Summary
Her beskriver vi en protokol for multiplex fluorescerende immunhistokemisk farvning og imaging for simultan lokalisering af flere kræft-associerede antigener i lymfom. Denne protokol kan udvides til en colocalization analyse af biomarkører inden for alle væv sektioner.
Abstract
Immunhistokemiske (IHC) metoder til in situ analyse af protein udtryk ved lysmikroskopi er et kraftfuldt værktøj til både forskning og diagnostiske formål. Men, visualisering og kvantificering af flere antigener i en enkelt væv afsnit ved hjælp af konventionelle kromogent IHC er udfordrende. Multiplex imaging er især relevant i lymfom forskning og diagnosticering, hvor markører skal fortolkes i forbindelse med en kompleks tumor mikromiljø. Her beskriver vi en protokol for multipleksede fluorescerende IHC farvning for at aktivere den kvantitative vurdering af flere mål i specifikke celletyper interesse for lymfom. Metoden dækker aspekter af antistof validering, antistof optimering, multiplex optimering med markører af lymfom undertyper, farvning af væv microarray (TMA) dias, og scanning af dias, efterfulgt af dataanalyse med specifikke henvisning til lymfom. Brug denne metode, genereres noder for begge betyde intensiteten af en markør for interesse og procentdel positivitet for at lette yderligere kvantitative analyser. Multiplexing minimerer prøve udnyttelse og giver geografisk information for hver markør af interesse.
Introduction
Lymfoide neoplasmer er forårsaget af ukontrolleret maligne spredning af lymfocytter. Disse celler er vigtige komponenter i immunsystemet og lokalisere til de primære og sekundære immun organer, såsom knoglemarven, lymfeknuder, milt og andre slimhinde-associerede lymfoide system. Lymfoide neoplasmer er en heterogen gruppe af sygdomme, der er klassificeret baseret på en konstellation af funktioner, herunder morfologi, immunophenotype, genetiske egenskaber og klinisk præsentation. Mens hver parameter spiller en rolle, lineage er fortsat et afgørende træk og danner grundlag for WHO-klassifikationssystem, som anerkender neoplasmer afledt af B-celler, T-celler og natural killer (NK) celler1.
Nøglen til klassificering af lymfom har været karakterisering af antistoffer mod leukocyt overflade markører af lymfocytter2forskellige undertyper. Immunhistokemi (IHC) har traditionelt været brugt til analyse af sådanne mærker og er baseret på princippet om den specifikke antigen-antistof anerkendelse at opdage celle - og tissue-baserede molekyler, der kan visualiseres gennem lysmikroskop 3. identifikation af flere mål på et enkelt dias af konventionelle lysfelt kromogent multiplex IHC har imidlertid begrænsninger fordi det er ofte vanskeligt at skelne mellem flere farve signaler på en enkelt væv sektion pålideligt — især for antigener med en meget lav udtryk4. Visuel bedømmelse og kvantificering af farvning kan også være subjektiv, forårsager variabilitet i den analyse og data fortolkning5.
Konventionelle IHC på formalin-fast, paraffin-embedded (FFPE) prøver er derfor ikke muligt for samtidige påvisning af flere mål i immunologisk forskellige sygdomme som lymfom. Desuden er skelne neoplastiske lymfocytter fra de omkringliggende immunceller ofte upræcise. Dette hindrer undersøgelser, der ser på relevansen af roman biomarkører i lymfom. I denne sammenhæng, multiplex fluorescerende IHC (mf-IHC) tilbyder en lovende alternativ, da det giver mulighed for den kvantitative vurdering af antigen coexpression og et rumlige forhold med højere præcision samtidig bevare begrænset prøver6,7. Når denne imaging-teknologi er indgået et samarbejde med digital billed analyse software, data fortolkning er gjort mere effektivt og letter undersøgelsen af tumor og mikromiljø heterogenitet8,9. I denne protokol, en tyramide-baseret immunofluorescens (IF) multiplexing metode anvendes for at forstærke signalet og er kompatibel med enhver IHC-valideret antistof fra enhver vært arter, selv dem, der udvikles i de samme arter5,7 , 10. tyramide-baseret protokol giver mulighed for den direkte konjugering af fluorophore til væv af interesse, således at den primære og sekundære antistof kan fjernes efter hvert trin, giver mulighed for en fortløbende anvendelse af flere pletter uden antistof krydsreaktivitet.
En multiplex strategi vil være nyttige til at forudsige resultater prognose og behandling ved at identificere mål og deres variant immunologiske mønstre i lymfomer. Multiplex fluorescerende IHC er blevet anvendt i vores laboratorium for undersøgelse af et panel af T og B-lymfocytter markører og T-follikulært helper markører i angioimmunoblastic T-celle lymfom (AITL), en undertype af en perifert T-celle lymfom karakteriseret ved aggressiv kliniske adfærd og tumor heterogenitet11. Nytten af denne metode illustreres også i diffus store B-celle lymfom (DLBCL) hvor den øget signalering af en B-celle receptoren med samtidige C-MYC og BCL-2 udtryk tyder på potentiel terapeutisk brug af Brutons tyrosin kinase hæmning 12 .
