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Immunology and Infection

मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट Immunohistochemical धुंधला, इमेजिंग, और विश्लेषण लिंफोमा के ऊतकवैज्ञानिक नमूनों में

Published: January 9, 2019 doi: 10.3791/58711
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 2, 2, 2, 4, 4, 2,3, 2,4
1Department of Laboratory Medicine, AnSteel Group General Hospital, 2Cancer Science Institute of Singapore, National University of Singapore, 3Department of Pathology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 4Department of Haematology-Oncology, National University Health System
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट immunohistochemical धुंधला और एकाधिक कैंसर के एक साथ स्थानीयकरण के लिए इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-लिंफोमा में जुड़े एंटीजन । इस प्रोटोकॉल सभी ऊतक वर्गों के भीतर के colocalization विश्लेषण के लिए बढ़ाया जा सकता है ।

Abstract

प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति के इन-सीटू विश्लेषण के लिए Immunohistochemical (आइएचसी) तरीकों दोनों अनुसंधान और नैदानिक प्रयोजनों के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं । हालांकि, दृश्य और ठहराव पारंपरिक chromogenic आइएचसी का उपयोग कर एक एकल ऊतक अनुभाग में एकाधिक प्रतिजनों के चुनौतीपूर्ण है । मल्टीप्लेक्स इमेजिंग लिंफोमा अनुसंधान और निदान, जहां मार्करों एक जटिल ट्यूमर microenvironment के संदर्भ में व्याख्या की है में विशेष रूप से प्रासंगिक है । यहां हम मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट आइएचसी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए लिंफोमा में ब्याज की विशिष्ट कोशिका प्रकार में कई लक्ष्यों के मात्रात्मक मूल्यांकन सक्षम धुंधला । विधि एंटीबॉडी सत्यापन के पहलुओं को शामिल किया गया, एंटीबॉडी अनुकूलन, लिंफोमा उपप्रकार के मार्कर के साथ मल्टीप्लेक्स अनुकूलन, ऊतक microarray के धुंधला (TMA) स्लाइड, और स्लाइड की स्कैनिंग, डेटा विश्लेषण के द्वारा पीछा किया, विशिष्ट के साथ लिंफोमा के संदर्भ में । इस विधि का प्रयोग, दोनों के लिए स्कोर ब्याज की एक मार्कर और प्रतिशत धनात्मकता का मतलब तीव्रता के लिए और अधिक मात्रात्मक विश्लेषण की सुविधा उत्पंन कर रहे हैं । division नमूना उपयोग को कम करता है और प्रत्येक रुचि के मार्कर के लिए स्थानिक जानकारी उपलब्ध कराता है ।

Introduction

लसीकावत् ट्यूमर लिम्फोसाइटों के अनियंत्रित घातक प्रसार के कारण होते हैं । इन कोशिकाओं प्रतिरक्षा प्रणाली के महत्वपूर्ण घटक है और प्राथमिक और माध्यमिक प्रतिरक्षा अंगों के लिए स्थानीयकरण, अस्थि मज्जा, लिम्फ नोड्स, तिल्ली, और अन्य म्यूकोसा से जुड़े लसीकावत् प्रणाली के रूप में । लसीकावत् ट्यूमर विकारों का एक विषम समूह है जो सुविधाओं का एक नक्षत्र, आकृति विज्ञान, immunophenotype, आनुवंशिक सुविधाओं, और नैदानिक प्रस्तुति सहित, के आधार पर वर्गीकृत कर रहे हैं । जबकि प्रत्येक पैरामीटर एक हिस्सा निभाता है, वंश एक परिभाषित विशेषता बनी हुई है और जो वर्गीकरण प्रणाली जो बी कोशिकाओं, टी कोशिकाओं से व्युत्पंन ट्यूमर पहचानता है के लिए आधार रूपों, और प्राकृतिक खूनी (NK) कोशिकाओं1।

लिंफोमा के वर्गीकरण के लिए कुंजी2लिम्फोसाइटों के विभिंन उपप्रकार के ल्युकोसैट सतह मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी के लक्षण वर्णन किया गया है । Immunohistochemistry (आइएचसी) परंपरागत रूप से ऐसे मार्करों के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है और विशिष्ट प्रतिजन-एंटीबॉडी मांयता के सिद्धांत पर आधारित कोशिका का पता लगाने के लिए और ऊतक आधारित अणुओं है कि प्रकाश माइक्रोस्कोप के माध्यम से visualized किया जा सकता है 3. हालांकि, पारंपरिक उज्ज्वल क्षेत्र chromogenic मल्टीप्लेक्स आइएचसी द्वारा एक ही स्लाइड पर कई लक्ष्यों की पहचान सीमाएं है क्योंकि यह अक्सर एक एकल ऊतक अनुभाग मज़बूती पर एकाधिक रंग संकेतों को भेद करने के लिए मुश्किल है-विशेष रूप से एक बहुत कम अभिव्यक्ति के साथ एंटीजन के लिए4. दृश्य मूल्यांकन और धुंधला के ठहराव भी व्यक्तिपरक किया जा सकता है, विश्लेषण और डेटा व्याख्या5में परिवर्तनशीलता के कारण ।

इसलिए, formalin पर पारंपरिक आइएचसी-फिक्स्ड, आयल-एंबेडेड (FFPE) नमूने लिंफोमा जैसे immunologically विविध रोगों में कई लक्ष्यों का एक साथ पता लगाने के लिए संभव नहीं है । इसके अलावा, आसपास के प्रतिरक्षा कोशिकाओं से नवोत्पादित लिम्फोसाइटों भेद अक्सर गलत है । यह लिंफोमा में उपंयास की प्रासंगिकता को देख अध्ययन में बाधा है । इस संदर्भ में, मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट आइएचसी (mf-आइएचसी) एक होनहार विकल्प प्रदान करता है के रूप में यह प्रतिजन coexpression के मात्रात्मक मूल्यांकन और उच्च परिशुद्धता के साथ एक स्थानिक संबंध जबकि संरक्षण सीमित नमूने6,7 की अनुमति देता है । जब इस इमेजिंग तकनीक को डिजिटल इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर के साथ साझेदारी की जाती है तो डाटा की व्याख्या को और अधिक कुशल बनाया जाता है और ट्यूमर और microenvironment विविधता8,9के अध्ययन की सुविधा मिलती है । इस प्रोटोकॉल में, एक tyramide आधारित इम्यूनोफ्लोरेसेंस (IF) मल्टीप्लेक्सिंग विधि संकेत बढ़ाना करने के लिए लागू किया जाता है और किसी भी मेजबान प्रजातियों में से किसी भी आइएचसी-मान्य एंटीबॉडी के साथ संगत है, यहां तक कि एक ही प्रजाति में विकसित उन5,7 , 10. tyramide आधारित प्रोटोकॉल ब्याज के ऊतकों को fluorophore के प्रत्यक्ष विकार के लिए अनुमति देता है ताकि प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी प्रत्येक चरण के बाद छीन लिया जा सकता है, एकाधिक दाग के अनुक्रमिक आवेदन के लिए अनुमति बिना एंटीबॉडी क्रॉस-रिजेट ।

एक मल्टीप्लेक्स रणनीति लक्ष्य की पहचान और लिंफोमा में उनके संस्करण immunologic पैटर्न द्वारा पूर्वानुमान और उपचार के परिणामों की भविष्यवाणी के लिए उपयोगी हो जाएगा । मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट आइएचसी टी के एक पैनल के अध्ययन के लिए हमारी प्रयोगशाला में लागू किया गया है और बी लिम्फोसाइट मार्करों और टी-angioimmunoblastic टी सेल लिंफोमा (AITL) में तोंसिल्लितिस सहायक मार्कर, एक उपप्रकार के एक परिधीय टी सेल लिंफोमा आक्रामक नैदानिक द्वारा विशेषता व्यवहार और ट्यूमर विविधता11. इस पद्धति की उपयोगिता भी फैलाना बड़े बी सेल लिंफोमा (DLBCL) में सचित्र है, जहां एक साथ बी-सेल रिसेप्टर के बढ़ संकेतन एक साथ सी-MYC और BCL-2 अभिव्यक्ति है Bruton tyrosine कळेनासे निषेध के संभावित चिकित्सीय उपयोग का सुझाव 12 .

