Summary
Aqui descrevemos um protocolo para multiplex immunohistochemical fluorescente de coloração e de imagem para localização simultânea de múltiplos antígenos associada a câncer de linfoma. Este protocolo pode ser estendido para a análise de colocalization de biomarcadores dentro de todas as secções de tecido.
Abstract
Métodos de imuno-histoquímica (IHC) para a análise in situ da expressão da proteína por microscopia de luz são uma ferramenta poderosa para fins de diagnóstico e pesquisa. No entanto, a visualização e a quantificação de vários antígenos em uma seção de tecido único usando IHC cromogênico convencional é um desafio. Imagem multiplexada é especialmente relevante na investigação de linfoma e diagnósticos, onde marcadores tem que ser interpretada no contexto de um microambiente do tumor complexo. Aqui descrevemos um protocolo para multiplexado IHC fluorescente coloração para permitir a avaliação quantitativa de alvos múltiplos em tipos de células específicas de interesse do linfoma. O método abrange os aspectos de validação de anticorpo, otimização de anticorpo, a otimização multiplex com marcadores de subtipos de linfoma, a coloração de lâminas de tecido microarray (TMA) e a digitalização de slides, seguido de análise de dados, com específicas referência para o linfoma. Usando esse método, partituras para ambos a intensidade média de um marcador de interesse e a percentagem de positividade são geradas para facilitar ainda mais a análise quantitativa. Multiplexação minimiza a utilização da amostra e fornece informação espacial para cada marcador de interesse.
Introduction
Neoplasias linfoides são causadas pela proliferação descontrolada de linfócitos maligna. Estas células são componentes vitais do sistema imunológico e localizar nos órgãos imunes primárias e secundárias, tais como a medula óssea, linfonodos, baço e outro sistema linfoide associado a mucosa. Neoplasias linfoides são um grupo heterogêneo de desordens que são classificados com base em uma constelação de características, incluindo morfologia, imunofenótipo, apresentação clínica e características genéticas. Enquanto cada parâmetro desempenha um papel, linhagem continua a ser uma característica definidora e constitui a base para o sistema de classificação do WHO que reconhece neoplasias derivadas de células B, células T e natural killer (NK) células1.
Chave para a classificação de linfoma foi a caracterização dos anticorpos contra marcadores de superfície dos leucócitos dos vários subtipos de linfócitos2. Imuno-histoquímica (IHC) tem sido tradicionalmente utilizado para a análise de tais marcadores e baseia-se no princípio do reconhecimento do antígeno-anticorpo específico para detectar moléculas baseadas em células e tecidos que podem ser visualizadas através do microscópio de luz 3. no entanto, a identificação de alvos múltiplos em um único slide por convencional brilhante-campo cromogênico multiplex IHC tem limitações porque muitas vezes é difícil distinguir vários sinais de cor em uma seção de tecido único confiável — especialmente para os antígenos com uma expressão muito baixo4. Avaliação visual e quantificação de coloração também podem ser subjetivas, causando a variabilidade na interpretação de dados e análise5.
Portanto, IHC convencional em amostras de formalin-fixas, parafina (FFPE) não é viável para a detecção simultânea de múltiplos alvos em imunologicamente diversas doenças como o linfoma. Além disso, distinguir linfócitos neoplásicos das células imunes circundantes é muitas vezes imprecisa. Isto dificulta estudos olhando a relevância de novos biomarcadores em linfoma. Neste contexto, IHC fluorescente multiplex (mf-IHC) oferece uma alternativa promissora como permite a avaliação quantitativa coexpression antígeno e uma relação espacial com maior precisão, preservando a limitada amostras6,7. Quando esta tecnologia de imagem é uma parceria com o software de análise de imagem digital, a interpretação dos dados é feita mais eficiente e facilita o estudo de tumor e microambiente heterogeneidade8,9. Neste protocolo, a imunofluorescência baseada em tyramide (IF) multiplexação método é aplicada para amplificar o sinal e é compatível com qualquer anticorpo IHC validados de qualquer espécie de hospedeiro, mesmo aqueles desenvolvidos na mesma espécie5,7 , 10. o protocolo baseado em tyramide permite a conjugação direta do fluoróforo no tecido de interesse para que o anticorpo primário e secundário pode ser desnudado após cada etapa, permitindo a aplicação sequencial de múltiplas manchas sem reactividade cruzada do anticorpo.
Uma estratégia multiplexada será útil para prever resultados de prognóstico e tratamento através da identificação de alvos e seus padrões variante imunológicas em linfomas. Multiplex fluorescente IHC tem sido aplicado em nosso laboratório para o estudo de um painel de marcadores de T e de linfócitos B e T-folicular marcadores de auxiliar em angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL), um subtipo de um linfoma de células T periférico caracterizada por agressivo clínico comportamento e tumor heterogeneidade11. A utilidade desse método é também ilustrada em difusa linfoma de células B grande (DLBCL), onde o aumento de sinalização de um receptor de células B com expressão de C-MYC e BCL-2 simultânea sugere o uso terapêutico potencial de inibição de quinase de tirosina de Bruton 12 .
Aqui descrevemos o protocolo inteiro da validação de anticorpo para a seleção dos tecidos de controle apropriado e multiplexação usando linfoma FFPE tecidos, com uma eventual análise das lâminas coradas usando uma varredura automatizada de imagem patologia quantitativa sistema.
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Protocol
Todos os tecidos utilizados neste protocolo foram obtidos sob o B Singapore NHG domínio específico Review Board estudar 00693/2014.
1. seleção e validação de anticorpos
Nota: Antes de prosseguir com a criação de qualquer painel multiplexada, certifique-se que todos os anticorpos mancham robustamente, identificando apenas o antígeno alvo de interesse. O objectivo é seleccionar os anticorpos que reconhecem especificamente o antígeno de interesse em secções de tecido.
- Para um anticorpo com uma pesquisa bem estabelecida uso, ou uso clínico rotineiro em IHC, confirmar condições tais como diluição de recuperação e anticorpo epítopo realizando convencional IHC5,13 no tecido de controlo positivo e negativo seções. Para seções de tecidos de origem humana, certifique-se de que as autorizações de ética adequado estão no lugar antes de iniciar os experimentos.
Nota: Controlos positivos são os tecidos que são esperados para expressar o antígeno de interesse e controles negativos são aqueles que não. Tecido benigno da amígdala é escolhido como um controle bom tecido para antígenos de linfoma, porque ele contém uma mistura de células imunes, incluindo as células B, células T e células apresentadoras de antígeno, bem como células estromais e epiteliais. O último serve como controles internos negativos úteis. - Para destinos desconhecidos ou anticorpos comerciais com insuficientes dados publicados, executar a validação de anticorpo criando positivo correspondente e célula de controlo negativo FFPE blocos14, usando CRISPR nocaute ou siRNA knock-down do antígeno de interesse em uma linha de célula apropriada através de técnicas padrão de biologia molecular. Use estes blocos de célula FFPE substituem os tecidos de controlo positivo e negativo para IHC convencional como por etapa 1.1.
Nota: As células HeLa ou 293T são comumente usadas para antígenos que não são o tipo de células específicas, como linhas de células do linfoma são difíceis de transfect. Para os antígenos que são específicos de linfócitos, linhas de células de linfoma podem ser usadas com transdução viral ou eletroporação como o modo de entrega do gene (com baixa eficácia).
2. planejamento da sequência de anticorpos e Fluorophores para painel Multiplex
- Planeje a sequência de reagentes para a coloração final do multiplex. Por exemplo, aqui a sequência para o protocolo multiplex foi inicialmente planejada como primeiro, Bcl-6; em segundo lugar, Bcl-2; em terceiro lugar, C-Myc; quarta, CD20; quinto, Ki67.
Nota: Para decidir sobre a sequência, anticorpos com uma fraca afinidade que exigem altas concentrações devem ser manchados primeiro da coloração final, multiplex. Anticorpos de alta afinidade que são susceptíveis de ser resistente a várias rodadas de descascamento de microondas são aplicados última no protocolo multiplex para evitar coloração não específica. - Planeje o parceiro de fluoróforo para cada anticorpo no painel. Consulte a tabela 1 e Tabela de materiais para as escolhas neste exemplo.
Nota: Para decidir sobre o parceiro de fluoróforo para cada anticorpo, escolha fluorophores espectralmente distintas para anticorpos com padrões semelhantes de localização dentro da célula e tecido. Isto irá minimizar a sobreposição espectral e dificuldade de desagregação.
3. Monoplex Tyramide baseados em caso de um painel Multiplex 5-plex simulado
Nota: Neste exemplo, o protocolo para CD20 é discutido, que está previsto que o anticorpo quarto em uma sequência multiplex descrito acima. O número de etapas de descascamento adicionais serão diferentes para a posição do anticorpo na sequência.
- Seções de corte 3 µm-fino de tecido de controlo positivo e negativo, usando um micrótomo e colocar as seções sobre lâminas de vidro de microscópio poli-L-lisina-revestido.
- Dewax as seções usando uma solução de limpeza apropriada 3 x por 4 min cada. Hidratar os slides em 100% de álcool, álcool de 90% e 70% de álcool, 4 min cada. Colocar as lâminas em água destilada por 2-3 min.
- Coloque os slides em uma jarra de vidro de microondas em um buffer de recuperação padrão do antígeno (comercialmente disponível) para imergir os slides. Execute recuperação de epítopo induzida por calor (HIER) usando um microondas adequado, na solução de recuperação de antígeno pH9 a 98 ° C por 25 min.
Nota: Podem ser usada qualquer microondas com uma pressão variando de 800-1.100 Watts, e HIER pode ser otimizado em conformidade. Neste caso, um processador de tecido de microondas multifuncional (aberto ao ar) foi usado para HIER e descascamento. As configurações iniciais para a recuperação de um resumo particular baseiam-se o conhecimento prévio de IHC convencional. - Realize rodadas adicionais de microondas stripping (três neste caso, para o quarto anticorpo em um painel), cada rodada com 100% de energia a 98 ° C e 20% de energia por 10 min manter a mesma temperatura. Arrefecer as lâminas em água destilada pelo menos 10 min.
Nota: Realize várias rodadas de microondas stripping durante a etapa de se monoplex para expor o antígeno alvo para o mesmo número de passos como proposta multiplex de aquecimento. Desde que o CD20 é planejado como o anticorpo quarto, microondas descascamento 3x antes e uma vez depois de fazer a incubação do anticorpo primário. - Verifique e ateste o buffer depois de cada 5 min durante microondas adicionais de descascamento. Importante, não deixe slides secar durante os vários procedimentos de descascamento. Quando se toma os slides no micro-ondas, use pinças e luvas resistente ao calor para colocá-los em uma jarra de água destilada. Espere a solução de recuperação de antígeno esfriar naturalmente.
- Bloco da peroxidase de tecido usando um bloco comercial peroxidase para 10 min (3% de peróxido de hidrogênio pode ser usado como um reagente alternativo). Lavagem com solução salina tampão Tris (TBS) e um detergente não iônico por 5 min.
Nota: TBS é composto de 50 mM Tris-Cl, pH 7,5 e 150 mM NaCl.TBS tornar TBS-D. - Bloco com diluente de anticorpo ou albumina de soro bovino por 15 min, seguido de incubação com o anticorpo primário de interesse (por exemplo, CD20, 1:2,000 diluição em diluente de anticorpo, consulte Tabela de materiais) em temperatura ambiente por 30 min. lavar 3x com TBS-D buffer para 5 minutos de cada vez. Deve haver suficiente buffer de TBS-D para imergir o slide completamente em todas as etapas de lavagem.
Nota: Albumina de soro bovino pode ser usada como um anticorpo alternativo diluente. O volume de diluente de anticorpo depende do tamanho do tecido, que variam de 50 µ l (para amostras de biópsia) a 400 µ l (para amostras de excisão ou amostras de tecido do microarray). - Incube com uma peroxidase de rábano apropriado (HRP)-anticorpo secundário rotulado, escolhido com base na espécie de origem do anticorpo primário durante 15 minutos à temperatura ambiente. Lave 3x com tampão TBS-D por 5 min cada vez.
- Aplicar um apropriado com base em tyramide fluorescente reagente (1: 100 em diluente de amplificação) e incubar a temperatura ambiente por 5 min, para permitir que o fluoróforo conjugação para a amostra de tecido dos locais de ligação do anticorpo primário. Lave 3x com tampão TBS-D por 5 min cada vez.
- Execute um adicional baseada em microondas decapagem para remover o anticorpo primário e secundário. Repita conforme necessário com base na posição do anticorpo na sequência.
- Coloque o slide em água destilada até que arrefeça. Incube com DAPI (diluição de 1: 100 em diluente de anticorpo) por 10 min, seguido de lavagem 3x com tampão TBS-D por 5 min cada tempo. Secar a área do slide sem o tecido com toalhetes e montar o slide com mídia de montagem apropriado.
- Slide de imagem (ver seções 6 e 7 do presente protocolo) e determinar a adequação da coloração (conforme definido pela clara discriminação do tecido controle positivo e negativo).
Nota: Se o padrão de coloração é incorreto, refazer o monoplex coloração após o ajuste de um ou mais dos seguintes parâmetros: o número de recuperação de calor de passos, a quantidade de recuperação de calor, a período de incubação/concentração de anticorpos (primário e secundário), a posição do anticorpo em sequência e a escolha do fluoróforo. O monoplex passo a coloração tipicamente requer várias rodadas de otimização para obter um adequado conjunto de parâmetros para a coloração adequada. É aconselhável testar uma gama de fluorophores com cada anticorpo primário, como isso irá fornecer flexibilidade para decidir o conjunto final de multiplex.
4. repetição do Monoplex para cada anticorpo no protocolo Multiplex
- Repita o monoplex mancha para os outros anticorpos de forma semelhante, ajustando o número de etapas, com base na posição do anticorpo na sequência de descascamento de microondas. Por exemplo, ao executar monoplex mancha para o terceiro anticorpo em um painel de seis-plex multiplex, execute duas etapas de descascamento de microondas antes e três passos de descascamento de microondas após a incubação do anticorpo primário.
Nota: É importante apreciar que despojamento baseado em microondas de anticorpos também expõe a amostra HIER. Se um anticorpo específico requer uma estratégia de recuperação do epítopo diferente, isso precisa ser tidos em conta ao planejar a sequência multiplex. Neste exemplo, o Ki67 epítopo recuperação requer pH 9, por 30 min. Desde 25 min de HIER será feito antes de KI67 coloração no protocolo sequencial, apenas um extra 5 min de HIER são necessários.
5. multiplex mancha o protocolo
- Corte 3 seções de µm-fino de tecido de controlo positivo e negativo, também como o tecido-alvo de interesse (aqui, FFPE amostras de linfoma), usando um micrótomo e colocar as seções sobre lâminas de vidro de microscópio poli-L-lisina-revestido (ver Tabela de materiais).
Nota: A inclusão dos controles positivos e negativos para cada anticorpo no painel é aconselhável, juntamente com as amostras reais para multiplex. Isto permite uma confirmação de que o protocolo de coloração foi realizado correctamente. - Dewax, executar recuperação epítopo induzida por calor (HIER) e bloquear a atividade de peroxidase de tecidos como os passos do protocolo monoplex 3.3-3.5.
- Incube-se com o primeiro anticorpo primário da sequência multiplex otimizado, como previamente determinado usando a etapa de se monoplex. Neste exemplo, BCL-6, em um 01:30 diluição no anticorpo diluente à temperatura ambiente por 60 min (ver Tabela de materiais), foi o primeiro passo do protocolo multiplex. Lavar com tampão TBS-D por 5 min.
- Incube com um apropriado anticorpo secundário HRP-rotulados com base na espécie do anticorpo primário usado no antes do passo (ver a Tabela de materiais) à temperatura ambiente durante 10 min. Lave com tampão TBS-D por 5 min.
- Aplica o otimizado baseado em tyramide fluorescente reagente (Cy5 neste exemplo, 1: 100 em diluente de amplificação, consulte Tabela de materiais) com incubação à temperatura ambiente por 5 min. Após a incubação, lave com tampão TBS-D por 5 min.
Nota: A escolha do reagente fluorescente baseada em tyramide se baseia o monoplex otimizado se. - Verificar a eficiência de coloração do primeiro anticorpo usando um microscópio apropriado (consulte a Tabela de materiais).
Nota: Interim controlos de imagem pode ser feito com facilidade se a amostra for uma TMA ou um único slide. Se, no entanto, a mancha está sendo executada em vários slides, esta pode ser impraticável, e essa etapa pode ser omitida. - Realize o descascamento de microondas para o segundo anticorpo no protocolo, usando condições otimizadas na etapa monoplex. Em seguida, proceder com a coloração do segundo anticorpo primário (aqui, BCL2) com o anticorpo secundário marcado com HRP e baseada em tyramide reagente fluorescente (520, veja Tabela de materiais). Verificar a eficiência de coloração sob um microscópio fluorescente após a conclusão da segunda rodada de coloração.
- Da mesma forma, repita o procedimento usando a terceira, quarto e quinto anticorpos na sequência (aqui, c-Myc, CD20 e ki67, respectivamente, com fluorophores 570, 540 e 620, respectivamente). Execute verificações de imagens entre cada passo se for possível.
- Adicionar um nuclear corante de contraste (DAPI, diluição de 1: 100 em diluente de anticorpo) por 10 min e, em seguida, lave 2x na TBS-D por 5 minutos cada.
- Monte as lâminas usando um reagente de montagem apropriado.
6. preparação de Slides biblioteca espectral
Nota: Seções 6-8 do presente protocolo são exclusivos para experimentos multiplexados que são criação da imagem usando uma câmera espectral.
- Crie slides de biblioteca (imagens de referência único-mancha) para cada fluoróforo, DAPI e autofluorescência no tecido do mesmo controle, deve ser usado para análise de imagens multiespectrais.
- Seções de corte 2 x 3 µm-fino do tipo de tecido de interesse (aqui, uma amostra de linfoma ou uma tonsila como controle) usando um micrótomo e colocar as seções sobre lâminas de vidro de microscópio poli-L-lisina-revestido.
- Processo de ambos os slides usando o protocolo de monoplex (com descascamento e etapas de lavagem), mas sem adição de anticorpo ou fluoróforo.
- Manchar um slide com DAPI conforme passo 5.9 e deixar um slide inocente (para a geração de espectro de autofluorescência do tecido).
Nota: Os slides monoplex otimizado (com uma tintura de fluorescência único, sem DAPI) podem ser usados como biblioteca espectral slides para gerar espectros de cada tintura de fluorescência.
- Digitalizar estes conjunto de slides usando filtros apropriados e enviá-los para a biblioteca de análise de imagem.
7. spectral Imaging
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Digitalizar slides monoplex
- Escolha os filtros filtros padrão disponível epi-fluorescência (DAPI, FITC, CY3, Texas Red e CY5) apropriados para o fluoróforo independente.
Nota: Os cubos filtro recomendado para fluorophores específicos utilizados neste exemplo são mostrados na tabela 215. - Examine cada marcador em seu canal de fluorescência correspondente para identificar um tempo de exposição adequado para obter um sinal limpo. Concentre-se na componente de tecido que é suposto para ter o sinal mais forte para o marcador.
- Determine um tempo de exposição fixo para cada analito (combinação do anticorpo-fluoróforo), para permitir a comparação de cruz-amostra de intensidade do pixel (embora algumas plataformas comerciais têm estratégias de normalização para explicar as diferenças de exposição).
- Para decidir sobre um tempo de exposição fixo para um determinado canal, use uma configuração de câmera ao vivo para ajustar o tempo de exposição, até que não haja nenhum áreas superexpostas da imagem da câmera ao vivo e repita isto para todos os canais.
- Após a digitalização de slides monoplex, gerar imagens simuladas brightfield (se a função está disponível no software usado) para comparar visualmente com o padrão normal de IHC e para determinar se o padrão de coloração é correto (Figura 1 e Figura 2 de ).
- Escolha os filtros filtros padrão disponível epi-fluorescência (DAPI, FITC, CY3, Texas Red e CY5) apropriados para o fluoróforo independente.
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Digitalização amostras multiplex (TMA slides / amostras múltiplas)
- Configure os parâmetros ópticos conforme descrito para a digitalização de imagens monoplex (etapa 6.1). Em primeiro lugar, ajustar o foco manualmente ou automaticamente (siga as instruções da máquina de digitalização imagem específica). Em segundo lugar, ajuste o tempo de exposição para cada canal fluorescente garantir que todos os núcleos em uma TMA, ou todas as áreas de um slide, serão devidamente expostas.
Nota: A área selecionada para ajustar o tempo de exposição é importante. Os usuários precisam escolher a região de sinal mais forte para cada filtro (isto é, o sinal de Ki67 é mais forte na região centro germinativo da amígdala do que na região centro nongerminal; portanto, os usuários devem usar a região centro germinativo fixado em uma exposição adequada tempo). Os usuários também podem adotar uma função de correção de supersaturação do sistema de imagem, se disponível. - Digitalizar slides TMA sob um modo de digitalização TMA se disponível no sistema da imagem latente, com um algoritmo apropriado autofocus.
- Slides da seção de todo tecido, obter os slides analisados por uma patologista qualificada para selecionar imagens ideais das áreas mais representativas do tumor.
Nota: O protocolo descrito aqui é baseado em um sistema de análise de imagem/microscópio definido (consulte Tabela de materiais). Existem outras máquinas e software de análise de imagem que pode digitalizar e analisar multiplex IHC slides7.
- Configure os parâmetros ópticos conforme descrito para a digitalização de imagens monoplex (etapa 6.1). Em primeiro lugar, ajustar o foco manualmente ou automaticamente (siga as instruções da máquina de digitalização imagem específica). Em segundo lugar, ajuste o tempo de exposição para cada canal fluorescente garantir que todos os núcleos em uma TMA, ou todas as áreas de um slide, serão devidamente expostas.
8. análise de dados
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Preanalysis avaliação e planejamento
- Use o slide de referência para autofluorescência para subtrair autofluorescência das imagens digitalizadas para análise.
- Rever as imagens antes da análise para garantir que eles estão em foco e sem coloração artefatos.
- Use um marcador tumoral (por exemplo, CD20 neste exemplo) para identificar as células de interesse, e prosseguir com a segmentação da célula, marcando e análise de lote se aproxima. Selecione células CD20 positivo para a análise.
Nota: por exemplo, no DLBCL amostras analisadas aqui, a configuração e parâmetros que são definidos para segmentação de célula baseiam-se nuclear tamanho e intensidade, mas são específicos para o software de análise de imagem usado (por exemplo, uma DAPI significa intensidade de pixel de em pelo menos 0,05; tamanho entre 80-320 pixels, com uma sensibilidade de dor em 2 [este é um parâmetro de específicas do software que confia pesadamente sobre a morfologia do tumor: para as células do tumor pequeno, divisão de 0,7 - 1 é apropriado; para as células do tumor grande, dividindo pode ser ajustado acima para 4]). - Pedido de patologista qualificado rever imagens individuais e decidir se a segmentação do tecido é necessária para selecionar célula de tumor enriquecido e excluir regiões com necrose arearegion orand abundante reativa as células. Se segmentação de tecido adicional é necessária, selecione as regiões de controle apropriado (como células de tumor/estroma/necrose) e verificar que o software de análise de imagem pode identificar corretamente tais regiões
- Prosseguir com a segmentação da célula após a segmentação do tecido (se houver), pedido uma patologista qualificada para rever o mapa de segmentação celular para garantir a fidelidade da segmentação pretendida abordagem5.
- Determine o mais biologicamente/clinicamente apropriado método de análise para um determinado biomarcador de interesse (por exemplo, percentagem de positividade ou média intensidade por célula).
- Selecione um valor de corte para cada marcador (para porcentagem de positividade).
- Determine o valor de corte positiva de intensidade óptica para cada marcador em conjunto com uma patologista. Gerar histogramas, analisando a distribuição de frequência da intensidade/célula marcador no software de estatísticas apropriadas (veja a Tabela de materiais).
Nota: Um histograma de valor de intensidade pode oferecer uma visão geral da distribuição das intensidades do sinal. - Determinar um limite aproximado de histograma e verificar isso com uma revisão do patologista, correlacionar com manualmente determinados cortes nas imagens selecionadas. Em algumas situações, um corte único uniforme não será possível devido à variabilidade da coloração, e um valor de corte manual para cada amostra será necessário.
Nota: A seção 8.1 deve ser feito em software de análise de imagem (consulte a Tabela de materiais) a menos que especificado de outra forma.
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Marcação de células positivas e negativas
- Para cada marcador de interesse, de acordo com o número de corte determinado (por meio de histogramas ou manualmente), uso um "se", ou fórmula de lógica semelhante para marcar células positivas e negativas com marcado valor: número 1 para células positivas, de número 0 para células negativas.
- Para a positividade de todos os marcadores, multiplique o valor marcado de cada marcador (1 ou 0) com os produtos em colunas separadas. Se o produto é igual a 1, significa que a célula é positiva para todos os marcadores. Para a positividade e a negatividade de um marcador específico, use um algoritmo de lógica se.
Nota: A seção 8.2 precisa ser feito no software de estatísticas (ver Tabela de materiais).
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Gerando dados percentuais e dados numéricos usando uma tabela dinâmica
- Gerar dados de porcentagem para marcadores específicos de interesse, dentro de células definidas (por exemplo, células CD20 positivo ou células CD20 negativo) (Figura 6).
- Inserir uma tabela dinâmica em folha de dados.
- Para calcular o percentual de positividade de um único marcador, como CD20, selecione a função soma sob a parte do valor da tabela dinâmica para contar o número total de células CD20 positivo usando a soma do CD20+ células dividido pela número total de células. O resultado é o CD20+ célula porcentagem dentro de um núcleo ou um estudo número (varia de acordo com a seleção da linha de tabela dinâmica).
- Calcular a percentagem de positividade de marcadores múltiplos usando o mesmo método (Figura 3).
- Gere dados numéricos. Extrair a contagem mediana normalizada para cada marcador de cada núcleo ou cada número de estudo, obtendo a intensidade média de cada marcador de interesse em todas as células estudadas dentro de uma amostra (Figura 4).
Nota: O valor mediano não pode ser derivado em tabela dinâmica diretamente. Pode ser derivada usando esta fórmula: mediana (IF (coluna de número de estudo = número de estudo específico, a coluna de valor normalizado)).
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Plotar os dados em um gráfico apropriado
- Plotar os resultados do percentual de positividade ou intensidade mediana por marcador em um tipo de célula de interesse de forma adequada para novos testes estatísticos e apresentação.
- Crie lotes do ponto para fornecer uma visualização dos números e distribuição.
Nota: Representar dados com gráficos de barras não transmite informação sobre distribuição. Também são recomendadas como um bom método para representação de dados, com ênfase sobre a magnitude da diferença entre amostras16parcelas de estimativa.
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Representative Results
MF-IHC imagens para uma amostra DLBCL com C-MYC e rearranjo de gene BCL2 (dobro-bata linfoma) são mostradas na Figura 1. A Figura 2 ilustra as imagens simulada brilhante-campo imuno-histoquímica. Figura 3 indica a geração de dados de porcentagem. Figura 4 exibe os detalhes de uma fórmula mediano para a geração de dados numéricos. A Figura 5 mostra o aplicativo da mf-IHC, de um painel de células T em linfomas de células T angioimmunoblastic. A Figura 6 mostra a imagem de otimização da tonsila amostra controle e a análise de dados para esta amostra.
Figura 1: células B multiplexagem imagens de painel de imunofluorescência para uma amostra grande de células B linfoma (DLBCL), difusa, com rearranjo de gene C-MYC e CL2 (dobro-bata linfoma). Magenta = CD20 (membrana); branco = BCL2 (citoplasma); amarelo = Ki67 (nuclear); verde = C-MYC (nuclear); vermelho = BCL6 (nuclear), azul = DAPI (corante de contraste nuclear). As células do tumor CD20 positivo mostram uma alta expressão de C-MYC (80%) e BCL2 (> 90%), e o índice de proliferação de Ki67 também é alto (90%). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: simulada brilhante-campo immunohistochemical imagens (geradas a partir da Figura 1) da mesma amostra DLBCL com rearranjo de gene C-MYC e BCL2 (dobro-bata linfoma). CD20 mostra membrana mancha nas células do tumor. BCL2 mostra citoplasma coloração em > 90% das células de tumor. Positividade do C-MYC é cerca de 80%. BCL6 mostra nuclear de coloração em aproximadamente 20% das células. Ki67 é positivo em 90% das células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: tabela dinâmica, mostrando como gerar dados de porcentagem de acordo com o estudo número. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: fórmula de mediana para o valor de OD Ki67 normalizado de acordo com o estudo número. A instrução se encontra todos os números de estudo que são iguais a um número específico de estudo (que é 52 nesta figura). Em seguida, ele retorna o valor correspondente de Ki67 normalizado . Ctrl + Shift + Enter chave combinações podem ser usadas para calcular a mediana (Mediana de Ki67) para estes valores retornados, que é 11.56 para estudo número 52. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: multiplexado imagens de painel de imunofluorescência para obter um exemplo de linfoma (AITL) angioimmunoblastic células T. (A), a imagem composta mostra a heterogeneidade celular de uma amostra AITL. Magenta = CD20 (membrana); amarelo = CD4 (membrana); verde = PD1 (membrana); vermelho = BCL6 (nuclear); ciano = CD8 (membrana); azul = DAPI (corante de contraste nuclear). (B) a linha superior de imagens mostra uma visão ampliada da região selecionada na caixa branca no painel A. A linha inferior de imagens mostra o correspondente segmentado máscaras de célula: amarelo/vermelho/verde mostrando única células CD4/BCL6/PD1-positivo, respectivamente. Azul representa células negativas, e branco indica células duplo-positivo. As imagens revelam que 50% de CD4+ células são PD1+ (à esquerda, branco), enquanto 20% de CD4+ células também são positivas para BCL6 (médio, branco). A taxa de positividade duplo para PD1 e BCL6 é cerca de 10% (direito, branco). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: multiplexado imagens de otimização de imunofluorescência para tecido de controle tonsila. (A), a imagem composta mostra a área do centro germinativo de uma amostra de controle da amígdala. Amarelo = C-Myc (nuclear); vermelho = BCL6 (nuclear); ciano = BCL2 (citoplasma); magenta = CD20 (membrana); verde = Ki67 (nuclear); azul = DAPI (corante de contraste nuclear). C-Myc é positivo apenas em algumas células. BCL6 e Ki67 são positivos, principalmente no centro germinativo, enquanto BCL2 é positivo, principalmente fora do centro germinativo. CD20 é difusamente positivo dentro e fora de centro germinativo. (B) a tabela mostra que as células do centro germinativo CD20 positivo também são positivas para BCL6 e Ki67 mas negativo para BCL2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Sequência de anticorpos | Anticorpo primário (veja a tabela de materiais) | HIER total necessária | Mancha real pre HIER | Anticorpo secundário | Fluoróforo | Post-TSA anticorpo descascamento |
| 1 | Mouse anti-Bcl6 (01:30, 60 min RT) | 25minutes, Ph9 | 25minutes, Ph9 | 1: 1000 anti-rato, conjugados a HRP' para 10' | OPALA Cy5 em 1: 100 | 1 rodada 100% poder 1min, potência de 20% por 10min |
| 2 | Mouse anti-Bcl2(1:50,60 min RT) | 25minutes, Ph9 | Nenhum | 1: 1000 anti-rato, conjugados a HRP' para 10' | OPALA 520 em 1: 100 | 1 rodada 100% poder 1min, potência de 20% por 10min |
| 3 | Coelho anti-c-MYC(1:50,30 min RT) | 25minutes, Ph9 | Nenhum | HRP-conjugado anticoelho, 1: 1000 ' para 10' | OPALA 570 em 1: 100 | 1 rodada 100% poder 1min, potência de 20% por 10min |
| 4 | Mouse anti-CD20(1:2000,30 min RT) | 25minutes, Ph9 | Nenhum | 1: 1000 anti-rato, conjugados a HRP' para 10' | OPALA 540 em 1: 100 | 1 rodada 100% poder 1min, potência de 20% por 10min |
| 5 | Mouse anti-Ki-67(1:50,45 min RT) | 30 minutos, Ph9 | 5 minutos pH9 | 1: 1000 anti-rato, conjugados a HRP' para 10' | OPALA 620 em 1: 100 | 1 rodada 100% poder 1min, potência de 20% por 10min |
Tabela 1: exemplo de um layout finalizado para multiplex se manchando. Esta tabela fornece um exemplo de como especificar a quantidade de HIER e baseado em microondas descascamento para ser feito a cada passo, uma vez que as manchas monoplex foram otimizadas.
Tabela 2: guia para a seleção de filtro para fluorophores. Esta tabela fornece uma guia áspera para filtros apropriados que podem ser usados no equipamento especificado, Visualizar fluorophores de interesse. É aconselhável verificar as especificações de filtro do microscópio sendo utilizada para o perfil de excitação/emissão dos fluorophores usado.
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Discussion
MF-IHC tem o potencial para permitir que os patologistas para refinar diagnosticcriteria em patologia linfoide e analisar o papel dos biomarcadores em tipos de células específicas em direção a uma previsão de resultados clínicos. Como um novo método de investigação, mf-IHC é cada vez mais aplicado à identificação de vários parâmetros imunes de células de tumor17quantitativa e espacial. A detecção de mf-IHC para a expressão co de biomarcadores de tumor mostrou ser confiável e reprodutível5. No entanto, a tecnologia permanece nascente e submetidas a variabilidade decorrentes de reagente e / ou fatores relacionados a tecidos, tais como aqueles devido à inconsistência na fixação de tecidos e processamento.
Fundamental para a técnica é o uso de anticorpos bem validados específicos, sensíveis e dar resultados reprodutíveis. Há exemplos na literatura de anticorpos originalmente descrita para ser mais específico para seus antígenos e mais tarde demonstrou reconhecer proteínas não relacionadas com o uso de modelos de mata-mata14. O método de validação nocaute / knock-down, em que o selvagem-tipo ou células com antígenos Blumental servir como controles positivos, enquanto as células com os alvos nocauteado ou derrubado por siRNA ou CRISPR métodos são usadas como controles negativos.
Como o IHC convencional, mf-IHC tem muitas variáveis críticas que precisam ser otimizados para cada experimento, para coloração ideal e resultados. Estes incluem o pH da solução de recuperação de antígeno, a diluição de anticorpo, a atribuição de um fluoróforo para cada marcador e a concentração do fluoróforo. As soluções de recuperação de antígeno comumente usados são de pH 6 e 9. Vale a pena testar qual pH dá o padrão de coloração ideal e a intensidade com menos fundo.
Há não há orientações específicas para decidir sobre a sequência de aplicação de anticorpo no experimento multiplex como depende não só a afinidade do anticorpo, mas também na força o fluorophores opal. Em geral, anticorpos com uma afinidade fraca muitas vezes exigem altas concentrações baseadas a coloração monoplex e são aplicados primeiro na sequência multiplex. Anticorpos de afinidade forte que são susceptíveis de ser resistente ao descascamento são aplicados por último, para evitar coloração não específica. No que diz respeito a escolha de um fluoróforo específico, é preferível evitar usar fluorophores com comprimentos de onda espectrais similares para os antígenos que colocalize nos mesmos compartimentos celulares. Antígenos com níveis baixos de expressão são atribuídos com fluorophores mais brilhantes e vice-versa. Se, no exemplo de estudo, a intensidade do sinal é fraca, ajustando a diluição de TSA de opala pode ser feito para alcançar o desejado sinal18. Em alguns casos, experimentar métodos de recuperação de antígeno diferente ou aumentando a concentração do anticorpo primário pode funcionar. A diluição inicial do anticorpo primário pode ser a mesma que estabeleceu-se em um experimento IHC convencional. No entanto, se o sinal de IF não é claro, de ensaios de outras diluições de anticorpo será necessária, como as condições otimizadas para IHC não sempre se traduzem em se. Intensidade do sinal é afetada pela ordem ou sequência de imunocoloração. Alguns resumos são superexpostos após duas ou três rodadas de MWT, enquanto alguns podem degradar devido ao excesso MWT. Certos fluorophores também pode ser afetada pela MWT e precisa ser testado para atenuação.
Este protocolo incide sobre o colocalization e medição da intensidade de marcadores dentro de subconjuntos de células em um linfoma maligno de células B. Os desafios-chave no desenvolvimento do protocolo atual envolvem a geração de um painel multiplex otimizado para antígenos que colocalize nos mesmos compartimentos celulares. É preciso haver uma desagregação precisos de fluorophores para quantificação exacta. Uma vez que o painel multiplex está no lugar, imagem latente das corrediças manchadas é relativamente simples. O próximo obstáculo envolve a análise dos dados de imagem. Ao contrário de em estudos de infiltração imune, onde a quantificação de tipos de células imunes específicas dentro de um tipo de tumor epitelial é simples, estudos colocalization em linfoma dependem muito da definição de positividade por um patologista treinado para cada marcador de interesse. Derivação em um corte diagnóstico apropriado, que pode ser aplicada a prática clínica de rotina continua a ser um trabalho em andamento. Mais refinamentos em métodos de normalização de dados e a triangulação de corte automatizado será necessários antes que esta técnica pode ser integrada em diagnóstico rotineiro.
Apesar das limitações atuais, as aplicações potenciais da mf-IHC e o conhecimento que pode ser inferido a partir do estudo das células do tumor e sua relação espacial com o microambiente torná-lo uma ferramenta atraente, especialmente para desafiar histológica cânceres como malignidade linfoide. Mais trabalho é necessário estabelecer protocolos na fixação de tecidos e processamento de tecido que são ideais para o fluxo de trabalho proposto, bem como uma melhoria na coloração de técnicas, para permitir a análise simultânea de um maior número de alvos.
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Disclosures
A.D.J. recebeu financiamento da PerkinElmer para viagens para reuniões de grupos de usuários. Os autores não têm nenhum outro conflito de interesse de divulgar.
Acknowledgments
S.-B.N. e A.D.J. são suportados pelo Medical Research Conselho transição prêmios do Ministério da saúde a Singapore nacionais (NMRC/TA/0020/2013 e NMRC/TA/0052/2016). Os autores reconhecem uma bolsa de investigação de Yoon Siew Yong para A.D.J. partir da Universidade Nacional Cancer Institute de Cingapura para a compra de um microscópio de imagem espectral de Vectra. Este estudo é aprovado pela B Singapore NHG domínio específico Review Board (2014/00693).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
References
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