Beskriver her vi den hele protokol fra antistof validering til udvælgelsen af passende kontrol væv og multiplexing ved hjælp af lymfom FFPE væv, med en eventuel analyse af bejdset dias ved hjælp af en scanning automatiseret kvantitative patologi imaging system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt væv i denne protokol blev opnået under Singapore NHG domæne specifikke Review Board B studere 2014/00693.
1. udvælgelse og validering af antistoffer
Bemærk: Før du går videre med oprettelsen af enhver multipleksede panel, sørge for at alle antistoffer plette håndfast, at identificere kun målet antigenet af interesse. Formålet er at vælge antistoffer, der specifikt anerkende antigen af interesse i væv sektioner.
- For et antistof med en veletableret forskning anvendelse eller rutinemæssig klinisk anvendelse i IHC, bekræfte forhold såsom epitop hentning og antistof fortynding ved at udføre konventionelle IHC5,13 på positive og negative kontroller væv sektioner. Væv sektioner af menneskelig oprindelse, sikre at passende etik frirum er på plads inden indledningen eksperimenter.
Bemærk: Positive kontroller er væv, der forventes at udtrykke antigen af interesse, og negative kontroller er dem, der ikke gør. Godartede tonsil væv er valgt som en god væv kontrol for lymfom antigener, fordi den indeholder en blanding af immunceller, herunder B-celler, T-celler og antigen-præsenterer celler samt stromale og epitel celler. Sidstnævnte fungere som nyttige negative interne kontroller. - Ukendt mål eller kommercielle antistoffer med utilstrækkelig offentliggjorte data, udføre antistof validering ved oprettelse matchede positiv og negativ kontrol FFPE celle blokerer14, ved hjælp af CRISPR knock-out eller siRNA knock-down af antigen af interesse i en passende cellelinje gennem standard molekylærbiologiske teknikker. Brug disse FFPE celle blokke i stedet for positive og negative kontroller væv for konventionelle IHC pr. trin 1.1.
Bemærk: HeLa eller 293T celler er almindeligt anvendt til antigener, der ikke er celletype specifikke, som lymfom cellelinjer er vanskelige at transfect. For antigener, der er lymfocyt specifikke, kan lymfom cellelinjer blive anvendt med viral transduktion eller elektroporation som gen leveringsmåde (omend med lav effekt).
2. planlægning sekvens af antistoffer og Fluorophores for panelet Multiplex
- Planlægge rækkefølgen af reagenser for den endelige multiplex farvning. For eksempel, var her sekvensen for multiplex-protokollen oprindeligt planlagt som første, Bcl-6; andet, Bcl-2; tredje, C-Myc; fjerde, CD20; femte, Ki67.
Bemærk: For at bestemme rækkefølge, antistoffer med en svag affinitet, der kræver højere koncentrationer skal farves først i den endelige multiplex farvning. Høj-affinitet antistoffer, der er tilbøjelige til at blive resistente over for flere runder af mikrobølgeovn stripping anvendes sidst i multiplex-protokollen til at undgå uspecifik farvning. - Planlægge fluorophore partneren for hver antistof i panelet. Se tabel 1 og Tabel af materialer for valg i dette eksempel.
Bemærk: For at afgøre, om fluorophore partneren for hver antistof, vælge spektralt særskilte fluorophores for antistoffer med lignende mønstre af lokalisering inden for cellen og væv. Dette vil minimere spektrale overlapning og problemer med urtåge.
3. Monoplex Tyramide-baseret hvis i en simuleret 5-plex Multiplex Panel
Bemærk: I dette eksempel protokol for CD20 diskuteres, der er planlagt som den fjerde antistof i en multiplex sekvens beskrevet ovenfor. Antallet af yderligere stripping trin vil afvige for placeringen af antistoffet i sekvensen.
- Skær 3 µm-tynde sektioner af positive og negative kontroller væv ved hjælp af en mikrotom og placere sektionerne på poly-L-lysin-belagt glas objektglas.
- Afvoksning sektioner ved hjælp af en passende clearing løsning 3 x i 4 min. Rehydrere dias i 100% alkohol alkohol, 90% og 70% alkohol, 4 min. Sæt dias i destilleret vand i 2-3 min.
- Sted dias i en mikrobølgeovn-safe glaskrukke i en standardantigenet hentning buffer (kommercielt tilgængelige) for at fordybe dias. Udføre varme-induceret epitop hentning (HIER) ved hjælp af en egnet mikrobølgeovn, i pH9 antigen hentning løsning på 98 ° C i 25 min.
Bemærk: Enhver mikrobølgeovn med et tryk, der spænder fra 800-1.100 watt kan bruges, og HIER kan optimeres i overensstemmelse hermed. I dette tilfælde blev en multifunktionel mikrobølgeovn væv processor (åben luft) brugt til HIER og stripping. De oprindelige indstillinger for hentning af en bestemt epitop er baseret på den forudgående viden fra konventionelle IHC. - Udføre yderligere runder med mikrobølgeovn stripping (tre i denne sag, for det fjerde antistof i et panel), hver runde med 100% til 98 ° C og 20% magt i 10 min at opretholde ved samme temperatur. Køle ned dias i destilleret vand i mindst 10 min.
