Summary
Nous décrivons ici un protocole pour multiplex immunohistochemical fluorescent de coloration et d’imagerie pour la localisation simultanée de plusieurs antigènes associés aux cancer des lymphomes. Ce protocole peut être étendu à l’analyse de colocalisation de biomarqueurs dans toutes les coupes de tissus.
Abstract
Immunohistochimie (IHC) méthodes pour l’analyse in situ d’expression de la protéine au microscope photonique sont un outil puissant pour la recherche et des fins de diagnostic. Cependant, la visualisation et la quantification des antigènes multiples dans une section de tissu unique aide IHC chromogène conventionnel est difficile. L’imagerie multiplexé est particulièrement pertinent dans la recherche de lymphome et de diagnostics, où les marqueurs devront être interprétées dans le contexte d’un micro-environnement tumoral complexe. Nous décrivons ici un protocole pour multiplexé IHC fluorescent coloration afin de permettre l’évaluation quantitative de cibles multiples dans les types spécifiques de cellules d’intérêt dans le lymphome. La méthode couvre les aspects de validation de l’anticorps, l’optimisation de l’anticorps, l’optimisation multiplexe avec des marqueurs des sous-types de lymphomes, la coloration des lames de tissu microarray (TMA) et la numérisation des diapositives, suivie d’analyse de données, avec spécifiques référence de lymphome. En utilisant cette méthode, partitions pour les deux l’intensité moyenne d’un marqueur d’intérêt et la pourcentage de positivité sont générées afin de faciliter la poursuite des analyses quantitatives. Multiplexage minimise l’utilisation de l’échantillon et fournit de l’information spatiale pour chaque marqueur d’intérêt.
Introduction
Les tumeurs lymphoïdes sont causés par la prolifération maligne anarchique des lymphocytes. Ces cellules sont des composantes essentielles du système immunitaire et localiser les organes immunitaires primaires et secondaires, tels que la moelle osseuse, ganglions lymphatiques, la rate et autre système lymphoïde associé aux muqueuses. Les tumeurs lymphoïdes sont un groupe hétérogène d’affections qui sont classées basé sur une constellation de caractéristiques, dont la morphologie lymphoblastiques, les caractéristiques génétiques et présentation clinique. Tandis que chaque paramètre joue un rôle, lignée reste une caractéristique déterminante et constitue la base pour le système de classification OMS qui reconnaît les néoplasmes dérivés de cellules B et les lymphocytes T natural killer (NK) cellules1.
Clé à la classification du lymphome est la caractérisation des anticorps contre les marqueurs de surface de leucocytes des différents sous-types de lymphocytes2. L’immunohistochimie (IHC) a été utilisé traditionnellement pour l’analyse de ces marqueurs et repose sur le principe de la reconnaissance de l’antigène-anticorps spécifique pour détecter des molécules axée sur les cellules et les tissus qui peuvent être visualisées par le microscope photonique 3. Toutefois, l’identification de cibles multiples sur une seule diapositive, par conventionnel lumineux-zone chromogène multiplex IHC a des limites car il est souvent difficile de distinguer de multiples signaux de couleur sur une section de tissu unique fiable — surtout pour les antigènes avec une expression très faible4. Évaluation visuelle et la quantification de coloration peuvent aussi être subjectives, provoquant la variabilité dans l’analyse et les données interprétation5.
IHC classique sur des échantillons (FFIP) fixés au formol, paraffine n’est donc pas possible pour la détection simultanée de multiples cibles immunologiquement diverses maladies comme le lymphome. En outre, la distinction lymphocytes néoplasiques des cellules immunitaires environnantes est souvent imprécise. Cela empêche les études examinant la pertinence de nouveaux biomarqueurs dans le lymphome. Dans ce contexte, multiplexe fluorescent IHC (mf-IHC) offre une alternative prometteuse, car il permet l’évaluation quantitative de la coexpression de l’antigène et une relation spatiale avec une plus grande précision tout en conservant un limité d’échantillons6,7. Lorsque cette technologie d’imagerie est en partenariat avec le logiciel d’analyse de l’image numérique, l’interprétation des données est rendue plus efficace et facilite l’étude de la tumeur et microenvironnement hétérogénéité8,9. Dans ce protocole, une base tyramide immunofluorescence (IF) méthode de multiplexage est appliquée pour amplifier le signal et est compatible avec n’importe quel anticorps IHC-validé de toute espèce d’hôte, même ceux mis au point à la même espèce5,7 , 10. le protocole tyramide permet la conjugaison directe du fluorophore au tissu d’intérêt pour que les anticorps primaires et secondaires peuvent être dépouillés après chaque étape, permettant l’application séquentielle de plusieurs taches sans la réactivité des anticorps.