यहाँ हम एंटीबॉडी सत्यापन से पूरे प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए उपयुक्त नियंत्रण ऊतकों और division का उपयोग लिंफोमा FFPE ऊतकों, सना हुआ स्लाइड का एक अंतिम विश्लेषण के साथ एक स्कैनिंग स्वचालित मात्रात्मक पैथोलॉजी इमेजिंग का उपयोग सिस्टम.

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सभी ऊतकों सिंगापुर NHG डोमेन विशिष्ट समीक्षा बोर्ड बी अध्ययन 2014/00693 के तहत प्राप्त किए गए थे ।

1. चयन और एंटीबॉडी का सत्यापन

नोट: किसी भी मल्टीप्लेक्स पैनल की स्थापना के साथ आगे बढ़ने से पहले यह सुनिश्चित करें कि सभी एंटीबॉडी मजबूती से दाग, केवल ब्याज की लक्ष्य प्रतिजन की पहचान । उद्देश्य एंटीबॉडी कि विशेष रूप से ऊतक वर्गों में ब्याज की प्रतिजन पहचान का चयन करने के लिए है ।

  1. एक अच्छी तरह से स्थापित अनुसंधान का उपयोग करें, या आइएचसी में नियमित नैदानिक उपयोग के साथ एक एंटीबॉडी के लिए, पारंपरिक आइएचसी प्रदर्शन द्वारा epitope पुनः प्राप्ति और एंटीबॉडी कमजोर पड़ने जैसी स्थितियों की पुष्टि5,सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण ऊतक पर13 अनुभागों. मानव मूल के ऊतक वर्गों के लिए, यह सुनिश्चित करें कि उचित नैतिकता मंजूरी प्रयोगों की शुरुआत करने से पहले जगह में हैं ।
    नोट: सकारात्मक नियंत्रण के लिए ब्याज की प्रतिजन व्यक्त करने की उंमीद कर रहे है कि ऊतकों हैं, और नकारात्मक नियंत्रण उन है कि नहीं कर रहे हैं । सौम्य tonsil ऊतक लिंफोमा एंटीजन के लिए एक अच्छा ऊतक नियंत्रण के रूप में चुना जाता है क्योंकि यह बी कोशिकाओं सहित प्रतिरक्षा कोशिकाओं का एक मिश्रण होता है, टी कोशिकाओं, और प्रतिजन-कोशिकाओं को पेश, साथ ही stromal और उपकला कोशिकाओं. बाद उपयोगी नकारात्मक आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं ।
  2. अज्ञात लक्ष्यों के लिए या अपर्याप्त प्रकाशित डेटा के साथ वाणिज्यिक एंटीबॉडी के लिए, मिलान सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण FFPE सेल ब्लॉक14, का उपयोग करके एंटीबॉडी सत्यापन प्रदर्शन CRISPR नॉक आउट या सिरना ब्याज की प्रतिजन के नीचे दस्तक मानक आणविक जीवविज्ञान तकनीक के माध्यम से एक उपयुक्त सेल लाइन में । १.१ चरण के अनुसार पारंपरिक आइएचसी के लिए सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण ऊतकों के एवज में इन FFPE सेल ब्लॉकों का उपयोग करें ।
    नोट: हेला या 293T कक्ष सामांयतः के लिए उपयोग किया जाता है जो कक्ष-प्रकार नहीं है एंटीजन, के रूप में लिंफोमा सेल लाइनों transfect करने के लिए मुश्किल है । एंटीजन कि लिम्फोसाइट विशिष्ट हैं के लिए, लिंफोमा सेल लाइनों (हालांकि कम प्रभावकारिता के साथ) जीन वितरण के मोड के रूप में वायरल transduction या electroporation के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है ।

2. मल्टीप्लेक्स पैनल के लिए एंटीबॉडी और Fluorophores के अनुक्रम की योजना बनाना

  1. अंतिम मल्टीप्लेक्स धुंधलाने के लिए रिएजेंट्स के अनुक्रम की योजना बनाएं । उदाहरण के लिए, यहां मल्टीप्लेक्स प्रोटोकॉल के लिए अनुक्रम शुरू में पहली, Bcl-6 के रूप में की योजना बनाई थी; दूसरा, Bcl-2; तीसरा, ग-Myc; चौथा, CD20; पांचवां, Ki67 ।
    नोट: अनुक्रम पर फैसला करने के लिए, एक कमजोर उच्च सांद्रता की आवश्यकता समानता के साथ एंटीबॉडी अंतिम मल्टीप्लेक्स धुंधला में पहले दाग होना चाहिए । उच्च संबंध एंटीबॉडी कि माइक्रोवेव अलग करना के कई दौर के लिए प्रतिरोधी होने की संभावना है मल्टीप्लेक्स प्रोटोकॉल में पिछले लागू कर रहे है गैर विशिष्ट धुंधला से बचने के लिए ।
  2. पैनल में प्रत् येक एंटीबॉडी के लिए fluorophore पार्टनर की योजना बनाएं । इस उदाहरण में विकल्पों के लिए तालिका 1 और सामग्री तालिका देखें ।
    नोट: प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए fluorophore भागीदार पर फैसला करने के लिए, कोशिका के भीतर और ऊतक के भीतर स्थानीयकरण के समान पैटर्न के साथ एंटीबॉडी के लिए वर्णक्रमीय अलग fluorophores का चयन करें । यह वर्णक्रमीय ओवरलैप को कम करने और मिश्रण के साथ कठिनाई होगी ।

3. Monoplex Tyramide-आधारित अगर एक नकली 5-plex मल्टीप्लेक्स पैनल में

नोट: इस उदाहरण में, CD20 के लिए प्रोटोकॉल पर चर्चा की है, जो ऊपर वर्णित एक मल्टीप्लेक्स अनुक्रम में चौथे एंटीबॉडी के रूप में नियोजित है । अतिरिक्त अलग करना कदम की संख्या अनुक्रम में एंटीबॉडी की स्थिति के लिए अलग होगा ।

  1. एक microtome का उपयोग कर सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण ऊतक के 3 µm-पतले वर्गों में कटौती और पाली-एल-lysine-लेपित माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड पर वर्गों जगह है ।
  2. Dewax 4 मिनट प्रत्येक के लिए एक उचित समाशोधन समाधान 3x का उपयोग कर वर्गों । १००% अल्कोहल, ९०% अल्कोहल, और ७०% अल्कोहल, 4 मिनट प्रत्येक में स्लाइड हाइड्रेट । 2-3 मिनट के लिए आसुत जल में स्लाइड रखो ।
  3. स्लाइडों को विसर्जित करने के लिए एक मानक antigen पुनर्प्राप्ति बफ़र (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध) में एक माइक्रोवेव-सुरक्षित ग्लास जार में स्लाइड रखें । गर्मी प्रेरित epitope पुनर्प्राप्ति (HIER) एक उपयुक्त माइक्रोवेव का उपयोग कर, pH9 प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान में ९८ डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए प्रदर्शन ।
    नोट: ८००-१,१०० वाट से लेकर एक दबाव के साथ किसी भी माइक्रोवेव इस्तेमाल किया जा सकता है, और HIER तदनुसार अनुकूलित किया जा सकता है । इस मामले में, एक बहुआयामी माइक्रोवेव ऊतक प्रोसेसर (हवा के लिए खुला) HIER और अलग करना के लिए इस्तेमाल किया गया था । एक विशेष epitope की पुनर्प्राप्ति के लिए प्रारंभिक सेटिंग्स पारंपरिक आइएचसी से पूर्व ज्ञान पर आधारित हैं ।
  4. माइक्रोवेव अलग करना के अतिरिक्त दौर प्रदर्शन (इस मामले में तीन, एक पैनल में चौथे एंटीबॉडी के लिए), १००% बिजली के साथ प्रत्येक दौर में ९८ डिग्री सेल्सियस और 10 मिनट के लिए 20% बिजली के लिए एक ही तापमान पर बनाए रखने के लिए । नीचे की स्लाइडों को ठंडा करने के लिए आसुत जल में कम 10 मिनट ।
    नोट: लक्ष्य प्रतिजन का एक ही नंबर के रूप में प्रस्तावित मल्टीप्लेक्स में हीटिंग चरणों को बेनकाब करने के लिए कदम अगर monoplex के दौरान अलग करना माइक्रोवेव के कई दौर प्रदर्शन । चूंकि CD20 चौथे एंटीबॉडी के रूप में की योजना बनाई है, माइक्रोवेव अलग करना 3x पहले और एक बार प्राथमिक एंटीबॉडी मशीन करने के बाद ।
  5. जांच करें और अतिरिक्त माइक्रोवेव अलग करना के दौरान हर 5 मिनट के बाद बफर भरपाई । महत्वपूर्ण बात, कई स्ट्रिपिंग प्रक्रियाओं के दौरान बाहर की स्लाइड्स को सूखने न दें. जब माइक्रोवेव से बाहर स्लाइड ले, संदंश और heatproof दस्ताने का उपयोग करने के लिए उंहें आसुत जल के एक अलग जार में जगह है । antigen पुनर्प्राप्ति समाधान के लिए स्वाभाविक रूप से शांत करने के लिए प्रतीक्षा करें ।
  6. 10 मिनट के लिए एक वाणिज्यिक peroxidase ब्लॉक का उपयोग करके ऊतक peroxidase गतिविधि ब्लॉक (3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड एक वैकल्पिक एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है) । Tris के साथ धो-बफर खारा (टीबीएस) और 5 मिनट के लिए एक गैर ईओण डिटर्जेंट ।
    नोट: टीबीएस ५० mm Tris-सीएल, पीएच ७.५, और १५० mm NaCl. टीबीएस के टीबीएस-डी बनाने के लिए बना है ।
  7. 15 मिनट के लिए एंटीबॉडी मंदक या गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन के साथ ब्लॉक ब्याज की प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन द्वारा पीछा किया (जैसे, CD20, 1: एंटीबॉडी मंदक में 2000 कमजोर पड़ने, सामग्री की तालिकादेखें) के लिए कमरे के तापमान पर 30 min. धो के साथ 3x टीबीएस-डी 5 मिनट के लिए हर बार बफर । सभी वाशिंग स्टेप्स में स्लाइड को पूरी तरह विसर्जित करने के लिए पर्याप्त टीबीएस-डी बफर होना चाहिए ।
    नोट: गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन एक वैकल्पिक एंटीबॉडी मंदक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । एंटीबॉडी मंदक की मात्रा ऊतक के आकार पर निर्भर करता है, ५० µ एल (बायोप्सी नमूनों के लिए) से लेकर ४०० µ एल तक (उत्पाद के नमूने या ऊतक microarray नमूनों के लिए) ।
  8. एक उपयुक्त सहिजन peroxidase (एचआरपी) के साथ मशीन-लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी, कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के मूल की प्रजातियों के आधार पर चुना । 5 मिनट के लिए हर बार टीबीएस-डी बफर के साथ 3x धो लो ।
  9. लागू करें एक उपयुक्त tyramide-आधारित फ्लोरोसेंट रिएजेंट (1:100 प्रवर्धन मंदक में) और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी, प्राथमिक एंटीबॉडी बंधन की साइटों पर ऊतक के नमूने को fluorophore विकार की अनुमति है । 5 मिनट के लिए हर बार टीबीएस-डी बफर के साथ 3x धो लो ।
  10. प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी को निकालने के लिए एक अतिरिक्त माइक्रोवेव-आधारित ट्रिपिंग निष्पादित करें । अनुक्रम में एंटीबॉडी की स्थिति के आधार पर आवश्यकतानुसार दोहराएं ।
  11. आसुत जल में स्लाइड जगह ठंडा करने के लिए । 10 मिनट के लिए DAPI (एंटीबॉडी मंदक में 1:100 कमजोर पड़ने) के साथ मशीन, 5 मिनट के लिए हर बार टीबीएस-डी बफर के साथ 3x धोने के बाद । स्लाइड पर पोंछे के साथ ऊतक के बिना क्षेत्र शुष्क और उपयुक्त बढ़ते मीडिया के साथ स्लाइड माउंट ।
  12. छवि स्लाइड (6 वर्गों और इस प्रोटोकॉल के 7 देखें) और धुंधला (के रूप में सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण ऊतक के स्पष्ट भेदभाव द्वारा परिभाषित) के औचित्य का निर्धारण ।
    नोट: यदि धुंधला पैटर्न गलत है, एक या अधिक निंनलिखित मापदंडों का समायोजन करने के बाद monoplex धुंधलाना फिर से करना: गर्मी पुनः प्राप्ति चरणों की संख्या, गर्मी पुनः प्राप्ति की मात्रा, (प्राथमिक और एंटीबॉडी की मशीन अवधि/ माध्यमिक), अनुक्रम में एंटीबॉडी की स्थिति, और fluorophore के विकल्प । monoplex धुंधला कदम आम तौर पर उपयुक्त धुंधला के लिए मापदंडों का एक उपयुक्त सेट प्राप्त करने के लिए अनुकूलन के कई दौर की आवश्यकता है । प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ fluorophores की श्रेणी का परीक्षण करने की सलाह दी जाती है, क्योंकि यह अंतिम मल्टीप्लेक्स सेट तय करने में लचीलापन प्रदान करेगा ।

4. मल्टीप्लेक्स प्रोटोकॉल में प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए Monoplex की पुनरावृत्ति

  1. इस क्रम में एंटीबॉडी की स्थिति के आधार पर माइक्रोवेव अलग करना कदम है, की संख्या का समायोजन करके एक समान तरीके से अंय एंटीबॉडी के लिए धुंधला monoplex दोहराएं । उदाहरण के लिए, जब एक छह में तीसरे एंटीबॉडी के लिए monoplex धुंधला-plex मल्टीप्लेक्स पैनल प्रदर्शन, दो माइक्रोवेव अलग करना कदम से पहले और तीन प्राथमिक एंटीबॉडी की मशीन के बाद माइक्रोवेव अलग करना कदम ।
    नोट: यह सराहना करते है कि माइक्रोवेव आधारित एंटीबॉडी के अलग करना भी HIER के लिए नमूने को उजागर महत्वपूर्ण है । यदि किसी विशिष्ट एंटीबॉडी को भिन्न epitope पुनर्प्राप्ति कार्यनीति की आवश्यकता होती है, तो मल्टीप्लेक्स अनुक्रम की योजना बनाते समय इसे ध्यान में रखा जाना चाहिए. इस उदाहरण में, Ki67 epitope पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता है पीएच 9, के लिए 30 मिनट । के बाद से HIER के 25 मिनट अनुक्रमिक प्रोटोकॉल में धुंधला KI67 करने से पहले किया जाएगा, केवल एक अतिरिक्त HIER के 5 मिनट की जरूरत है ।

5. मल्टीप्लेक्स धुंधला प्रोटोकॉल

नोट: सभी घटकों monoplex का उपयोग कर अनुकूलित किया गया है के बाद ही मल्टीप्लेक्स दाग प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ना अगर धुंधला । monoplex धुंधला और मल्टीप्लेक्स के आदेश के अंतिम लेआउट और प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए fluorophore की पसंद दिखा तालिका डिजाइन के परिणामों की समीक्षा करें । एंटीबॉडी एकाग्रता, धुंधला की अवधि के विवरण, और अनुक्रम और प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए गर्मी पुनः प्राप्ति की प्रकृति यहां इस्तेमाल किया तालिका 1में प्रदान की जाती है ।

  1. कट 3 µm-सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण ऊतक के पतले वर्गों, साथ ही ब्याज की लक्ष्य ऊतक (यहां, लिंफोमा के FFPE नमूने), एक microtome का उपयोग कर, और पाली-L-lysine-लेपित माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड पर वर्गों जगह ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    नोट: पैनल में प्रत् येक एंटीबॉडी के लिए सकारात् मक और नकारात् मक नियंत्रणों का समावेश करना उचित है, साथ में मल्टीप्लेक्स के लिए वास् तविक नमूने भी हैं । यह एक पुष्टिकरण कि दाग प्रोटोकॉल सही ढंग से किया गया था के लिए अनुमति देता है ।
  2. Dewax, गर्मी प्रेरित epitope पुनर्प्राप्ति (HIER), और ब्लॉक ऊतक peroxidase गतिविधि के रूप में monoplex प्रोटोकॉल चरणों में ३.३-३.५ ।
  3. अनुकूलित मल्टीप्लेक्स अनुक्रम के पहले प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन, के रूप में पहले monoplex का उपयोग कर अगर कदम निर्धारित किया है । इस उदाहरण में, BCL-6, एक 1:30 कमजोर पड़ने पर एंटीबॉडी मंदक में कमरे के तापमान पर ६० मिनट के लिए ( सामग्री की तालिकादेखें), मल्टीप्लेक्स प्रोटोकॉल का पहला कदम था । 5 मिनट के लिए टीबीएस-डी बफर के साथ धो लें ।
  4. एक उचित एचआरपी-लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी प्राथमिक एंटीबॉडी की प्रजातियों के आधार पर पूर्व चरण में इस्तेमाल किया ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 5 मिनट के लिए टीबीएस-डी बफर के साथ धो के साथ मशीन ।
  5. लागू करें अनुकूलित tyramide आधारित फ्लोरोसेंट एजेंट (इस उदाहरण में Cy5, 1:100 प्रवर्धन मंदक में, सामग्री की तालिकादेखें) 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन के साथ । मशीन के बाद, 5 मिनट के लिए टीबीएस-डी बफर के साथ धो लो ।
    नोट: tyramide के विकल्प आधारित फ्लोरोसेंट एजेंट अनुकूलित monoplex पर आधारित है अगर ।
  6. एक उपयुक्त माइक्रोस्कोप का उपयोग कर पहले एंटीबॉडी के दाग की दक्षता की जाँच करें ( सामग्री की तालिकादेखें).
    नोट: यदि नमूना एक TMA या एकल स्लाइड है तो अंतरिम इमेजिंग जांच आसानी से किया जा सकता है । हालांकि, दाग एकाधिक स्लाइड पर किया जा रहा है, यह अव्यावहारिक हो सकता है, और यह चरण छोड़ा जा सकता है ।
  7. monoplex कदम में अनुकूलित शर्तों का उपयोग करते हुए प्रोटोकॉल में दूसरी एंटीबॉडी के लिए माइक्रोवेव ट्रिपिंग करते हैं । फिर, दूसरी प्राथमिक एंटीबॉडी के दाग के साथ आगे बढ़ना (यहां, BCL2) एचआरपी-लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी और tyramide के साथ-फ्लोरोसेंट reagent (यहां, ५२०, सामग्री की तालिकादेखें) आधारित है । धुंधला के दूसरे दौर के पूरा होने के बाद एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत धुंधला की दक्षता की जांच करें ।
  8. इसी प्रकार, अनुक्रम (यहां, c-Myc, CD20, और ki67, क्रमशः fluorophores ५७०, ५४०, और ६२० के साथ क्रमशः) में तीसरे, चौथे, और पांचवें एंटीबॉडी का उपयोग कर प्रक्रिया को दोहराएँ । यदि संभव हो तो प्रत्येक चरण के बीच इमेजिंग जाँच निष्पादित करें ।
  9. एक परमाणु counterstain जोड़ें (DAPI, एंटीबॉडी मंदक में 1:100 कमजोर पड़ने 10 मिनट के लिए) और, तो, टीबीएस में 2x-5 मिनट के लिए प्रत्येक डी धो लो ।
  10. एक उपयुक्त बढ़ते रिएजेंट का उपयोग कर स्लाइड माउंट ।

6. वर्णक्रमीय पुस्तकालय स्लाइड की तैयारी

नोट: इस प्रोटोकॉल की धारा 6-8 एक वर्णक्रमीय कैमरा का उपयोग कर imaged कर रहे हैं कि मल्टीप्लेक्स प्रयोगों के लिए अद्वितीय हैं.

  1. multispectral छवि विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही नियंत्रण ऊतक पर प्रत्येक fluorophore, DAPI और autofluorescence के लिए लाइब्रेरी स्लाइड (एकल-दाग संदर्भ छवियाँ) बनाएँ.
    1. कट 2 x 3 µm-ब्याज की ऊतक प्रकार के पतले वर्गों (यहां, एक लिंफोमा नमूना या नियंत्रण के रूप में एक tonsil) एक microtome का उपयोग कर और पाली-L-lysine-लेपित माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड पर वर्गों जगह है ।
    2. दोनों स्लाइड monoplex प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्रक्रिया (सभी अलग करना और धुलाई कदम के साथ), लेकिन बिना एंटीबॉडी या fluorophore अलावा ।
    3. दाग एक स्लाइड DAPI के साथ ५.९ कदम के अनुसार और एक (ऊतक autofluorescence स्पेक्ट्रम की पीढ़ी के लिए) unstain हुआ स्लाइड छोड़ दें ।
      नोट: अनुकूलित monoplex स्लाइड (एक एकल प्रतिदीप्ति डाई के साथ, DAPI के बिना) एक प्रतिदीप्ति डाई के स्पेक्ट्रा उत्पन्न करने के लिए वर्णक्रमीय पुस्तकालय स्लाइड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. उपयुक्त फ़िल्टर्स का उपयोग करके स्लाइड्स के इन सेट को स्कैन करें और उन्हें छवि विश्लेषण लाइब्रेरी में अपलोड करें.

7. वर्णक्रमीय इमेजिंग

  1. स्कैनिंग monoplex स्लाइड
    1. उपलब्ध मानक महामारी-प्रतिदीप्ति फिल्टर (DAPI, FITC, CY3, टेक्सास लाल, और CY5) से फिल्टर का चयन कार्यरत fluorophore के लिए उपयुक्त है ।
      नोट: इस उदाहरण में प्रयुक्त विशिष्ट fluorophores के लिए अनुशंसित फ़िल्टर क्यूब्स तालिका 215में दिखाए जाते हैं ।
    2. एक उपयुक्त जोखिम समय एक साफ संकेत प्राप्त करने के लिए पहचान करने के लिए अपनी इसी प्रतिदीप्ति चैनल में प्रत्येक मार्कर की जांच करें । ऊतक घटक है कि मार्कर के लिए सबसे मजबूत संकेत है माना जाता है पर ध्यान केंद्रित ।
    3. प्रत्येक analyte (एंटीबॉडी-fluorophore संयोजन) के लिए एक निश्चित एक्सपोज़र समय निर्धारित करें, पिक्सेल तीव्रता के क्रॉस-नमूना तुलना की अनुमति देने के लिए (हालांकि कुछ व्यावसायिक प्लेटफ़ॉर्म के पास एक्सपोज़र में अंतर के लिए सामांय कार्यनीतियां हैं) ।
      1. किसी दिए गए चैनल के लिए एक निश्चित जोखिम समय पर तय करने के लिए, एक लाइव कैमरा सेटिंग का उपयोग करने के लिए जोखिम समय समायोजित जब तक वहां रहते कैमरा छवि में कोई उजागर क्षेत्रों रहे हैं, और सभी चैनलों के लिए इस दोहराने ।
    4. monoplex स्लाइड स्कैनिंग के बाद, नकली brightfield छवियों उत्पन्न (समारोह सॉफ्टवेयर में उपलब्ध है, तो) नेत्रहीन सामान्य आइएचसी पैटर्न के साथ तुलना करने के लिए और अगर धुंधला पैटर्न सही है निर्धारित करने के लिए (चित्रा 1 और चित्रा 2 ).
  2. स्कैनिंग मल्टीप्लेक्स नमूने (TMA स्लाइड/
    1. monoplex छवियों (चरण ६.१) स्कैनिंग के लिए वर्णित के रूप में ऑप्टिकल पैरामीटर सेट करें । सबसे पहले, ध्यान मैंयुअल रूप से समायोजित या स्वचालित रूप से (विशिष्ट छवि स्कैनिंग मशीन के निर्देशों का पालन करें) । दूसरे, प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल के लिए जोखिम समय समायोजित करने के लिए सुनिश्चित करें कि एक TMA पर सभी कोर, या एक स्लाइड पर सभी क्षेत्रों, उचित रूप से सामने आ रहे हैं ।
      नोट: क्षेत्र के लिए जोखिम समय समायोजित चुना महत्वपूर्ण है । उपयोगकर्ताओं को प्रत्येक फिल्टर के लिए सबसे मजबूत संकेत क्षेत्र का चयन करने की जरूरत है (यानी, Ki67 संकेत nongerminal केंद्र क्षेत्र की तुलना में tonsil कीटाणु केंद्र क्षेत्र में मजबूत है; इसलिए, उपयोगकर्ताओं को एक उपयुक्त एक्सपोज़र पर सेट कीटाणु केंद्र क्षेत्र का उपयोग करना चाहिए समय) । उपयोगकर्ताओं को भी इमेजिंग प्रणाली के एक संतृप्ति सुधार समारोह यदि उपलब्ध अपनाने कर सकते हैं ।
    2. यदि इमेजिंग सिस्टम में, एक उपयुक्त TMA एल्गोरिथ्म के साथ उपलब्ध है, तो एक TMA स्कैनिंग मोड के अंतर्गत स्लाइड स्कैन करें ।
    3. पूरे ऊतक अनुभाग स्लाइड के लिए, सबसे प्रतिनिधि ट्यूमर क्षेत्रों से इष्टतम छवियों का चयन करने के लिए एक योग्य पैथोलॉजिस्ट द्वारा समीक्षा की स्लाइड प्राप्त करें ।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक परिभाषित माइक्रोस्कोप पर आधारित है/छवि विश्लेषण प्रणाली ( सामग्री की तालिकादेखें) । वहां अंय मशीनों और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर है कि स्कैन और विश्लेषण कर सकते है मल्टीप्लेक्स आइएचसी स्लाइड7।

8. डेटा विश्लेषण

  1. विश्लेषण मूल्यांकन और योजना
    1. विश्लेषण के लिए स्कैन की गई छवियों से autofluorescence को घटाना autofluorescence के लिए संदर्भ स्लाइड का उपयोग करें ।
    2. विश्लेषण से पहले छवियों की समीक्षा करने के लिए सुनिश्चित करें कि वे कर रहे है ध्यान और दाग कलाकृतियों के बिना ।
    3. रुचि के कक्षों की पहचान करने और कक्ष विभाजन, स्कोरिंग, और बैच विश्लेषण दृष्टिकोणों के साथ आगे बढ़ने के लिए ट्यूमर मार्कर (उदा., CD20) का उपयोग करें । विश्लेषण के लिए CD20-धनात्मक कक्षों का चयन करें.
      नोट: उदाहरण के लिए, DLBCL नमूनों में यहाँ विश्लेषण, सेटिंग और पैरामीटर सेल विभाजन के लिए परिभाषित कर रहे हैं कि परमाणु आकार और तीव्रता पर आधारित हैं, लेकिन इस्तेमाल किया छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए विशिष्ट हैं (जैसे, एक DAPI का मतलब पिक्सेल तीव्रता पर सबसे कम ०.०५; के बीच में आकार ८०-३२० पिक्सल, 2 में एक बंटवारे संवेदनशीलता के साथ [यह एक सॉफ्टवेयर विशेष पैरामीटर जो ट्यूमर की आकृति विज्ञान पर काफी निर्भर करता है: छोटे ट्यूमर कोशिकाओं के लिए, ०.७-1 के बंटवारे उपयुक्त है; बड़े ट्यूमर कोशिकाओं के लिए, बंटवारे को समायोजित किया जा सकता है करने के लिए 4]) ।
    4. व्यक्तिगत छवियों की समीक्षा करने के लिए योग्य पैथोलॉजिस्ट के लिए अनुरोध और ऊतक फॉल्ट ट्यूमर सेल समृद्ध क्षेत्रों का चयन करें और परिगलन arearegion orand प्रचुर मात्रा में प्रतिक्रियाशील कोशिकाओं के साथ क्षेत्रों को बाहर करने के लिए आवश्यक है कि क्या फैसला । यदि अतिरिक्त ऊतक विभाजन की आवश्यकता है, तो उपयुक्त नियंत्रण क्षेत्रों (जैसे कि ट्यूमर कोशिकाओं/स्ट्रोमा/परिगलन) का चयन करें और जांच करें कि छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर ठीक से ऐसे क्षेत्रों की पहचान कर सकते है
    5. ऊतक विभाजन (यदि कोई हो) के बाद सेल विभाजन के साथ आगे बढ़ना, एक योग्य पैथोलॉजिस्ट का अनुरोध करने के लिए इरादा विभाजन दृष्टिकोण5की निष्ठा सुनिश्चित करने के लिए सेल विभाजन के नक्शे की समीक्षा करें ।
    6. ब्याज के किसी दिए गए जैव मार्कर (उदा., प्रतिशत धनात्मकता, या प्रति सेल मतलब तीव्रता) के विश्लेषण के लिए सबसे अधिक जैविक रूप से नैदानिक रूप से उपयुक्त विधि का निर्धारण करना ।
    7. प्रत्येक मार्कर (प्रतिशत धनात्मकता के लिए) के लिए एक कट-ऑफ मान का चयन करें ।
    8. एक पैथोलॉजिस्ट के साथ संयोजन के रूप में प्रत्येक मार्कर के लिए ऑप्टिकल तीव्रता सकारात्मक कट ऑफ मूल्य का निर्धारण । उचित सांख्यिकी सॉफ्टवेयर में मार्कर तीव्रता/सेल की आवृत्ति वितरण का विश्लेषण करके हिस्टोग्राम उत्पन्न ( सामग्री की तालिकादेखें).
      नोट: तीव्रता मान हिस्टोग्राम संकेत गहनता के वितरण का ओवरव्यू प्रस्तुत कर सकता है ।
    9. हिस्टोग्राम से अनुमानित कट-ऑफ निर्धारित करें और चयनित छवियों पर मैन्युअल रूप से निर्धारित कटौती-नापसंद के साथ सहसंबंधी करने के लिए, एक पैथोलॉजिस्ट समीक्षा के साथ इस की पुष्टि । कुछ स्थितियों में, एक समान कटौती बंद धुंधला में परिवर्तनशीलता के कारण संभव नहीं होगा, और प्रत्येक नमूने के लिए एक मैनुअल कट-ऑफ मान की आवश्यकता होगी ।
      नोट: धारा ८.१ छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में किया जाना चाहिए ( सामग्री की तालिकादेखें) जब तक अंयथा निर्दिष्ट ।
  2. धनात्मक और ऋणात्मक कक्षों को चिह्नित करना
    1. ब्याज के प्रत्येक मार्कर के लिए, निर्धारित कट-ऑफ संख्या के अनुसार (हिस्टोग्राम या मैन्युअल के माध्यम से), चिह्नित मूल्य के साथ सकारात्मक और नकारात्मक कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए एक "IF" या समान तर्क सूत्र का उपयोग करें: धनात्मक कक्षों के लिए संख्या 1, ऋणात्मक कक्षों के लिए संख्या 0.
    2. सभी मार्करों की सकारात्मकता के लिए, प्रत्येक मार्कर के चिह्नित मूल्य गुणा (या तो 1 या 0) अलग कॉलम में उत्पादों के साथ । यदि उत्पाद 1 के बराबर होता है, तो इसका अर्थ है कि कक्ष सभी मार्करों के लिए धनात्मक है. सकारात्मकता और एक विशिष्ट मार्कर की नकारात्मकता के लिए, एक IF तर्क एल्गोरिथ्म का उपयोग करें ।
      नोट: धारा ८.२ के आंकड़े सॉफ्टवेयर में किया जाना चाहिए ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  3. पिवट तालिका का उपयोग करके प्रतिशत डेटा और सांख्यिक डेटा जनरेट करना
    1. निर्धारित कक्षों (उदा., CD20-धनात्मक कक्ष, या CD20-ऋणात्मक कक्षों) (चित्र 6) के भीतर रुचि के विशिष्ट मार्कर के लिए प्रतिशत डेटा जेनरेट करें.
    2. डेटा पत्रक में पिवट तालिका संमिलित करें ।
    3. किसी एकल मार्कर, जैसे CD20 के धनात्मकता प्रतिशत की गणना करने के लिए, CD20-धनात्मक कक्षों की कुल संख्या की गणना करने के लिए पिवट तालिका के मान भाग के अंतर्गत sum फ़ंक्शन का चयन करके विभाजित CD20+ कक्षों के योग का उपयोग करके कुल कक्ष संख्या । परिणाम एक कोर या एक अध्ययन संख्या (पिवट तालिका पंक्ति के चयन पर निर्भर करता है) के भीतर CD20+ कक्ष प्रतिशत है ।
    4. एक ही विधि (चित्रा 3) का उपयोग कर कई मार्करों की धनात्मकता प्रतिशत की गणना।
    5. सांख्यिक डेटा जनरेट करें । एक नमूना (4 चित्रा) के भीतर का अध्ययन सभी कोशिकाओं में ब्याज की प्रत्येक मार्कर का मतलब तीव्रता प्राप्त करने के द्वारा प्रत्येक कोर या प्रत्येक अध्ययन संख्या के प्रत्येक मार्कर के लिए औसत सामान्यीकृत गिनती निकालें.
      नोट: माध्य मान सीधे पिवट तालिका में प्राप्त नहीं किया जा सकता है । यह इस सूत्र का उपयोग कर व्युत्पंन किया जा सकता है: माध्य (यदि (अध्ययन संख्या के कॉलम = विशिष्ट अध्ययन संख्या, सामान्यीकृत मूल्य के कॉलम)) ।
  4. एक उपयुक्त ग्राफ में डेटा की साजिश रचने
    1. भूखंड प्रतिशत धनात्मकता या आगे सांख्यिकीय परीक्षण और प्रस्तुति के लिए एक उचित तरीके से ब्याज की एक कोशिका प्रकार में प्रति मार्कर औसत तीव्रता के परिणाम ।
    2. संख्याओं और वितरण का दृश्य प्रदान करने के लिए डॉट प्लॉट बनाएं ।
      नोट: बार ग्राफ़ के साथ डेटा का प्रतिनिधित्व वितरण पर जानकारी नहीं देता है । आकलन भूखंडों भी16नमूनों के बीच अंतर की भयावहता पर जोर देने के साथ डेटा प्रतिनिधित्व के लिए एक अच्छी विधि के रूप में सिफारिश कर रहे हैं ।

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Representative Results

एमएफ-सी-MYC और BCL2 जीन पुनर्व्यवस्था (डबल-हिट लिंफोमा) के साथ एक DLBCL नमूना के लिए आइएचसी छवियों चित्रा 1में दिखाया गया है । चित्रा 2 नकली उज्ज्वल क्षेत्र immunohistochemical छवियों को दर्शाता है । आकृति 3 प्रतिशत डेटा की जनरेशन को इंगित करती है । चित्रा 4 संख्यात्मक डेटा की पीढ़ी के लिए एक औसत फार्मूले के विवरण प्रदर्शित करता है । चित्रा 5 angioimmunoblastic टी सेल लिंफोमा में एक टी सेल पैनल के mf-आइएचसी के आवेदन से पता चलता है । चित्रा 6 इस नमूने के लिए tonsil नियंत्रण नमूना और डेटा विश्लेषण के अनुकूलन छवि से पता चलता है ।

Figure 1
चित्र 1: b-सेल मल्टीप्लेक्स एक फैलाना बड़े बी सेल लिंफोमा (DLBCL) सी के साथ नमूना-MYC और CL2 जीन पुनर्व्यवस्था के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस पैनल छवियों (डबल-मारा लिंफोमा) । रानी = CD20 (झिल्ली); white = BCL2 (कोशिका द्रव्य); yellow = Ki67 (नाभिकीय); green = C-MYC (नाभिकीय); red = BCL6 (नाभिकीय), नीला = DAPI (नाभिकीय counterstain) । CD20-सकारात्मक ट्यूमर कोशिकाओं सी के लिए एक उच्च अभिव्यक्ति दिखाने के MYC (८०%) और BCL2 (> 90%), और Ki67 प्रसार सूचकांक भी उच्च (९०%) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: नकली उज्ज्वल क्षेत्र immunohistochemical छवियों ( चित्रा 1से उत्पंन) सी के साथ ही DLBCL नमूना-MYC और BCL2 जीन पुनर्व्यवस्था (डबल-मारा लिंफोमा) । CD20 ट्यूमर कोशिकाओं में झिल्ली धुंधला से पता चलता है । BCL2 ट्यूमर कोशिकाओं के > 90% में दाग कोशिका द्रव्य से पता चलता है । C-MYC धनात्मकता के बारे में ८०% है । BCL6 कोशिकाओं के लगभग 20% में परमाणु दाग से पता चलता है । Ki67 कोशिकाओं के ९०% में सकारात्मक है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: धुरी तालिका दिखा कैसे प्रतिशत डेटा के अनुसार अध्ययन संख्या उत्पंन करने के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: अध्ययन संख्या के अनुसार सामान्यीकृत Ki67 आयुध डिपो मूल्य के लिए माध्य फार्मूला. IF कथन एक विशिष्ट अध्ययन संख्या (जो इस चित्र में ५२ है) के बराबर है सभी अध्ययन संख्या पाता है । उसके बाद, यह संगत Ki67 सामान्यीकृत मान देता है । Ctrl + Shift + दर्ज करें कुंजी संयोजन इन लौटे मूल्यों, जो अध्ययन संख्या ५२ के लिए ११.५६ है के लिए औसत (Ki67 माध्य) की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: एक angioimmunoblastic T-सेल लिंफोमा (AITL) नमूना के लिए मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस पैनल छवियां । (क) समग्र छवि एक AITL नमूना के सेलुलर विविधता से पता चलता है. रानी = CD20 (झिल्ली); पीला = CD4 (झिल्ली); green = PD1 (झिल्ली); red = BCL6 (नाभिकीय); सियान = सीडी 8 (झिल्ली); blue = DAPI (नाभिकीय counterstain) । (ख) छवियों की ऊपरी पंक्ति एकपैनल में सफेद बॉक्स में चयनित क्षेत्र के एक बढ़ाया दृश्य से पता चलता है । छवियों की निचली पंक्ति के अनुरूप विभाजित सेल मास्क से पता चलता है: पीला/लाल/हरी दिखा रहा है एकल CD4/BCL6/PD1-सकारात्मक कोशिकाओं, क्रमशः । नीला ऋणात्मक कक्षों का प्रतिनिधित्व करता है, और श्वेत दोहरे-धनात्मक कक्षों को दर्शाता है । छवियां पता चलता है कि CD4 के ५० % + कोशिकाओं PD1+ है (बाएं, सफेद), जबकि CD4+ कोशिकाओं के 20% भी BCL6 (मध्य, सफेद) के लिए सकारात्मक हैं । PD1 और BCL6 के लिए दोहरी धनात्मकता दर के बारे में है 10% (सही, सफेद). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस अनुकूलन tonsil नियंत्रण ऊतक के लिए छवियां । (क) समग्र छवि एक tonsil नियंत्रण नमूने के कीटाणु केंद्र क्षेत्र से पता चलता है । पीला = C-Myc (नाभिकीय); red = BCL6 (नाभिकीय); सियान = BCL2 (कोशिका द्रव्य); रानी = CD20 (झिल्ली); green = Ki67 (नाभिकीय); blue = DAPI (नाभिकीय counterstain) । सी-Myc केवल कुछ ही कोशिकाओं में पॉजिटिव है । BCL6 और Ki67 मुख्य रूप से कीटाणु केंद्र के भीतर सकारात्मक हैं, जबकि BCL2 मुख्य रूप से कीटाणु केंद्र के बाहर सकारात्मक है । CD20 कीटाणु सेंटर के अंदर और बाहर diffusely पॉजिटिव है । (ख) सारणी से पता चलता है कि कीटाणु केंद्र CD20-धनात्मक कोशिकाएँ भी BCL6 और Ki67 के लिए सकारात्मक हैं लेकिन BCL2 के लिए ऋणात्मक हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

एंटीबॉडी धुंधला के अनुक्रम प्राथमिक एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका देखें) कुल HIER आवश्यक वास्तविक पूर्व दाग HIER माध्यमिक एंटीबॉडी Fluorophore पोस्ट-TSA एंटीबॉडी अलग करना
1 माउस विरोधी Bcl6 (1:30, 60min RT) 25minutes, Ph9 25minutes, Ph9 एचआरपी-संयुग्मित एंटी-माउस, 1:1000 ' के लिए 10 ' दूधिया Cy5 में 1:100 1 दौर 100% बिजली 1 मिनट, 10min के लिए 20% बिजली
2 माउस विरोधी Bcl2 (1:50, 60 मिनट आरटी) 25minutes, Ph9 कोई एचआरपी-संयुग्मित एंटी-माउस, 1:1000 ' के लिए 10 ' दूधिया रोशनी में ५२० 1:100 1 दौर 100% बिजली 1 मिनट, 10min के लिए 20% बिजली
3 खरगोश विरोधी सी-MYC (1:50, 30 मिनट आरटी) 25minutes, Ph9 कोई एचआरपी-संयुग्मित विरोधी खरगोश, 1:1000 ' 10 के लिए ' दूधिया रोशनी में ५७० 1:100 1 दौर 100% बिजली 1 मिनट, 10min के लिए 20% बिजली
4 माउस विरोधी CD20 (1:2000, 30 मिनट आरटी) 25minutes, Ph9 कोई एचआरपी-संयुग्मित एंटी-माउस, 1:1000 ' के लिए 10 ' दूधिया रोशनी में ५४० 1:100 1 दौर 100% बिजली 1 मिनट, 10min के लिए 20% बिजली
5 माउस विरोधी Ki-67 (1:50, 45 मिनट आरटी) 30minutes, Ph9 ५ मिनिटे pH9 एचआरपी-संयुग्मित एंटी-माउस, 1:1000 ' के लिए 10 ' दूधिया रोशनी में ६२० 1:100 1 दौर 100% बिजली 1 मिनट, 10min के लिए 20% बिजली

तालिका 1: यदि धुंधला हो तो मल्टीप्लेक्स के लिए अंतिम लेआउट का उदाहरण । इस तालिका कैसे HIER और माइक्रोवेव की मात्रा को निर्दिष्ट करने के लिए अलग करना हर कदम पर किया जा करने के लिए एक उदाहरण प्रदान करता है, एक बार monoplex दाग अनुकूलित किया गया है ।

Table 2
तालिका 2: fluorophores के लिए फ़िल्टर चयन की ओर मार्गदर्शिका । इस तालिका उपयुक्त फिल्टर है कि निर्दिष्ट उपकरणों पर इस्तेमाल किया जा सकता है की ओर किसी न किसी गाइड प्रदान करता है, के लिए ब्याज की fluorophores कल्पना । यह खुर्दबीन की फिल्टर विनिर्देशों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया fluorophores के उत्सर्जन/उत्तेजना प्रोफ़ाइल के संबंध में इस्तेमाल किया जा रहा है की सिफारिश की है ।

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Discussion

एमएफ-आइएचसी में लसीकावत् पैथोलॉजी में diagnosticcriteria को निखारने के लिए पैथोलॉजिस्ट को सक्षम करने और नैदानिक परिणाम की भविष्यवाणी की ओर विशिष्ट कोशिका प्रकारों में विमार्क्स की भूमिका का विश्लेषण करने की क्षमता है । एक नए अनुसंधान विधि के रूप में, mf-आइएचसी तेजी से कई ट्यूमर कोशिकाओं के प्रतिरक्षा मानकों की मात्रात्मक और स्थानिक पहचान के लिए लागू है17। ट्यूमर के सह-अभिव्यक्ति के लिए mf-आइएचसी का पता लगाने के लिए reproducible और विश्वसनीय5दिखाया गया है । हालांकि, प्रौद्योगिकी नवजात और ऊतक निर्धारण और प्रसंस्करण में विसंगति के कारण उन लोगों के रूप में, और/या ऊतक से संबंधित कारकों से उत्पन्न परिवर्तनशीलता के अधीन रहता है ।

तकनीक के लिए महत्वपूर्ण अच्छी तरह से मान्य एंटीबॉडी का उपयोग है कि विशिष्ट हैं, संवेदनशील, और reproducible परिणाम दे. वहां एंटीबॉडी के साहित्य में उदाहरण है मूल रूप से अपने प्रतिजनों के लिए विशिष्ट वर्णित है और बाद में नॉक आउट मॉडल14के उपयोग के माध्यम से असंबंधित प्रोटीन पहचान का प्रदर्शन किया । नॉक आउट/नॉक-डाउन मान्यता विधि जिसमें वाइल्ड-प्रकार या कक्षों के साथ व्यक्त किए गए एंटीजन धनात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करते समय लक्ष्य के साथ कक्ष बाहर खटखटाया या नीचे सिरना या CRISPR विधियों द्वारा खटखटाया नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है ।

पारंपरिक आइएचसी की तरह, mf-आइएचसी कई महत्वपूर्ण चर की जरूरत है कि हर प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जाना है, इष्टतम धुंधला और परिणाम के लिए । ये प्रतिजन पुनः प्राप्ति समाधान के पीएच शामिल हैं, एंटीबॉडी कमजोर पड़ने, प्रत्येक मार्कर के लिए एक fluorophore का काम है, और fluorophore की एकाग्रता । आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान पीएच 6 और 9 के हैं । यह जो पीएच इष्टतम धुंधला पैटर्न और कम पृष्ठभूमि के साथ तीव्रता देता है परीक्षण करने के लिए सार्थक है ।

मल्टीप्लेक्स प्रयोग में एंटीबॉडी आवेदन के अनुक्रम पर निर्णय लेने के लिए कोई विशिष्ट दिशानिर्देश नहीं हैं क्योंकि यह सिर्फ एंटीबॉडी के अपनत्व पर ही नहीं, बल्कि दूधिया fluorophores के बल पर भी निर्भर करता है. सामान्य में, एक कमजोर अपनत्व के साथ एंटीबॉडी अक्सर monoplex धुंधला पर आधारित उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है और मल्टीप्लेक्स अनुक्रम में पहले लागू कर रहे हैं. मजबूत संबंध एंटीबॉडी कि अलग करना करने के लिए प्रतिरोधी होने की संभावना है पिछले लागू कर रहे हैं, विशिष्ट धुंधला से बचने के लिए । एक विशिष्ट fluorophore के चयन के संबंध में, यह एक ही सेलुलर डिब्बों में colocalize जो एंटीजन के लिए समान वर्णक्रमीय तरंग दैर्ध्य के साथ fluorophores का उपयोग करने से बचने के लिए बेहतर है । एंटीजन कम अभिव्यक्ति स्तर के साथ प्रतिभाशाली fluorophores और इसके विपरीतके साथ असाइन किए जाते हैं । अगर, अध्ययन के नमूने में, संकेत तीव्रता कमजोर है, दूधिया TSA कमजोर पड़ने समायोजित करने के लिए वांछित संकेत18को प्राप्त किया जा सकता है । कुछ मामलों में, भिन्न antigen पुनर्प्राप्ति विधियों का प्रयास कर रहा है या प्राथमिक एंटीबॉडी एकाग्रता बढ़ाने काम कर सकते हैं । प्राथमिक एंटीबॉडी के प्रारंभिक कमजोर पड़ने के रूप में एक ही है कि एक पारंपरिक आइएचसी प्रयोग में स्थापित किया जा सकता है । हालांकि, अगर संकेत स्पष्ट नहीं है, अंय एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के परीक्षण की आवश्यकता होगी, के रूप में आइएचसी के लिए अनुकूलित शर्तों हमेशा अगर अनुवाद नहीं है । संकेत तीव्रता आदेश या immunostaining के अनुक्रम से प्रभावित है । कुछ epitopes MWT के दो या तीन दौर के बाद उजागर कर रहे हैं, जबकि कुछ अतिरिक्त MWT के कारण नीचा हो सकता है । कुछ fluorophores भी MWT द्वारा प्रभावित किया जा सकता है और क्षीणन के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए ।

इस प्रोटोकॉल colocalization और कोशिकाओं के एक घातक बी सेल लिंफोमा में सबसेट के भीतर मार्करों की तीव्रता की माप पर केंद्रित है । वर्तमान प्रोटोकॉल के विकास में महत्वपूर्ण चुनौतियों प्रतिजनों कि एक ही सेलुलर डिब्बों में colocalize के लिए एक अनुकूलित मल्टीप्लेक्स पैनल की पीढ़ी को शामिल । वहाँ सटीक ठहराव के लिए fluorophores के एक सटीक मिश्रण होने की जरूरत है । एक बार मल्टीप्लेक्स पैनल के स्थान पर, सना हुआ स्लाइडों का इमेजिंग अपेक्षाकृत सीधा है । अगली बाधा imaged डेटा का विश्लेषण शामिल है । प्रतिरक्षा घुसपैठ के अध्ययन में विपरीत, जहां एक उपकला ट्यूमर के भीतर विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार के quantitation सीधा है, लिंफोमा में colocalization अध्ययन के प्रत्येक मार्कर के लिए एक प्रशिक्षित पैथोलॉजिस्ट द्वारा धनात्मकता की परिभाषा पर भारी भरोसा ब्याज. एक उपयुक्त निदान कट-जो नियमित नैदानिक अभ्यास के लिए लागू किया जा सकता है पर प्राप्त करने के प्रगति में एक काम रहता है । इस तकनीक को नियमित निदान में एकीकृत किया जा सकता से पहले डेटा सामांयीकरण और स्वचालित कट-ऑफ triangulation के तरीकों में आगे शोधन की आवश्यकता होगी ।

वर्तमान सीमाओं के बावजूद, mf के संभावित अनुप्रयोगों-आइएचसी और ज्ञान है कि ट्यूमर कोशिकाओं और microenvironment के साथ उनके स्थानिक संबंध के अध्ययन से बटोरा जा सकता है यह एक आकर्षक उपकरण बनाने के लिए, विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण ऊतकवैज्ञानिक के लिए लसीकावत् द्रोह जैसे कैंसर । आगे के काम के लिए ऊतक निर्धारण और ऊतक प्रसंस्करण कि प्रस्तावित कार्यप्रवाह के लिए इष्टतम है में प्रोटोकॉल स्थापित करने की जरूरत है, साथ ही साथ धुंधला तकनीक में एक वृद्धि, लक्ष्यों की एक वृद्धि की संख्या के एक साथ विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं ।

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Disclosures

A.D.J. ने PerkinElmer से लेकर यूज़र-ग्रुप की बैठकों में यात्रा की ओर धन प्राप्त किया है । लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई दूसरा विरोध नहीं है.

Acknowledgments

एस.-भोलानाथ और A.D.J. का समर्थन कर रहे है सिंगापुर स्वास्थ्य मंत्रालय के राष्ट्रीय चिकित्सा अनुसंधान परिषद संक्रमण पुरस्कार (NMRC/टीए/0020/2013 और NMRC/टीए/0052/2016) । लेखक एक वेक्ट्रा वर्णक्रमीय इमेजिंग माइक्रोस्कोप की खरीद की ओर सिंगापुर के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय के कैंसर संस्थान से A.D.J. के लिए एक योंग Siew Yoon अनुसंधान अनुदान स्वीकार करते हैं । इस अध्ययन सिंगापुर NHG डोमेन विशिष्ट समीक्षा बोर्ड बी (2014/00693) द्वारा अनुमोदित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody diluent DAKO REF S3022 Blocking
Peroxidase Blocking Solution DAKO S2023 For peroxide blocking
Vectra multispectral automated microscope Perkin Elmer Vectra2.0.8 Spectral imaging
absolute Ethanol EMSURE 1.00983.2500 Ethyl alcohol for rehydration
Amplification Diluent PERKIN ELMER FP1135 Fluorophore diluent buffer
Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled PERKIN ELMER NEF822001EA Secondary antibody
Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled PERKIN ELMER NEF812001EA Secondary antibody
BCL2 DAKO clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) primary antibody
BCL6 LEICA NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) primary antibody
CD20 DAKO Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) primary antibody
c-MYC ABCAM Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) primary antibody
Cy 5 PERKIN ELMER FP1171 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Graphpad Prism 7 Graph pad Statisitcal software
HistoClear Clearing Agent SIGMA H2779-1L Histoclear for dewaxing and clearing
inForm Advanced
Image Analysis Software		 Perkin Elmer Inform Software 2.2.1 Data Analysis software
KI67 DAKO Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) primary antibody
KOS MILESTONE multifunctional tissue processor Milestone Microwave for Heat induced epitope retrieval
Microwave PANASONIC NN-ST651M Microwave stripping
Mowiol SIGMA ALDRICH 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 mounting media
Opal 570 PERKIN ELMER FP1488 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal520 PERKIN ELMER FP1487B21 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal540 PERKIN ELMER FP1494 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal620 PERKIN ELMER FP1495 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Poly-L-lysine coated slide FISHER SCIENTIFIC 120-550-15 Slide for tissue section adhesion in routine histological use
Spectral DAPI PERKIN ELMER FP1490 nucleic acid stain
Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) DAKO S2367 For HIER
Tris Buffer saline (TBS) 1st BASE BUF3030 20X4L for buffer wash
Tween 20 SIGMA ALDRICH P1379-1L Tween

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swerdlow, S. H., et al. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , Revised Fourth Edition, Stylus Pub LIc. (2017).
  2. Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
  3. Dabbs, D. J. Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , Saunders. (2010).
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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४३ मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस multispectral इमेजिंग मात्रात्मक विश्लेषण मार्कर्स लिंफोमा डिजिटल पैथोलॉजी
मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट Immunohistochemical धुंधला, इमेजिंग, और विश्लेषण लिंफोमा के ऊतकवैज्ञानिक नमूनों में
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