Bemærk: Udføre flere runder af mikrobølgeovn stripping under monoplex hvis skridt til at afsløre målet antigen til det samme antal varme trin i de foreslåede multiplex. Da CD20 er planlagt som den fjerde antistof, mikroovn stripping 3 x før og én gang efter at gøre primære antistof inkubation. - Kontrollere og genopbygge bufferen efter hvert 5 min under yderligere mikrobølgeovn stripping. Vigtigere, lad ikke slides tørre ud under de flere stripping procedurer. Når du tager dias ud af mikrobølgeovnen, bruge pincet og heatproof handsker til at placere dem i en separat krukke med destilleret vand. Afvente antigen hentning løsningen til at afkøle naturligt.
- Blokere væv peroxidase aktivitet ved hjælp af en kommerciel peroxidase blok i 10 min (3% brintoverilte kan bruges som en alternativ reagens). Vask med Tris-bufferet saltvand (TBS) og en nonionisk detergent i 5 min.
Bemærk: TBS er sammensat af 50 mM Tris-Cl, pH 7,5 og 150 mM NaCl.TBS at gøre TBS-D. - Blok med antistof fortyndingsmiddel eller bovint serumalbumin i 15 min. efterfulgt af inkubation med det primære antistof af interesse (f.eks.CD20, 1:2,000 fortynding i antistof fortyndingsmiddel, se Tabel af materialer) ved stuetemperatur i 30 min. vask 3 x med TBS-D buffer for 5 min hver gang. Der bør være tilstrækkelig TBS-D buffer at fordybe slide helt i alle vaske trin.
Bemærk: Bovint serumalbumin kan bruges som en alternativ antistof fortyndingsmiddel. Mængden af antistof fortyndingsmiddel afhænger af størrelsen af det væv, lige fra 50 µL (for biopsi prøver) til 400 µL (for excision prøver eller microarray vævsprøver). - Der inkuberes med en passende peberrodsperoxidase (HRP)-mærket sekundær antistof, udvalgt på baggrund af arterne af oprindelsen af det primære antistof i 15 min. ved stuetemperatur. Vask 3 x med TBS-D buffer for 5 min hver gang.
- Anvend et passende tyramide-baserede fluorescerende reagens (1: 100 i forstærkning fortyndingsmiddel) og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min, for at tillade fluorophore konjugation til vævsprøve på steder af primære antistof bindende. Vask 3 x med TBS-D buffer for 5 min hver gang.
- Udføre en yderligere mikrobølgeovn-baserede stripping for at fjerne de primære og sekundære antistof. Gentag som nødvendigt baseret på placeringen af antistoffet i sekvensen.
- Sted det dias i destilleret vand til at køle ned. Der inkuberes med DAPI (1: 100 fortynding i antistof fortyndingsmiddel) i 10 min, efterfulgt af vask 3 x med TBS-D buffer for 5 min hver gang. Tør området på diaset uden væv med klude og mount diaset med passende montering medier.
- Billede diaset (Se afsnit 6 og 7 i denne protokol) og afgøre rimeligheden af farvning (som defineret af tydelige forskelsbehandling af positive og negative kontroller væv).
Bemærk: Hvis det farvning mønster er forkert, redo monoplex farvning efter justering af en eller flere af følgende parametre: antallet af varme hentning skridt, mængden af varme hentning, inkubation periode/koncentrationen af antistoffer (primær og sekundær), placeringen af antistof i sekvensen, og valget af fluorophore. Monoplex farvning trin typisk kræver flere runder af optimering til at opnå et passende sæt af parametre for passende farvning. Det er tilrådeligt at teste en række fluorophores med hver primære antistof, da dette vil give fleksibilitet til at beslutte den endelige multiplex sæt.
4. gentagelse af Monoplex for hver antistof i Multiplex-protokollen
- Gentag monoplex farvning for andre antistoffer i en lignende måde ved at justere antallet af mikrobølgeovn stripping trin, baseret på placeringen af antistoffet i sekvensen. For eksempel, når du udfører monoplex farvning for tredje-antistof i en seks-plex multiplex panel, udføre to mikrobølgeovn stripping trin før og tre mikrobølgeovn stripping trin efter den primære antistof inkubation.
Bemærk: Det er vigtigt at forstå at den mikrobølgeovn-baserede stripning af antistoffer også udsætter prøven til HIER. Hvis en bestemt antistof kræver en anderledes epitop hentning strategi, skal dette tages i betragtning, når du planlægger multiplex sekvensen. I dette eksempel kræver Ki67 epitop hentning pH 9, i 30 min. Da 25 min af HIER vil ske forud for KI67 farvning i sekventiel protokol, kun en ekstra 5 min af HIER er nødvendig.
5. multiplex farvning protokol
Bemærk: Fortsætte med multiplex farvning protokol, når alle komponenter er blevet optimeret ved hjælp af monoplex, hvis farvningen. Gennemse resultaterne af monoplex farvning og design en tabel, der viser den endelige udformning af multiplex og valg af fluorophore for hver antistof. Detaljer af antistof koncentration, varighed af farvning, og den sekvens og arten af heat hentning for hver antistof bruges her er fastsat i tabel 1.
- Cut 3 µm-tynde sektioner af positive og negative kontroller væv, såvel som målvæv af interesse (her, FFPE prøver af lymfom), ved hjælp af en mikrotom, og placere sektionerne på poly-L-lysin-belagt glas objektglas (Se Tabel af materialer).
Bemærk: Inddragelse af de positive og negative kontroller for hver antistof i panelet er tilrådeligt, sammen med de faktiske prøver for multiplex. Dette giver mulighed for en bekræftelse på at den farvning protokol blev udført korrekt. - Afvoksning, udføre varme-induceret epitop hentning (HIER), og blokere væv peroxidase aktivitet i monoplex protokol trin 3.3-3.5.
- Inkuber med den første primære antistof af optimeret multiplex sekvensen, som tidligere bestemmes ved hjælp af monoplex hvis trin. I dette eksempel BCL-6, på en 1:30 fortynding i antistof fortyndingsmiddel ved stuetemperatur i 60 min. (Se Tabel af materialer), var det første trin i multiplex-protokollen. Vask med TBS-D buffer i 5 min.
- Inkuber med en passende HRP-mærket sekundær antistof baseret på arten af det primære antistof bruges i forudgående trin (Se Tabel af materialer) ved stuetemperatur i 10 min. Skyl med TBS-D buffer i 5 min.
- Anvende den optimerede tyramide-baserede fluorescerende reagens (Cy5 i dette eksempel, 1: 100 i forstærkning fortyndingsmiddel, se Tabel af materialer) med inkubation ved stuetemperatur i 5 min. Efter inkubation, vask med TBS-D buffer i 5 min.
Bemærk: Valget af de tyramide-baserede fluorescerende reagens er baseret på den optimerede monoplex hvis. - Kontroller effektiviteten af farvning af den første antistof ved hjælp af en passende mikroskop (Se Tabel af materialer).
Bemærk: Foreløbige imaging kontrol kan gøres med lethed, hvis prøven er en TMA eller enkelt dias. Hvis pletten er dog udføres på flere dias, dette kan være upraktisk, og dette trin kan udelades. - Udføre mikrobølgeovn stripning til det andet antistof i den protokol, ved hjælp af betingelser optimeret taktfast monoplex. Derefter, gå videre med farvning af den anden primære antistof (her, BCL2) med HRP-mærket sekundær antistof og tyramide-baserede fluorescerende reagens (her, 520, se Tabel af materialer). Kontroller effektiviteten af farvning under et mikroskop for fluorescerende efter afslutningen af den anden runde af farvning.
- På samme måde, Gentag proceduren ved hjælp af tredje, fjerde og femte antistoffer i sekvensen (her, c-Myc, CD20 og ki67, henholdsvis med fluorophores 570, 540 og 620, henholdsvis). Udføre billeddiagnostiske kontrol i mellem hvert trin, hvis det er muligt.
- Tilføje en nuklear kontrastfarve (DAPI, 1: 100 fortynding i antistof fortynder) i 10 min, og derefter vaske 2 x i TBS-D for hver 5 minutter.
- Montere de forskellige dias ved hjælp af en passende montering reagens.
6. forberedelse af spektrale bibliotek dias
Bemærk: Afsnit 6-8 i denne protokol er unikke for multipleksede eksperimenter, der er afbildet ved hjælp af en spektral kamera.
- Oprette biblioteket dias (single-pletten reference billeder) for hver fluorophore, DAPI og autofluorescence på den samme kontrol væv, der skal bruges til multispektrale billedanalyse.
- Skær 2 x 3 µm-tynde sektioner af typen væv af interesse (her, en lymfom prøve eller en tonsil som kontrol) ved hjælp af en mikrotom og placere sektionerne på poly-L-lysin-belagt glas objektglas.
- Processen både dias ved hjælp af monoplex-protokollen (med alle stripning og vaske trin), men uden antistof eller fluorophore ud.
- Pletten ét dias med DAPI pr. trin 5.9 og forlade ét dias unstained (for generation af væv autofluorescence spektrum).
Bemærk: Optimeret monoplex dias (med en enkelt fluorescens dye, uden DAPI) kan bruges som spektrale bibliotek dias til at generere spektre af hver fluorescens dye.
- Scanne disse sæt dias ved hjælp af passende filtre og uploade dem til biblioteket billede analyse.
7. spektrale Imaging
-
Scanning monoplex dias
- Vælg filtre fra tilgængelige standard epi-fluorescens filtre (DAPI, FITC, CY3, Texas rød og CY5) passende for de erhvervsdrivende fluorophore.
Bemærk: De anbefalede filter kuber til bestemte fluorophores bruges i eksemplet er vist i tabel 215. - Undersøge hver markør i dens tilsvarende fluorescens kanal til at identificere en passende eksponeringstid at opnå en ren signal. Fokusere på komponenten væv, der formodes for at have det stærkeste signal til markør.
- Bestemme en fast eksponeringstid for hver analysand (antistof-fluorophore kombination), at give cross-prøve sammenligning af pixel intensitet (selv om nogle kommercielle platforme har normalisering strategier at tage højde for forskelle i eksponering).
- For at træffe beslutning om en fast eksponeringstid for en given kanal, bruge et levende kameraindstilling for at justere eksponeringstiden indtil der ikke er nogen overeksponerede områder i billedet for levende kamera, og Gentag dette for alle kanaler.
- Efter scanning monoplex dias, generere simuleret brightfield billeder (hvis funktionen er tilgængelig i den programmel anvendte) at visuelt sammenligne med den normale IHC mønster og at afgøre, om den farvning mønster er korrekt (figur 1 og figur 2 ).
- Vælg filtre fra tilgængelige standard epi-fluorescens filtre (DAPI, FITC, CY3, Texas rød og CY5) passende for de erhvervsdrivende fluorophore.
-
Scanning multiplex prøver (TMA dias / flere prøver)
- Angive de optiske parametre som beskrevet for scanning monoplex billeder (trin 6.1). For det første justere fokus manuelt eller automatisk (Følg anvisningerne i det specifikke billede afsøgning maskine). For det andet, justere eksponeringstiden for hver fluorescerende kanal til at sikre, at alle kerner på en TMA, eller alle områder på et dias, er korrekt eksponeret.
Bemærk: Området valgt at justere eksponeringstiden er vigtigt. Brugere skal vælge det stærkeste signal region for hvert filter (dvs.Ki67 signal er stærkere i regionen tonsil germinale centrum end i regionen nongerminal center, dermed, brugerne skal bruge germinal center regionen på en passende eksponering tid). Brugere kan også vedtage en oversaturation korrektion funktion af billedbehandlingssystem hvis tilgængelige. - Skan TMA dias under en TMA scanningstilstand, hvis de findes i billedbehandlingssystem, med en passende autofokus algoritme.
- For hele-væv afsnit dias, får de dias, der er gennemgået af en kvalificeret patolog at vælge optimale billeder fra de mest repræsentative tumor områder.
Bemærk: Protokollen beskrevet her er baseret på en defineret mikroskop/billede analysesystem (Se Tabel af materialer). Der er andre maskiner og billede analyse software, der kan scanne og analysere multiplex IHC dias7.
- Angive de optiske parametre som beskrevet for scanning monoplex billeder (trin 6.1). For det første justere fokus manuelt eller automatisk (Følg anvisningerne i det specifikke billede afsøgning maskine). For det andet, justere eksponeringstiden for hver fluorescerende kanal til at sikre, at alle kerner på en TMA, eller alle områder på et dias, er korrekt eksponeret.
8. dataanalyse
-
Preanalysis vurdering og planlægning
- Brug diasset reference for autofluorescence til at trække autofluorescence fra billeder scannet for analyse.
- Gennemgå billeder inden analyse for at sikre, at de er i fokus og uden farvning artefakter.
- Bruge en tumormarkør (fxCD20 i dette eksempel) at identificere celler af interesse og for at fortsætte med celle segmentering, scoring og batchanalyse tilgange. Vælg CD20-positive celler til analyse.
Bemærk: For eksempel, i DLBCL prøver analyseres her, indstilling og parametre, der er defineret for celle segmentering er baseret på nuklear størrelse og intensitet men er specifikke for billede analyse software anvendes (f.eks.en DAPI mener pixel intensitet på mindst 0,05; størrelse mellem 80-320 pixels, med en opdeling følsomhed på 2 [dette er en software-specifik parameter, som er stærkt afhængig af morfologi af tumor: for lille tumorceller, opdeling af 0,7 - 1 er passende, for store tumorceller, opdele kan justeres op 4]). - Anmodning om kvalificeret patolog gennemgå individuelle billeder og beslutte om væv segmentering er forpligtet til at vælge tumor celle beriget og udelukke regioner med nekrose arearegion orand rigelige reaktive celler. Hvis der kræves yderligere væv segmentering, derefter vælge passende kontrol regioner (f.eks tumor celler/stroma/nekrose) og kontrollere, at billedet analyse software korrekt kan identificere sådanne regioner
- Fortsætte med celle segmentering efter væv segmentering (hvis nogen), anmodning en kvalificeret patolog at gennemgå celle segmentering kort for at sikre troskab af den påtænkte segmentering tilgang5.
- Bestemme de mest biologisk/klinisk relevant analysemetode for en given biomarkør af interesse (f.eks.procentdelen positivitet eller gennemsnitlige intensitet pr. celle).
- Vælg en cut-off værdi for hver markør (for procentdel positivitet).
- Bestemme den optiske intensitet positive cut-off værdi for hver markør sammenholdt med en patolog. Generere histogrammer ved at analysere frekvens fordelingen af markør intensitet/celle i passende statistik software (Se Tabel af materialer).
Bemærk: En intensitet værdi histogram kan tilbyde et overblik over fordelingen af intensiteterne for signal. - Bestemme en omtrentlig cut-off fra histogrammet og kontrollere dette med en patolog gennemgang, at korrelere med manuelt beslutsomme cut-offs på udvalgte billeder. I nogle situationer, en ensartet enkelt cut-off vil ikke være muligt på grund af variation i farvning, og en manuel cut-off værdi for hver prøve vil være påkrævet.