Une stratégie multiplexée sera utile pour prédire le pronostic et le traitement des résultats par l’identification des cibles et leurs profils immunologiques variant dans les lymphomes. Multiplexe fluorescent IHC a été appliquée dans notre laboratoire pour l’étude d’un panel de marqueurs T et les lymphocytes B et T-folliculaire d’assistance dans le lymphome de T-cellule d’angioimmunoblastic (AITL), un sous-type d’un lymphome à cellules T périphérique caractérisée par agressivité clinique comportement et tumeur hétérogénéité11. L’utilité de cette méthode est également illustrée en diffus grand lymphome B (LMNH) où la signalisation accrue d’un récepteur des cellules B avec l’expression simultanée de C-MYC et BCL-2 suggère l’utilisation thérapeutique potentielle d’inhibition de la tyrosine kinase de Bruton 12 .
Nous décrivons ici l’ensemble du protocole de validation de l’anticorps à la sélection des tissus appropriés de contrôle et de multiplexage à l’aide de lymphome FFIP tissus, avec une éventuelle analyse de lames colorées en utilisant un balayage automatisé d’imagerie quantitative pathologie système.
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Protocol
Tous les tissus utilisés dans le présent protocole ont été obtenus sous la Singapour NHG domaine spécifique Review Board B étudier 2014/00693.
1. sélection et Validation des anticorps
Remarque : Avant de procéder à la mise en place d’un panneau de multiplex, assurez-vous que tous les anticorps tachent robuste, identifiant uniquement l’antigène cible d’intérêt. Le but est de sélectionner des anticorps qui reconnaissent spécifiquement l’antigène d’intérêt dans des sections de tissu.
- Pour un anticorps avec utilisation de recherche bien établies, ou utilisation clinique courante dans IHC, confirmer les conditions tels que la dilution de récupération et d’anticorps epitope en effectuant des classiques IHC5,13 sur les tissus de témoins positifs et négatifs sections. Pour des coupes de tissus d’origine humaine, faire en sorte que les dégagements de déontologie appropriés soient en place avant d’entreprendre des expériences.
Remarque : Des contrôles positifs sont les tissus qui sont censés exprimer l’antigène d’intérêt et contrôles négatifs sont ceux qui ne le font pas. Tissus d’amygdales bénigne sont choisie comme un contrôle de bon tissu pour les antigènes de lymphome car il contient un mélange de cellules immunitaires, y compris les cellules B, les cellules T et cellules présentatrices d’antigène, ainsi que les cellules stromales et épithéliales. Ces derniers servent de contrôles internes négatives utiles. - Pour cibles inconnues ou anticorps commerciaux ayant pas suffisamment de données publiées, effectuer la validation de l’anticorps en créant le positif correspondant et cellule FFIP contrôle négatif bloque14, à l’aide de CRISPR knock out ou siRNA précipitation de l’antigène d’intérêt dans une lignée de cellules appropriées grâce à des techniques de la biologie moléculaire standard. Utiliser ces blocs de cellules FFPE en remplacement de tissus témoins positifs et négatifs pour IHC conventionnel comme par l’Etape 1.1.
Remarque : Les cellules HeLa ou 293 t sont couramment utilisés pour les antigènes qui ne sont pas de type cellulaire spécifique, car les lignées de cellules de lymphome sont difficiles à transfecter. Pour les antigènes qui sont spécifiques des lymphocytes, lignées de cellules de lymphome peuvent servir avec transduction virale ou électroporation comme le mode de livraison de gène (quoique avec une efficacité faible).
2. planification de la séquence des anticorps et des Fluorophores pour le panneau Multiplex
- Planifier la séquence des réactifs pour la coloration multiplex final. Par exemple, ici la séquence du protocole multiplex a été initialement prévue comme premier, Bcl-6 ; Deuxièmement, Bcl-2 ; Troisièmement, C-Myc ; quatrième, CD20 ; Cinquièmement, Ki67.
Remarque : Pour décider de la séquence, anticorps ayant une affinité faible nécessitant des concentrations plus élevées devraient être teint tout d’abord la coloration multiplex final. Des anticorps de haute affinité qui risquent d’être résistant à plusieurs séries de décapage des micro-ondes sont appliqués en dernier dans le protocole multiplex pour éviter la coloration non spécifique. - Plan le fluorophore de partenaire pour chacun des anticorps dans le panneau. Voir le tableau 1 et Table des matières pour les choix dans cet exemple.
