Summary
Здесь мы описываем протокол для мультиплекс флуоресцентные иммуногистохимическое окрашивание и изображений для одновременного локализации нескольких связанных рака антигенов в лимфомы. Этот протокол может быть продлен на colocalization анализ биомаркеров в всех разделах ткани.
Abstract
Иммуногистохимический (IHC) методы для in situ анализ выражения протеина, световой микроскопии являются мощным инструментом для исследовательских и диагностических целей. Однако визуализации и количественной оценки нескольких антигенов в разделе одной ткани с помощью обычных хромогенных IHC является сложной задачей. Мультиплексированных изображений является особенно актуальным в лимфома исследований и диагностики, где маркеры должны толковаться в контексте сложных опухоли микроокружения. Здесь мы описываем протокол для мультиплексных флуоресцентные IHC пятнать возможность количественной оценки несколько целевых объектов, в типах конкретных клеток интереса к лимфомы. Метод охватывает аспекты проверки антитела, антитела оптимизации, мультиплекс оптимизации с маркерами лимфомы подтипы, окрашивание ткани microarray (TMA) слайдов, и сканирование слайдов, а затем анализа данных, с конкретными Ссылка для лимфомы. С помощью этого метода, ноты для средней интенсивности маркером интерес и процент позитивность создаются для облегчения дальнейшего количественного анализа. Мультиплексирование минимизирует образец использования и обеспечивает пространственной информации, представляющей интерес для каждого маркера.
Introduction
Новообразования лимфоидной, вызванных бесконтрольного распространения злокачественного лимфоцитов. Эти клетки являются жизненно важными компонентами иммунной системы и локализации первичного и вторичного иммунных органов, например костного мозга, лимфатические узлы, селезенка и другие слизистой оболочки ассоциированной лимфоидной системы. Лимфоидных образований являются гетерогенной группы расстройств, которые классифицируются на основании созвездие функций, включая морфологии, иммунофенотип, генетические особенности и клинической картины. Хотя каждый параметр играет роль, линии остается определяющей чертой и формирует основу для системы классификации ВОЗ, которая признает новообразования, производные от клетки B, Т-клеток и естественных убийца (НК) клетки1.
Ключ к классификации лимфомы была характеристика антител против лейкоцита поверхностных маркеров различных подтипов лимфоцитов2. Иммуногистохимия (IHC) традиционно используется для анализа таких маркеров и основывается на принципе признания конкретных антиген антитело для обнаружения на основе клеток и тканей молекул, которые могут быть визуализированы через световой микроскоп 3. Однако, выявление нескольких целевых объектов на одном слайде, обычных ярко поле хромогенных мультиплекс IHC имеет ограничения, потому что это часто трудно отличить несколько сигналов цвет на участке одной ткани надежно — особенно для антигенов с очень низким выражение4. Также может быть субъективным, вызывая изменчивость в интерпретации анализа и данных5визуальной оценки и количественного определения окраски.
Таким образом обычные IHC на формалин исправлена, парафин врезанных образцов (FFPE) возможна не для одновременного обнаружения нескольких целей в иммунологически разнообразных заболеваний, как лимфома. Кроме того отличительный неопластических лимфоцитов из окружающих иммунные клетки часто является неточным. Это препятствует исследований, глядя на актуальность Роман биомаркеров в лимфомы. В этом контексте, мультиплекс флуоресцентные IHC (mf-IHC) предлагает перспективные альтернативы как позволяет количественной оценки ИССЛЕДОВАНИџ антигена и пространственные отношения с более высокой точностью при сохранении ограниченный образцы6,7. При этой технологии визуализации в партнерстве с программное обеспечение для анализа цифровых изображений, интерпретации данных производится более эффективным и облегчает исследование опухоли и микроокружения неоднородность8,9. В этом протоколе на основе tyramide иммунофлюоресценции (если) мультиплексирования метод применяется для усиления сигнала и совместим с любой ИГХ проверены антитела от любых видов хост, даже тех, которые разработаны в том же видов5,7 , 10. протокол на основе tyramide позволяет для прямого спряжение Флюорофор в ткани интерес так, что после каждого шага, позволяя для последовательного применения нескольких пятен могут быть лишены первичного и вторичного антитела без антитела перекрестной реактивности.
Мультиплексированных стратегия будет полезной для прогнозирования прогноз и лечение результатов путем определения целей и их вариант иммунологические закономерности в лимфом. Мультиплекс люминесцентные IHC был применен в нашей лаборатории для изучения группы маркеры лимфоцитов B и T и T-фолликулярная вспомогательные маркеры в angioimmunoblastic Т-клеточная лимфома (AITL), подтип периферической Т-клеточной лимфомы характеризуется агрессивным клинических поведение и опухоли неоднородность11. Полезность этого метода также иллюстрируется диффузный большой B-клеточной лимфомы (ККЛ), где увеличилась сигнализации B-клеточный рецептор с одновременным BCL-2 и C-MYC выражение предполагает потенциал терапевтического использования Брутон ингибирование киназы тирозина 12 .
Здесь мы описываем весь протокол от проверки антитела к выбору соответствующего управления тканей и мультиплексирование с помощью лимфома FFPE ткани, с возможного анализа окрашенных слайдов с помощью сканирования автоматизированных количественные патологии изображений системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все ткани, используемые в настоящем протоколе были получены под Сингапур NHG домена конкретного обзора Совет B изучение 2014/00693.
1. отбор и проверка антител
Примечание: Прежде чем продолжить создание любой мультиплексированных группы, убедитесь, что все антитела пятно энергично, выявления только целевой антиген интереса. Цель состоит в том, чтобы выбрать антитела, которые конкретно признать антигена интереса в разделах ткани.
- Для антитела с устоявшейся исследования использования, или обычной клинического применения в ИХС подтвердите условия, такие как epitope поиска и антитела разрежения, выполняя обычные IHC5,13 на положительной и отрицательной контроля ткани разделы. Для разделов в ткани человеческого происхождения обеспечить соответствующие этики зазоров на месте до начала экспериментов.
Примечание: Позитивные элементы тканей, которые, как ожидается, выразить антигена интереса, и негативный контроль являются те, которые не. Доброкачественные миндалин ткани выбирается как элемент хорошей ткани для лимфомы антигены потому, что он содержит смесь иммунных клеток, включая клетки B, Т-клеток и антиген представляющих клеток, а также стромы и эпителиальных клеток. Последние служат полезным негативные внутреннего контроля. - Для неизвестных целей или для коммерческих антител с недостаточным опубликованных данных, выполнить проверку антитела, создав соответствующие позитивные и отрицательный контроль FFPE клеток блоков14, используя ТРИФОСФАТЫ нокаут- или siRNA НОК Даун антигена интереса в соответствующей ячейке линии через стандартный молекулярные методы биологии. Используйте эти блоки ячеек FFPE вместо положительной и отрицательной контроля тканей для обычных IHC согласно шага 1.1.
Примечание: Клетки HeLa или 293T обычно используются для антигенов, которые не являются тип ячейки конкретные, как линии клетки лимфомы трудно transfect. Для антигенов, которые являются лимфоцит конкретные линии клетки лимфомы может использоваться с вирусной трансдукция или электропорации как способ доставки генов (хотя и с низкой эффективности).
2. Планирование последовательности антител и флуорофоров для панели мультиплекс
- Спланируйте последовательность реагентов для окончательного мультиплекс окрашивания. Например здесь последовательность для мультиплекс протокол изначально планировалось как первый, Bcl-6; Во-вторых, Bcl-2; в-третьих, C-Myc; в-четвертых, CD20; в-пятых, Ki67.
Примечание: Принять решение о последовательности, антитела с слабым сродством, требующих более высокие концентрации должны быть окрашены сначала в окончательный мультиплекс пятнать. Высокоспецифичных антител, которые способны выдерживать несколько раундов микроволновой зачистки применяются последние в протоколе мультиплекс, чтобы избежать неспецифических окрашивания. - План Флюорофор партнер для каждого антитела в панели. См таблицу 1 и Таблица материалов для выборов в этом примере.
Примечание: Принять решение о Флюорофор партнер для каждого антитела, выберите спектрально собственный флуорофоров антитела с аналогичными моделями локализации в пределах клетки и ткани. Это сведет к минимуму спектрального наложения и сложности с расслоение.
3. Monoplex Tyramide-на основе если панели имитации 5-plex мультиплекс
Примечание: В этом примере протокол для CD20 обсуждается, которая планируется как четвертый антителами в мультиплекс последовательности, описанной выше. Количество дополнительной зачистки шагов будет отличаться на должность антитела в последовательности.
- Вырежьте 3 мкм тонких секций положительных и отрицательных управления ткани, используя микротом и место разделы на скольжениях микроскопа, поли L-лизин покрытием стекла.
- DEWAX разделы с помощью соответствующей очистки решения 3 x 4 мин. Увлажняет слайды в 100% алкоголя, 90% алкоголя и 70% спирта, 4 мин. Поместите слайды в дистиллированной воде 2-3 мин.
- Место слайды в микроволновых чашу в буфере извлечения стандартный антигена (коммерчески доступных) погружать слайды. Выполнение тепло индуцированной epitope извлечения (HIER) с помощью микроволновой подходящего pH9 антигена поиска решения на 98 ° C 25 мин.
Примечание: Может использоваться любой печь с давлением, начиная от 800-1100 Вт, а HIER может быть оптимизирована соответственно. В этом случае Многофункциональная микроволновая ткани процессор (открыт для воздуха) использовался для HIER и зачистки. Начальные настройки для поиска конкретных эпитопу основаны на предварительных знаний от обычных IHC. - Выполните дополнительные раунды микроволновой зачистки (три в данном случае, для четвертый антителами в панели), каждый раунд с 100% мощности до 98 ° C и 20% мощности на 10 минут, чтобы поддерживать при той же температуре. Охладить вниз слайды в дистиллированной воде для по крайней мере 10 мин.
Примечание: Выполнение нескольких раундов микроволновой зачистки на этапе monoplex Если подвергать целевой антигена в такое же количество Отопление шаги как в предлагаемом Мультиплекс. Так как CD20 планируется как четвертый антителами, СВЧ, зачистки 3 x до и один раз после этого основное антитело инкубации. - Проверить и пополнить буфера после каждые 5 минут во время зачистки дополнительных Микроволновая печь. Главное не позволяйте слайды высохнуть в течение нескольких зачистки процедур. При принятии слайды из микроволновой печи, используйте щипцы и теплостойкие перчатки поместить их в отдельную банку дистиллированной воды. Ждать для антигена поиска решения для охлаждения естественно.
- Блокировать активность пероксидазы ткани с помощью блока коммерческих пероксидазы 10 мин (3% перекись водорода может использоваться как альтернативный реагента). Промойте трис амортизированное saline (TBS) и неионогенных моющее средство для 5 мин.
Примечание: TBS состоит из 50 Tris-Cl, pH 7.5 и 150 мм NaCl.TBS сделать TBS-D. - Блок с разбавителем антитела или альбумина Bovine сыворотки для 15 мин после инкубации с основного антитела интерес (например, CD20, стоматологов разрежения в разбавителе антитела, см. Таблицу материалов) при комнатной температуре за 30 минут Вымойте 3 x с TBS-D буфер для 5 минут каждый раз. Там должно быть достаточно буфера TBS-D погрузите слайд полностью во всех стиральных шагах.
Примечание: Альбумина Bovine сыворотки может использоваться как альтернативный антитела разбавителя. Объем разбавителя антитела зависит от размера ткани, начиная от 50 мкл (для биопсии образцов) до 400 мкл (для иссечения пробы или образцы microarray ткани). - Проинкубируйте с соответствующим пероксидазы (ПХ)-меченных вторичное антитело, выбранных на основе видов происхождения первичного антитела для 15 мин при комнатной температуре. Вымойте 3 x с TBS-D буфер для 5 минут каждый раз.
- Применять соответствующие на основе tyramide флуоресцентных реагентов (1: 100 в усилении разбавителя) и инкубации при комнатной температуре в течение 5 минут, чтобы позволить Флюорофор сопряжения для образца ткани на участках основного антитела связывая. Вымойте 3 x с TBS-D буфер для 5 минут каждый раз.
- Выполните дополнительные основанные на микроволновой зачистки для удаления первичных и вторичных антител. Повторите при необходимости на основе позиции антитела в последовательности.
- Место слайда в дистиллированной воде остыть. Инкубируйте 10 мин, а затем вымыть с DAPI (1: 100 разрежения в разбавителе антитела) 3 x с TBS-D буфер для 5 минут каждый раз. Сухие области на слайде без ткани с салфетки и смонтировать слайд с соответствующим монтажа СМИ.
- Изображение слайда (см. разделы 6 и 7 настоящего Протокола) и определить целесообразность окрашивание (как определено четкое дискриминации положительной и отрицательной контроля ткани).
Примечание: Если окрашивание шаблон неверно, повторить monoplex, пятнать после корректировки одно или несколько из следующих параметров: количество тепла извлечения шаги, количество извлечения тепла, инкубационный период/концентрация антител (первичного и вторичные), положение антител в последовательность и выбор Флюорофор. Monoplex, окрашивание шаг обычно требует нескольких раундов оптимизации для получения подходящий набор параметров для соответствующей окраски. Рекомендуется проверить широкий спектр флуорофоров с каждого основного антитела, как это обеспечит гибкость при определении окончательного набора Мультиплекс.
4. повторение Monoplex для каждого антитела в протоколе мультиплекс
- Повторите окрашивание для других антител в Аналогичным образом, регулируя количество микроволновой зачистки шаги, исходя из позиции антитела в последовательности monoplex. Например при выполнении monoplex окрашивания для третьего антитела в шести plex мультиплекс группы, выполните два микроволновой зачистки шаги до и три микроволновой зачистки после основное антитело инкубации.
Примечание: Важно осознавать, что на основе микроволновой зачистки антител также предоставляет образец HIER. Если специфическое антитело требует различных эпитопов стратегии поиска, это необходимо принимать во внимание при планировании мультиплекс последовательности. В этом примере Ki67 epitope поиска требует pH 9, за 30 мин. Так как 25 мин HIER будет осуществляться до KI67 пятнать в последовательный протокол, только дополнительные 5 минут HIER необходимы.
5. мультиплекс, окрашивание протокол
Примечание: Перейти с мультиплексом, окрашивание протокол, только после того, как все компоненты были оптимизированы с помощью monoplex если окрашивание. Просмотрите результаты окрашивания monoplex и дизайна таблица, показывающая окончательный макет ордена мультиплекс и выбор Флюорофор для каждого антитела. Подробности концентрации антитела, продолжительность окрашивание и последовательность и характер получения тепла для каждого антитела, используемые здесь предусмотрено в таблице 1.
- Вырезать 3 мкм тонких секций положительных и отрицательных управления ткани, а также в ткани-мишени интерес (здесь, образцы FFPE лимфомы), используя микротом и место разделы на стеклянных скольжениях микроскопа поли L-лизин покрытием (см. Таблицу материалы).
Примечание: Включение положительной и отрицательной контроля для каждого антитела в панели рекомендуется, наряду с фактическим образцы для мультиплексирования. Это позволяет для подтверждения, что окрашивание протокол была выполнена правильно. - DEWAX, получения тепла индуцированной epitope (HIER) и блокировать активность пероксидазы ткани как действия протокола monoplex 3.3-3.5.
- Проинкубируйте с первого основного антитела оптимизированный мультиплекс последовательности, как ранее определены с использованием monoplex если шаг. В этом примере BCL-6, 1:30 разрежения в антитела разбавителя при комнатной температуре 60 мин (см. Таблицу материалов), является первым шагом мультиплекс протокола. Промойте TBS-D буфер для 5 мин.
- Проинкубируйте с соответствующим HRP-помечены вторичное антитело на основе видов первичного антитела, используемые в предварительного шага (см. Таблицу материалов) при комнатной температуре на 10 мин мыть с буфером TBS-D для 5 мин.
- Примените оптимизирован на основе tyramide флуоресцентные реагент (Cy5 в этом примере, 1: 100 в разбавителе амплификации, смотрите Таблицу материалы) с инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин. После инкубации мыть с буфером TBS-D для 5 мин.
Примечание: Выбор на основе tyramide флуоресцентных реагентов основан на оптимизированный monoplex если. - Проверить эффективность окрашивание первым антителом, с помощью соответствующего микроскопа (см. Таблицу материалы).
Примечание: Если образец ТМА или слайд, временных изображений проверки можно сделать с легкостью. Если, однако, пятно выполняется на нескольких слайдах, это может быть нецелесообразным, и этот шаг может быть пропущен. - Выполните, Микроволновая зачистки для второго антитела в протоколе, с помощью условий, оптимизированы на monoplex этапе. Затем действуйте с пятнать второго основного антитела (здесь, BCL2) с ПХ помечены вторичные антитела и на основе tyramide флуоресцентных реагентов (здесь, 520, см. Таблицу материалы). Проверьте эффективность окрашивание под микроскопом флуоресцентные после завершения второго этапа окрашивания.
- Аналогичным образом, повторите процедуру, используя третий, четвертый и пятый антител в последовательности (здесь и c-Myc, CD20, ki67, соответственно, с флуорофоров, 570, 540 и 620, соответственно). Выполняйте тепловизионных проверок между каждый шаг, если это возможно.
- Добавьте ядерной изображение (DAPI, 1: 100 разрежения в антитела разбавителя) за 10 мин и промойте, 2 x TBS-D для 5 минут.
- Смонтируйте слайды с помощью реагента соответствующие крепления.
6. Подготовка спектральной библиотеки слайдов
Примечание: Разделы 6-8 настоящего Протокола являются уникальными для мультиплексных экспериментов, которые отражаются с помощью спектральной камеры.
- Создание библиотеки слайдов (сингл пятно ссылка изображения) для каждого Флюорофор, DAPI и аутофлюоресценция на же управления ткани, которые будут использоваться для анализа многоспектральных изображений.
- Вырезать 2 x 3 мкм тонких секций ткани типа интереса (здесь, образец лимфомы или миндалин как управления) используя микротом и поместить эти разделы на скольжениях микроскопа, поли L-лизин покрытием стекла.
- Процесс как слайды по протоколу monoplex (со всеми зачистки и мытье шаги), но без добавления антитела или Флюорофор.
- Пятно один слайд с DAPI согласно шаг 5.9 и оставить один слайд, безупречная (для поколения спектра аутофлюоресценция ткани).
Примечание: Оптимизированный monoplex слайды (с одного флуоресценции краской, без DAPI) может использоваться как спектральной библиотеки слайдов для создания спектры каждого Люминесцентная краска.
- Сканировать эти набор слайдов, используя соответствующие фильтры и загружать их в библиотеку анализа изображения.
7. спектральная томография
-
Сканирование слайдов monoplex
- Выберите фильтры фильтры доступны стандартные epi флуоресценция (DAPI, FITC, CY3, Техас красный и CY5) подходит для занятых Флюорофор.
Примечание: Рекомендуется фильтра кубов для конкретных флуорофоров, используемые в этом примере показаны в таблице 2-15. - Изучите каждый маркер в его соответствующем канале флуоресценции для выявления подходящих выдержка для получения чистого сигнала. Сосредоточить внимание на компоненте ткани, которая должна иметь сильный сигнал для маркера.
- Определите фиксированный выдержка для каждого исследуемое вещество (комбинации антител Флюорофор), чтобы разрешить кросс образец сравнения интенсивности пикселей (хотя некоторые коммерческие платформы имеют нормализации стратегий для учета различия в экспозиции).
- Принять решение о фиксированной выдержка для данного канала, используйте параметр живой камеры для регулировки времени экспозиции пока не существует никаких пересвеченных областей в изображении живой камеры и повторите эти действия для всех каналов.
- После сканирования monoplex слайды, генерировать изображения моделируемых brightfield (если эта функция доступна в программное обеспечение, используемое) визуально сравнить с привычной IHC и определить, если окрашивание шаблон является правильным (рис. 1 и Рисунок 2 ).
- Выберите фильтры фильтры доступны стандартные epi флуоресценция (DAPI, FITC, CY3, Техас красный и CY5) подходит для занятых Флюорофор.
-
Сканирование мультиплекс образцы (скольжениях TMA / несколько образцов)
- Настройка оптических параметров, как описано для сканирования изображения monoplex (шаг 6.1). Во-первых, Отрегулируйте фокус вручную или автоматически (следуйте инструкциям конкретные изображения, сканирование машины). Во-вторых Отрегулируйте время экспозиции для каждого флуоресцентные канала обеспечить, что все ядра на TMA, или всех областей на слайде, надлежащим образом подвергаются.
Примечание: Площадь выбранного для регулировки времени экспозиции имеет важное значение. Пользователям нужно выбрать регион сильный сигнал для каждого фильтра (т.е., Ki67 сигнал сильнее в регионе зародышевого центра миндалины чем в регионе nongerminal центр; следовательно, пользователи должны использовать зародышевого центра региона в соответствующей экспозиции время). Пользователи могут также принять перенасыщения функция коррекции изображений системы, если таковые имеются. - Сканировать скольжениях TMA под ТМА режим сканирования, если доступны в системе обработки изображений, с соответствующим автофокусом алгоритмом.
- Целом ткани разделе Слайды получите слайды, проверены квалифицированным патологоанатомом для выбора оптимального изображения из самых представительных районах опухоль.
Примечание: Протокол, описанные здесь основан на систему анализа определенных Микроскоп/изображения (см. Таблицу материалы). Есть другие машины и программное обеспечение для анализа изображений, который может сканировать и анализировать мультиплекс IHC слайды7.
- Настройка оптических параметров, как описано для сканирования изображения monoplex (шаг 6.1). Во-первых, Отрегулируйте фокус вручную или автоматически (следуйте инструкциям конкретные изображения, сканирование машины). Во-вторых Отрегулируйте время экспозиции для каждого флуоресцентные канала обеспечить, что все ядра на TMA, или всех областей на слайде, надлежащим образом подвергаются.
8. анализ данных
-
Preanalysis Оценка и планирование
- Используйте ссылку слайд для аутофлюоресценция вычесть аутофлюоресценция от изображений, отсканированных для анализа.
- Обзор изображений перед анализ, чтобы убедиться, что они находятся в центре внимания и без окрашивания артефактов.
- Используйте маркер опухоли (например, CD20 в этом примере) для идентификации клеток интерес и приступить к сегментации клеток, озвучивание и пакета анализа подходов. Выберите CD20-положительных клеток для анализа.
Примечание: К примеру, в ККЛ образцы проанализировали здесь, настройки и параметры, которые определены для ячейки сегментации основаны на ядерный размер и интенсивность, но являются специфическими для используемого программного обеспечения анализа изображений (например, DAPI означают интенсивности пикселей в наименее 0,05; размер между 80-320 пикселей, с разделением чувствительностью в 2 [это программное обеспечение конкретного параметра, который опирается на морфологию опухоли: для небольших опухолевые клетки, разделение 0,7 - 1 соответствующие; для крупных опухолевых клеток, расщепление может быть скорректирована до 4]). - Запрос для квалифицированных патологоанатом обзор отдельных изображений и решить, требуется ли для выбора опухолевых клеток ткани сегментации обогатили и исключить регионами с некроза arearegion Хамарат обильные реактивной клеток. При необходимости дополнительные ткани сегментации, затем выберите соответствующий элемент управления регионов (например, опухолевых клеток/стромы/некроз) и проверьте, что программное обеспечение для анализа изображений можно правильно определить такие регионы
- Перейти к ячейке сегментации после сегментации ткани (если таковые имеются), патологоанатом квалифицированным для просмотра карты сегментации ячейки для обеспечения точности предполагаемой сегментации подход5запрос.
- Определите наиболее биологически/клинически соответствующий метод анализа для данного биомаркёра интерес (например, процент позитивности или средней интенсивности в клетку).
- Выберите порогового значения для каждого маркера (для положительности процент).
- Определите оптических интенсивности позитивные порогового значения для каждого маркера в сочетании с патологоанатом. Создание гистограммы, анализируя частотное распределение интенсивности/ячейки маркер в соответствующей статистики программное обеспечение (см. Таблицу материалы).
Примечание: Гистограмме значения интенсивности может предложить общий обзор распределения интенсивности сигнала. - Определить приблизительное отрезанными от гистограммы и проверьте это с патологоанатом обзор, соотнести с вручную определяется минимально на выбранных изображений. В некоторых ситуациях форма единого производства не будет возможным благодаря изменчивость окраски, и необходимо будет вручную порогового значения для каждого образца.
Примечание: Раздел 8.1 должно быть сделано в программное обеспечение для анализа изображений (см. Таблицу материалы) если не указано иное.
-
Маркировка положительные и отрицательные клетки
- Для каждого маркера интерес, согласно номеру отсечения, определяется (через гистограммы или вручную), использование «IF» или аналогичную формулу логики, чтобы отметить положительные и отрицательные клетки с пометкой значение: номер 1 для позитивных клеток, 0 отрицательные клетки.
- Для положительности всех маркеров умножьте заметное значение каждого маркера (1 или 0) с продуктами в отдельных столбцах. Если продукт равен 1, это означает, что ячейка является положительным для всех маркеров. Для и ым-сон определенного маркера используется алгоритм если логика.
Примечание: Раздел 8.2 необходимо сделать в статистике программного обеспечения (см. Таблицу материалы).
-
Создание процент данных и числовых данных с помощью сводной таблицы
- Создание процент данных для конкретных маркеров, представляющих интерес, в рамках определенных клеток (например, CD20-положительных клеток или CD20-отрицательные клетки) (рис. 6).
- Вставьте в лист данных сводной таблицы.
- Чтобы вычислить процент позитивность одного маркера, например CD20, выберите функцию SUM под значение часть сводной таблицы, чтобы подсчитать общее количество CD20-положительных клеток с помощью сумма CD20+ клеток, разделенных Общая мобильный номер. В результате получается CD20+ клеток в процентах в пределах одного ядра или номер в одном из исследований (зависит от выбора строки сводной таблицы).
- Рассчитать процент позитивность несколько маркеров, используя тот же метод (рис. 3).
- Создать числовые данные. Экстракт средний нормализованных счетчик для каждого маркера каждого ядра или номер каждого исследования путем получения средней интенсивности каждого маркера интерес во всех клетках, изучал в течение образца (рис. 4).
Примечание: Значение медианы не могут быть получены в сводной таблице непосредственно. Это могут быть получены с помощью этой формулы: медиана (если (столбец исследования числа = номер конкретного исследования, столбец нормализованное значение)).
-
Печать данных в подходящий график
- Участок результаты процент позитивности или средней интенсивности на маркер в ячейке тип интереса к соответствующим образом для дальнейших статистических испытаний и презентации.
- Создайте точку участков для наглядного представления чисел и распределения.
Примечание: Представление данных с Бар графики не передают информацию о распределении. Оценка участков рекомендуется также как хороший метод для представления данных, с упором на величину разницы между образцы16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MF-IHC изображения для ККЛ образца с C-MYC и BCL2 гена перестановка (двойной хит лимфомы) показано на рисунке 1. Рисунок 2 иллюстрирует имитируемых ярко поле иммуногистохимические изображений. Рисунок 3 показывает процент данных. Рисунок 4 показывает сведения о средний формулы для поколения числовых данных. Рисунок 5 показывает применение mf-IHC группы Т-клеток в angioimmunoblastic Т-клеточными лимфомами. Рисунок 6 показывает оптимизации изображения образца управления миндалин и анализ данных для этого образца.
Рисунок 1: B-клетки мультиплексированных иммунофлюоресценции панель изображений для диффузного большой образца B-клеточной лимфомы (ККЛ) с перегруппировки гена C-MYC и CL2 (двойной хит лимфомы). Пурпурный = CD20 (мембраны); белый = BCL2 (цитоплазма); желтый = Ki67 (ядерных); зеленый = C-MYC (ядерных); красный = BCL6 (ядерных), голубой = DAPI (ядерная изображение). CD20-позитивных опухолевых клеток показывают высокое выражение для C-MYC (80%) и BCL2 (> 90%), и индекс распространения Ki67 также высока (90%). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Имитация ярко поле иммуногистохимические изображения (генерируется из рисунка 1) же ККЛ образца с C-MYC и BCL2 гена перестановка (двойной хит лимфомы). CD20 показывает мембраны, пятнать в опухолевых клетках. BCL2 показывает пятнать в цитоплазме > 90% опухолевых клеток. C-MYC позитивность составляет около 80%. BCL6 показывает ядерной пятнать в приблизительно 20% из клеток. Ki67 является положительным в 90% клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: сводной таблицы показаны способы создания процент данных согласно номеру исследования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: медиана формула для нормализованных Ki67 ОД значения по данным исследования номер. Инструкция IF находит все исследования числа, которые равны к ряду конкретных исследований (который в этом рисунке 52). Затем он возвращает значение соответствующего Ki67 нормализуется . CTRL + Shift + Ввод комбинации клавиш может использоваться для вычисления медианы (Медиана Ki67) для этих возвращаемых значений, который является 11.56 для исследования № 52. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: мультиплексированных иммунофлюоресценции панель изображений пример angioimmunoblastic Т-клеточная лимфома (AITL). (A) составное изображение показывает сотовой неоднородность AITL образца. Пурпурный = CD20 (мембраны); желтый = CD4 (мембраны); Зеленый = PD1 (мембраны); красный = BCL6 (ядерных); Голубой = CD8 (мембраны); синий = DAPI (ядерная изображение). (B) верхний ряд изображений показано увеличенное представление региона, выбранного в поле белый группа A. Нижний ряд изображений показывает соответствующий сегментирована клеток маски: желтый/красный/зеленый показаны один CD4/BCL6/PD1-положительных клеток, соответственно. Синий цвет представляет отрицательные клетки, и белый указывает двойной положительных клеток. Изображения показывают, что 50% CD4+ клетки являются PD1+ (левая, белый), в то время как 20% CD4+ клетки также являются позитивными для BCL6 (середина, белый). Двойной позитивность PD1 и BCL6 составляет около 10% (право, белый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: мультиплексированных иммунофлюоресценции оптимизации изображений для управления ткани миндалин. (A) составное изображение показывает зародышевого центра область образца управления миндалин. Желтый = C-Myc (ядерных); красный = BCL6 (ядерных); Голубой = BCL2 (цитоплазма); Пурпурный = CD20 (мембраны); Зеленый = Ki67 (ядерных); синий = DAPI (ядерная изображение). C-Myc положительный только в несколько ячеек. BCL6 и Ki67 положительные главным образом в зародышевого центра, в то время как BCL2 положительный главным образом за пределами зародышевого центра. CD20 диффузно позитивные, внутри и снаружи зародышевого центра. (B) таблицы показывает, что зародышевого центра CD20-положительных клеток также являются позитивными для BCL6 и Ki67 но негативные для BCL2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Пятнать антитела последовательность | Ослабленный первичный гуморальный (см. таблицу материалов) | Требуется всего HIER | Фактические pre пятно HIER | Вторичные антитела | Флюорофор | Пост-TSA антитела зачистки |
| 1 | Мышь анти Bcl6 (1:30, 60 мин RT) | 25minutes, Ph9 | 25minutes, Ph9 | HRP-конъюгированных анти мыши, 1: 1000 ' для 10' | Опал Cy5 в масштаба 1: 100 | 1 тур 100% мощности 1 мин, 20% мощности на 10 мин |
| 2 | Анти Bcl2(1:50,60 min RT) Мышь | 25minutes, Ph9 | Нет | HRP-конъюгированных анти мыши, 1: 1000 ' для 10' | Опал 520 в масштаба 1: 100 | 1 тур 100% мощности 1 мин, 20% мощности на 10 мин |
| 3 | Кролик анти c-MYC(1:50,30 min RT) | 25minutes, Ph9 | Нет | HRP-конъюгированных анти кролик, 1: 1000 ' для 10' | Опал 570 в масштаба 1: 100 | 1 тур 100% мощности 1 мин, 20% мощности на 10 мин |
| 4 | Анти CD20(1:2000,30 min RT) Мышь | 25minutes, Ph9 | Нет | HRP-конъюгированных анти мыши, 1: 1000 ' для 10' | Опал 540 в масштаба 1: 100 | 1 тур 100% мощности 1 мин, 20% мощности на 10 мин |
| 5 | Мышь анти ки 67(1:50,45 min RT) | 30minutes, Ph9 | 5 минут pH9 | HRP-конъюгированных анти мыши, 1: 1000 ' для 10' | Опал 620 в масштаба 1: 100 | 1 тур 100% мощности 1 мин, 20% мощности на 10 мин |
Таблица 1: пример окончательный макет для мультиплексирования если окрашивание. В этой таблице приведен пример указания количество HIER и на основе микроволновой зачистки предстоит сделать на каждом шаге, после того, как были оптимизированы monoplex пятна.
Таблица 2: руководство к выбор фильтра для флуорофоров. Эта таблица содержит грубый направляющий выступ к соответствующие фильтры, которые могут использоваться на указанное оборудование, чтобы визуализировать флуорофоров интерес. Рекомендуется проверить спецификаций фильтра используется в отношении выбросов/возбуждения профиль используется флуорофоров микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MF-IHC имеет потенциал для включения патологоанатомов для уточнения diagnosticcriteria в лимфоидных патологии и анализировать роль биомаркеров в типах конкретных клеток к предсказание клинических исходов. Как новый метод исследования mf-IHC все чаще применяется для количественного и пространственной идентификации нескольких иммунных параметров опухолевых клеток17. Было показано, что обнаружение mf-IHC для совместного выражения опухоли биомаркеров быть воспроизводимость и надежный5. Однако технология остается зарождающейся и подвергается изменчивости, вытекающих из реагент - и/или факторов, связанных с ткани, например, те из-за несоответствия в ткани фиксации и обработки.
Решающее значение для техника использования хорошо проверенных антител, которые являются специфическими, чувствительные и дают воспроизводимые результаты. Есть примеры в литературе антител первоначально описано конкретно для их антигены и позже продемонстрировал признать несвязанных белков с помощью модели нокаут-14. Нокаут- / НОК Даун проверки метод в котором одичал типа или клетки с гиперэкспрессия антигены служат как позитивные элементы в то время как клетки с целями выбил или сбит siRNA или ТРИФОСФАТЫ методы используются как негативный контроль.
Как обычные IHC mf-IHC имеет много важных переменных, которые должны быть оптимизированы для каждого эксперимента, для оптимального окрашивание и результаты. К ним относятся pH извлечения раствора антигена, разбавления антитела, назначение Флюорофор для каждого маркера и концентрация Флюорофор. Часто используемые антигена поиска решения, рН 6 и 9. Это стоит проверить, какой рН дает оптимальное окрашивание структуру и интенсивность с менее фоном.
Существует без конкретных рекомендаций принять решение о последовательности применения антител в мультиплекс эксперимент, как он не только зависит от сродства антитела, но и на прочность опал флуорофоров. В общем антитела с слабым сродством часто требуют более высокие концентрации, основанный на monoplex окрашивание и сначала применяются в последовательности, мультиплекс. Сильное сродство антитела, которые, вероятно, быть устойчивыми к зачистки применяются, чтобы избежать неспецифических окрашивания. Что касается выбора конкретного Флюорофор желательно избегать использования флуорофоров с аналогичными спектральных волн для антигенов, которые colocalize в том же сотовой отсеках. Антигены с низкой выражение уровня назначаются с ярким флуорофоров и наоборот. Если в образце исследования, слабой интенсивности сигнала, регулируя опал TSA разбавления можно сделать для достижения желаемого сигнала18. В некоторых случаях пытаясь различными антигена методы извлечения или увеличения концентрации основного антитела могут работать. Начального разбавления основное антитело может быть таким же, как в обычных IHC эксперимент. Однако если сигнал если не ясно, тестирование других антител разведений потребуется, как условия, оптимизированный для IHC не всегда приводят к если. Интенсивность сигнала зависит от порядок или последовательность иммуноокрашивания. Некоторые epitopes переэкспонированных после двух или трех раундов МВт, в то время как некоторые может ухудшиться из-за избыточного МВт. Некоторые флуорофоров также могут быть затронуты МВт и должны быть проверены на затухание.
Этот протокол фокусируется на colocalization и измерения интенсивности маркеров в рамках подмножества ячеек в B-клеточной лимфомы. Основные проблемы в развитии нынешнего протокола включают поколение оптимизированных мультиплекс группы для антигены, которые colocalize в том же сотовой отсеках. Там должно быть точным расслоение флуорофоров для точного количественного определения. Как только панели Мультиплекс в месте, изображений окрашенных слайдов является относительно простым. Следующим препятствием включает в себя анализ образов данных. В отличие от в иммунной инфильтрации исследования, где количественный иммунных клеток конкретных типов в эпителиальные опухоли прямой, colocalization исследования в лимфомы полагаются на определение позитивность подготовленных патологоанатом для каждого маркера интерес. Вытекающие на соответствующие диагностические отсечения, которые могут применяться в повседневной клинической практике остается работа. Необходимо будет доработать методов нормализации данных и автоматизированного производства триангуляции, прежде чем этот метод может быть интегрирована в рутинной диагностики.
Несмотря на существующие ограничения потенциальные приложения mf МХК и знания, которые можно почерпнуть из исследование опухолевых клеток и их пространственные отношения с микроокружения делают его привлекательным инструментом, особенно для сложных гистологических раковые заболевания, например лимфоидных злокачественности. Для создания протоколов в ткани фиксации и обработки ткани, которые являются оптимальными для предлагаемого рабочего процесса, а также расширение пятная методы, чтобы позволить для одновременного анализа большего числа целей необходима дальнейшая работа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
A.D.J. получил финансирование от Перкинэлмер на поездки на заседания группы пользователей. Авторы имеют другие конфликта интересов не разглашать.
Acknowledgments
Министерство здравоохранения Сингапура национальных медицинских исследований Совета переходного периода награды (NMRC/TA/0020/2013 и NMRC/TA/0052/2016) поддерживаются S.-б.н. и A.D.J.. Авторы признают Сью Ен Юн исследовательский грант A.D.J. из Национального института университета рака Сингапура к покупке спектральных тепловизионных микроскопом Vectra. Это исследование одобрено Сингапур NHG домена конкретного обзора Совет B (2014/00693).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
References
- Swerdlow, S. H., et al. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , Revised Fourth Edition, Stylus Pub LIc. (2017).
- Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
- Dabbs, D. J. Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , Saunders. (2010).
- Kim, S. -W., Roh, J., Park, C. -S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Anderson, M. W., Natkunam, Y. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. Jones, D. , Humana Press. 21-44 (2010).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
- Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Tóth, Z. E., Mezey, É Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Ng, S. -B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
- Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).
- Kalyuzhny, A. E. Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , Humana Press. (2011).
- Bordeaux, J., et al. Antibody validation. BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).
- PerkinElmer. Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User's Manual. , PerkinElmer, Inc. (2012).
- Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
- Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
- PerkinElmer. Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , PerkinElmer, Inc. (2017).