Bemærk: Afsnit 8.1 bør ske i billed analyse software (Se Tabel af materialer) medmindre andet er angivet.
-
Mærkning positive og negative celler
- For hver markør for renter, efter cut-off antallet bestemmes (gennem histogrammer eller manuelt), bruge en "Hvis" eller lignende logik formel til at markere positive og negative celler med markeret værdi: nummer 1 for positive celler, nummer 0 for negative celler.
- Formere sig markant værdien af hver markør (enten 1 eller 0) med produkter i separate kolonner for positivitet alle markører. Hvis produktet er lig med 1, betyder det, at cellen er positiv for alle markører. Positivitet og negativitet af en specifik markør, bruge en hvis logik algoritme.
Bemærk: Afsnit 8.2 skal gøres i statistik software (Se Tabel af materialer).
-
Generere procentdel og numeriske data ved hjælp af en pivottabel
- Generere procentvise data for specifikke markører af interesse inden for definerede celler (f.eks., CD20-positive celler eller CD20-negative celler) (figur 6).
- Indsæt en pivot-tabel i databladet.
- For at beregne positivitet procentdelen af et enkelt mærke, såsom CD20, Vælg funktionen SUM under værdidelen af pivot-tabel til at tælle det samlede antal CD20-positive celler ved hjælp af summen af CD20 + celler divideret med den samlede celle nummer. Resultatet er CD20+ celle procent inden for en kerne eller en undersøgelse nummer (afhænger af valg af rækken pivot tabel).
- Beregne positivitet procentdelen af flere markører ved hjælp af samme metode (figur 3).
- Generere numeriske data. Uddrag den mediane normaliseret tæller for hver markør for hver kerne eller hver undersøgelse antallet ved at opnå den gennemsnitlige intensitet for hver markør af interesse for alle de celler, studeret i en prøve (figur 4).
Bemærk: Middelværdien ikke kan udledes i pivottabellen direkte. Det kan udledes, bruge denne formel: MEDIAN (hvis (kolonne af undersøgelsen tal = specifik undersøgelse række, kolonne af normaliserede værdi)).
-
Afbilde data i et passende graf
- Plot resultaterne af procentdel positivitet eller median intensitet pr. markør i en celletype af interesse paa passende maade for yderligere statistiske test og præsentation.
- Oprette dot grunde til at give en visualisering af tal og distribution.
Bemærk: Der repræsenterer data med søjlediagrammer gør ikke viderebringe oplysninger om fordelingen. Skøn parceller anbefales også som en god metode til data repræsentation, med vægt på omfanget af forskellen mellem prøver16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MF-IHC billeder til en DLBCL prøve med C-MYC og BCL2 gen omlejring (dobbelt-hit lymfom) er vist i figur 1. Figur 2 illustrerer den simulerede lysfelt immunhistokemiske billeder. Figur 3 viser generation af procentdel data. Figur 4 viser detaljerne for en median formel for generation af numeriske data. Figur 5 viser anvendelsen af mf-IHC af et panel for T-celle i angioimmunoblastic T-celle lymfomer. Figur 6 viser optimering billede af tonsil kontrolprøve og dataanalyse til denne prøve.
Figur 1: B-celle multipleksede immunofluorescens panelet billeder til en diffus store B-celle lymfom (DLBCL) prøve med C-MYC og CL2 gen omlejring (dobbelt-hit lymfom). Magenta = CD20 (membran); hvid = BCL2 (cytoplasma); gul = Ki67 (nukleare); grøn = C-MYC (nukleare); rød = BCL6 (nuklear), blå = DAPI (nukleare kontrastfarve). CD20-positiv tumorceller viser en høj udtryk for C-MYC (80%) og BCL2 (> 90%), og Ki67 spredning indeks er også høj (90%). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: simuleret lysfelt immunhistokemiske billeder (genereret ud fra figur 1) den samme DLBCL prøve med C-MYC og BCL2 gen omlejring (dobbelt-hit lymfom). CD20 viser membran farvning i tumorcellerne. BCL2 viser cytoplasma farvning i > 90% af tumorcellerne. C-MYC positivitet er omkring 80%. BCL6 viser nukleare farvning i ca. 20% af cellerne. Ki67 er positiv i 90% af cellerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: pivottabel viser hvordan man kan generere procentdel data ifølge undersøgelsen nummer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Median formel for den normaliserede Ki67 OD-værdi ifølge undersøgelsen nummer. IF-sætningen finder alle undersøgelse numre, der er lig med en bestemt undersøgelse nummer (som er 52 i denne figur). Derefter returnerer den tilsvarende Ki67 normaliseret værdi. CTRL + Skift + Enter tastekombinationer kan bruges til at beregne medianen (Ki67 Median) for disse returnerede værdier, som er 11,56 til undersøgelse nummer 52. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: multipleksede immunofluorescens panelet billeder for en angioimmunoblastic T-celle lymfom (AITL) prøve. (A) det sammensatte billede viser de cellulære heterogenitet af et AITL udsnit. Magenta = CD20 (membran); gul = CD4 (membran); grøn = PD1 (membran); rød = BCL6 (nuklear); cyan = CD8 (membran); blå = DAPI (nukleare kontrastfarve). (B) den øverste række billeder viser et forstørret billede af det markerede i den hvide boks i panelet Aområde. Den nederste række billeder viser de tilsvarende segmenteret celle masker: gul/rød/grøn viser enkelt CD4/BCL6/PD1-positive celler, henholdsvis. Blå repræsenterer negative celler, og hvid angiver dobbelt-positive celler. Billederne viser, at 50% af CD4+ celler er PD1+ (venstre, hvid), mens 20% af CD4+ celler er også positiv for BCL6 (Mellemøsten, hvid). Den dobbelte positivitet sats for PD1 og BCL6 er omkring 10% (højre, hvid). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: multipleksede immunofluorescens optimering billeder for tonsil kontrol væv. (A) det sammensatte billede viser området germinale centrum i en tonsil kontrolprøve. Gul = C-Myc (nukleare); rød = BCL6 (nuklear); cyan = BCL2 (cytoplasma); magenta = CD20 (membran); grøn = Ki67 (nukleare); blå = DAPI (nukleare kontrastfarve). C-Myc er positive kun i et par celler. BCL6 og Ki67 er positive hovedsagelig inden for den germinale centrum, mens BCL2 er positive hovedsagelig uden germinale centrum. CD20 er diffust positive i og uden for den germinale centrum. (B) tabellen viser at germinal center CD20-positive celler er også positiv for BCL6 og Ki67 men negative for BCL2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Sekvens af antistoffarvning | Primære antistof (se tabel over materialer) | Samlede HIER kræves | Faktiske pre pletten HIER | Sekundær antistof | Fluorophore | Post-TSA antistof stripping |
| 1 | Musen anti-Bcl6 (1:30, 60min RT) | 25minutes, Ph9 | 25minutes, Ph9 | HRP-konjugerede anti-mus, 1:1000' for 10' | OPAL Cy5 på 1: 100 | 1 runde 100% strøm 1 min, 20% strøm i 10min |
| 2 | Musen anti-Bcl2(1:50,60 min RT) | 25minutes, Ph9 | Ingen | HRP-konjugerede anti-mus, 1:1000' for 10' | OPAL 520 på 1: 100 | 1 runde 100% strøm 1 min, 20% strøm i 10min |
| 3 | Kanin anti-c-MYC(1:50,30 min RT) | 25minutes, Ph9 | Ingen | HRP-konjugerede anti-kanin, 1:1000' for 10' | OPAL 570 på 1: 100 | 1 runde 100% strøm 1 min, 20% strøm i 10min |
| 4 | Musen anti-CD20(1:2000,30 min RT) | 25minutes, Ph9 | Ingen | HRP-konjugerede anti-mus, 1:1000' for 10' | OPAL 540 på 1: 100 | 1 runde 100% strøm 1 min, 20% strøm i 10min |
| 5 | Musen anti-Ki-67(1:50,45 min RT) | 30minutes, Ph9 | 5 minutter pH9 | HRP-konjugerede anti-mus, 1:1000' for 10' | OPAL 620 på 1: 100 | 1 runde 100% strøm 1 min, 20% strøm i 10min |
Tabel 1: eksempel på en færdiggjort layout for multiplex Hvis farvningen. Denne tabel indeholder et eksempel på, hvordan man angiver mængden HIER og mikrobølgeovn-baserede stripping skal gøres på hvert trin, når monoplex pletter er blevet optimeret.
Tabel 2: Guide til filtervalg af for fluorophores. Denne tabel indeholder en rough guide mod passende filtre, der kan bruges på angivne udstyr, til at visualisere fluorophores af interesse. Det anbefales at tjekke filterspecifikationer for mikroskopet bliver brugt i forbindelse med profilen emission/excitation af fluorophores anvendes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MF-IHC har potentiale til at aktiverer patologer forfine diagnosticcriteria i lymfoide patologi og analyserer betydningen af biomarkører i specifikke celletyper mod en forudsigelse af kliniske resultater. Som en ny Forskningsmetode anvendes mf-IHC i stigende grad kvantitative og rumlige identifikation af flere immun parametre af tumor celler17. Påvisning af mf-IHC for fælles udtryk for tumor biomarkører har vist sig at være reproducerbare og pålidelig5. Teknologien er imidlertid spirende og underkastet en variation som følge af reagens - og/eller væv-relaterede faktorer, såsom dem på grund af uoverensstemmelse i væv fiksering og forarbejdning.
Kritisk til teknik er brugen af godt validerede antistoffer, der er specifikke, følsomme, og giver reproducerbare resultater. Der er eksempler på litteratur af antistoffer oprindeligt beskrevet for at være specifikke for deres antigener og senere påvistes for at anerkende ikke-relaterede proteiner ved hjælp af knock-out modeller14. Knock-out / knock-down valideringsmetode i hvilken wild-type eller celler med overexpressed antigener tjene som positive kontroller mens celler med mål slået ud eller slået ned af siRNA eller CRISPR metoder bruges som negative kontroller.
Ligesom de konventionelle IHC har mf-IHC mange kritiske variabler, der skal optimeres for hvert eksperiment, for optimal farvning og resultater. Disse omfatter antigen hentning løsning, antistof fortynding, tildelingen af et fluorophore for hver markør, og koncentrationen af fluorophore pH-værdi. De almindeligt anvendte antigen hentning løsninger er af pH 6 og 9. Det er værd at teste som pH giver optimal farvning mønster og intensitet med mindre baggrund.
Der er ingen specifikke retningslinjer at træffe beslutning om rækkefølgen af antistof ansøgning i multiplex eksperimentet som det afhænger ikke kun af affinitet af antistoffet, men også i kraft af opal fluorophores. Generelt er antistoffer med en svag affinitet ofte kræver højere koncentrationer baseret på monoplex farvning og anvendes først i multiplex sekvens. Stærk affinitet antistoffer, der er tilbøjelige til at blive resistente over for stripping er anvendt sidst, for at undgå uspecifik farvning. Med hensyn til valget af en bestemt fluorophore er det bedre at undgå at bruge fluorophores med lignende spektrale bølgelængder for antigener, som colocalize i de samme cellulære rum. Antigener med lav udtryk niveauer er tildelt med den lyseste fluorophores og vice versa. Hvis i eksemplet undersøgelse signal intensitet er svage, kan justere opal TSA fortynding gøres for at opnå det ønskede signal18. I nogle tilfælde kan forsøger forskellige antigen hentning metoder eller øge den primære antistof koncentration arbejde. Den første fortynding af det primære antistof kan være den samme som i en konventionel IHC eksperiment. Men, hvis hvis signalet er ikke klart, afprøvning af andre antistof fortyndinger vil være påkrævet, som de betingelser, der er optimeret til IHC ikke Oversæt altid til, hvis. Signal intensitet er påvirket af orden eller sekvens af immunfarvning. Nogle epitoper er overeksponeret efter to eller tre runder af MWT, mens nogle kan forringes på grund af overskydende MWT. Visse fluorophores kan også påvirkes af MWT og skal testes for dæmpning.
Denne protokol fokuserer på colocalization og måling af intensiteten af markører i delmængder af celler i en ondartet B-celle lymfom. De vigtigste udfordringer for udviklingen af den nuværende protokol inddrage generation af en optimeret multiplex panel for antigener, der colocalize i de samme cellulære rum. Der skal være en præcis urtåge af fluorophores til præcis kvantificering. Når panelet multiplex er på plads, er imaging af farvede lysbilleder relativt ligetil. Den næste forhindring indebærer en analyse af de afbildede data. I modsætning til i immun infiltration undersøgelser, hvor kvantitering af bestemt immun celletyper inden for en epitelial tumor er ligetil, colocalization undersøgelser i lymfom er stærkt afhængige af definitionen af positivitet af en uddannet patolog for hver markør for interesse. Der følger på en passende diagnostiske cut-off, som kan anvendes til rutinemæssig klinisk praksis er stadig et arbejde i gang. Yderligere forbedringer i metoder for yderligere oplysninger om datanormalisering og automatiseret cut-off triangulering vil være påkrævet, før denne teknik kan integreres i rutinemæssig diagnostik.
På trods af nuværende begrænsninger gør de potentielle anvendelser af mf-IHC og den viden, der kan udledes fra undersøgelsen af tumorceller og deres rumlige forhold med mikromiljø det en attraktiv værktøj, især for udfordrende histologiske kræftformer såsom lymfoide malignitet. Yderligere indsats er nødvendig for at fastlægge protokoller i væv fiksering og væv forarbejdning, der er optimal for den foreslåede arbejdsproces, som ekstraudstyr i farvning teknikker, at give mulighed for simultan analyse af et øget antal mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
A.D.J. har modtaget støtte fra PerkinElmer mod rejser til brugergruppe møder. Forfatterne har ingen andre interessekonflikter at videregive.
Acknowledgments
S.-B.N. og A.D.J. understøttes af Singapore Ministry of Healths nationale medicinske forskning Rådet overgang Awards (NMRC/TA/0020/2013 og NMRC/TA/0052/2016). Forfatterne anerkender Yong Siew Yoon forskning tilskud til A.D.J. fra den nationale Universitet Cancer Institute i Singapore mod køb af en Vectra spektrale imaging mikroskop. Denne undersøgelse er godkendt af Singapore NHG domæne specifikke Review Board B (2014/00693).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
References
- Swerdlow, S. H., et al. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , Revised Fourth Edition, Stylus Pub LIc. (2017).
- Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
- Dabbs, D. J. Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , Saunders. (2010).
- Kim, S. -W., Roh, J., Park, C. -S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Anderson, M. W., Natkunam, Y. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. Jones, D. , Humana Press. 21-44 (2010).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
- Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Tóth, Z. E., Mezey, É Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Ng, S. -B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
- Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).
- Kalyuzhny, A. E. Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , Humana Press. (2011).
- Bordeaux, J., et al.
- PerkinElmer. Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User's Manual. , PerkinElmer, Inc. (2012).
- Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
- Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
- PerkinElmer. Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , PerkinElmer, Inc. (2017).