Remarque : Pour choisir le partenaire de fluorophore pour chacun des anticorps, choisissez fluorophores spectralement distinctes pour les anticorps ayant des profils similaires de localisation au sein de la cellule et les tissus. Cela réduira le chevauchement spectrale et la difficulté avec la déconvolution.
3. Monoplex Tyramide-base dans le cas d’un panneau de Multiplex 5-plex simulé
Remarque : Dans cet exemple, le protocole pour CD20 on discute, qu’il est prévu que l’anticorps quatrième dans une séquence multiplexe décrite ci-dessus. Le nombre d’étapes supplémentaires de décapage sera différente pour la position de l’anticorps dans la séquence.
- Coupes 3 µm-mince de tissu de témoins positifs et négatifs à l’aide d’un microtome et déposer les éléments sur lames de verre enduits poly-L-lysine microscope.
- Déparaffinage les sections à l’aide d’une solution de compensation appropriée 3 x 4 min chaque. Réhydrater les diapositives d’alcool à 100 %, alcool à 90 % et 70 % d’alcool, 4 min chaque. Placer les lames dans l’eau distillée pendant 2-3 min.
- Déposer les lames dans un bocal en verre résistant aux micro-ondes dans un tampon d’extraction antigène standard (disponible dans le commerce) pour plonger les lames. Effectuer la chaleur démasquage par (HIER) à l’aide de micro-ondes adapté, en solution de récupération pH9 antigène à 98 ° C pendant 25 min.
Remarque : N’importe quel micro-onde avec une pression allant de 800-1 100 Watts peut être utilisé, et HIER peut être optimisée en conséquence. Dans ce cas, un traitement de tissu micro-ondes multifonctions (ouvert à l’air) a été utilisé pour HIER et décapage. Les paramètres initiaux pour la récupération d’un épitope particulier sont basés sur la connaissance préalable de l’IHC classique. - Effectuer des rondes supplémentaires de micro-ondes décapage (trois dans ce cas, pour le quatrième anticorps dans un panneau), chaque tour avec 100 % de puissance à 98 ° C et 20 % pendant 10 min afin de maintenir la même température. Refroidir les lames dans l’eau distillée pendant au moins 10 min.
Remarque : Effectuez plusieurs séries de micro-ondes décapage durant l’étape de IF monoplex pour exposer l’antigène cible pour le même nombre d’étapes comme dans le multiplex proposé de chauffage. Depuis CD20 est prévu que l’anticorps quatrième, mettez au micro-ondes 3 x avant et une fois après avoir fait l’incubation de l’anticorps primaire de décapage. - Vérifier et de reconstituer la mémoire tampon après toutes les 5 min pendant le stripping micro-ondes supplémentaires. Surtout, ne laissez pas diapositives dessécher pendant les opérations de décapage multiples. Lorsque vous prenez la glisse hors du micro-ondes, utiliser forceps et des gants résistant à la chaleur pour les placer dans un pot séparé de l’eau distillée. Attendez que la solution de récupération de l’antigène refroidir naturellement.
- Bloquer l’activité peroxydase de tissus en utilisant un bloc commercial peroxydase pendant 10 min (peroxyde d’hydrogène 3 % peut être utilisée comme réactif remplaçant). Lavage avec une solution saline tamponnée Tris (SCT) et un détergent non ionique pendant 5 min.
NOTE : SCT est composé de 50 mM Tris-Cl, pH 7,5 et 150 mM NaCl.TBS de faire du SCT-D. - Bloc avec diluant d’anticorps ou d’albumine de sérum pendant 15 min, suivie d’une incubation avec l’anticorps primaire d’intérêt (p. ex., CD20, 1:2,000 dilution dans le diluant de l’anticorps, voir Table des matières) à température ambiante pendant 30 min. laver 3 x avec TBS-D tampon pendant 5 minutes chaque fois. Il devrait y avoir suffisamment tampon TBS-D de plonger la lame complètement dans toutes les étapes de lavage.
Remarque : L’albumine sérique Bovine peut être utilisé comme un autre anticorps diluant. Le volume de diluant anticorps dépend de la taille du tissu, allant de 50 µL (pour les échantillons de biopsie) à 400 µL (pour les échantillons de l’excision ou des échantillons de tissu microarray). - Incuber à une peroxydase de raifort approprié (pr)-anticorps secondaire, choisi en fonction de l’espèce d’origine de l’anticorps primaire pendant 15 min à température ambiante. Laver 3 fois avec le tampon TBS-D pendant 5 min chaque fois.
- Appliquez un approprié basé sur tyramide réactif fluorescent (1/100 dans l’amplification diluant) et incuber à température ambiante pendant 5 min, afin de permettre un fluorophore conjugaison à l’échantillon de tissu sur les sites de liaison de l’anticorps primaire. Laver 3 fois avec le tampon TBS-D pendant 5 min chaque fois.
- Effectuer un décapage d’axée sur les micro-ondes supplémentaires pour éliminer les anticorps primaires et secondaires. Répéter au besoin basé sur la position de l’anticorps dans la séquence.
- Placez la lame dans l’eau distillée pour refroidir. Incuber au DAPI (dilution au 1/100 dans le diluant anticorps) pendant 10 min, suivie de lavage 3 x avec le tampon TBS-D pendant 5 minutes chaque fois. Séchez la zone sur la lame sans le tissu avec des lingettes et monter la diapositive avec supports de montage approprié.
- L’image de la diapositive (voir sections 6 et 7 du présent protocole) et déterminer l’à-propos de la coloration (tel que défini par une discrimination manifeste des tissus témoins positifs et négatifs).
Remarque : Si le motif de coloration est incorrect, refaire la monoplex coloration après avoir réglé une ou plusieurs des paramètres suivants : le nombre de récupération de chaleur les étapes, le montant de la récupération de la chaleur, la période d’incubation/concentration d’anticorps (primaire et secondaire), la position des anticorps dans la séquence et le choix du fluorophore. La monoplex étape de coloration généralement nécessite plusieurs cycles d’optimisation pour obtenir un ensemble approprié de paramètres pour une coloration appropriée. Il est conseillé de tester une gamme de fluorophores avec chaque anticorps primaire, comme cela vous donnera la flexibilité pour décider de la dernière série de multiplexe.
4. répétition de la Monoplex pour chacun des anticorps dans le protocole Multiplex
- Répéter le monoplex coloration pour les autres anticorps de façon similaire, en ajustant le nombre de mesures, basés sur la position de l’anticorps dans la séquence de décapage à micro-ondes. Par exemple, lors de l’exécution monoplex de coloration pour l’anticorps troisième dans un panneau de multiplex de six-plex, effectuer deux étapes de décapage micro-ondes avant et trois étapes de décapage de micro-ondes après l’incubation de l’anticorps primaire.
Remarque : Il est important de comprendre que le décapage axée sur les micro-ondes des anticorps expose également l’exemple d’HIER. Si un anticorps spécifique nécessite une stratégie de récupération différents épitopes, ceci doit être pris en compte lors de la planification de la séquence multiplexe. Dans cet exemple, Ki67 démasquage nécessite pH 9, pendant 30 min. Étant donné que 25 min d’HIER se fera avant KI67 coloration dans le protocole séquentiel, seulement 5 min supplémentaire d’HIER sont nécessaires.
5. multiplex souillant le protocole
Remarque : Passez avec le multiplex souillant le protocole qu’une fois tous les composants ont été optimisées à l’aide de monoplex si la coloration. Examiner les résultats de la coloration monoplex et concevoir un tableau montrant la disposition finale de l’ordre de multiplex et le choix du fluorophore pour chacun des anticorps. La concentration d’anticorps, la durée de la coloration et la séquence et la nature de la récupération de chaleur pour chaque anticorps utilisé ici sont en détail dans le tableau 1.
- Sections de coupe 3 µm-mince de tissu de témoins positifs et négatifs, ainsi comme le tissu de cible d’intérêt (ici, échantillons FFPE de lymphome), aide d’un microtome et déposer les éléments sur lames de verre enduits poly-L-lysine microscope (voir Table des matières).
NOTE : Inclusion des contrôles positifs et négatifs pour chaque anticorps dans le panneau est conseillable, ainsi que les échantillons réels pour multiplex. Cela permet une confirmation que le protocole de coloration a été effectué correctement. - Déparaffinage, effectuer le démasquage par chaleur (HIER) et bloquer l’activité peroxydasique tissu comme dans les étapes de protocole monoplex 3,3 à 3,5.
- Incubation avec l’anticorps primaire premier de la séquence de multiplexe optimisée, comme précédemment déterminée à l’aide de l’étape de IF monoplex. