 워크플로 대 한 최적의 조직 처리 프로토콜 설정 필요 합니다.
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Disclosures
A.D.J.는 사용자 그룹 회의에 여행으로 퍼 킨 엘머에서 자금 지원을 받고 있다. 저자는 공개 다른 충돌의 관심을가지고.
Acknowledgments
S. B.N. 및 A.D.J. 싱가포르의 보건의 국립 의학 연구 위원회 전환 어워드 (NMRC/TA/0020/2013 NMRC/TA/0052/2016)에 의해 지원 됩니다. 저자는 싱가포르 국립 대학 암 연구소의 Vectra 스펙트럼 영상 현미경의 구입으로에서 A.D.J.에 용 Siew 윤 연구 그랜트를 인정합니다. 이 연구는 싱가포르 NHG 도메인 특정 검토 보드 B에 의해 승인 (2014/00693).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
References
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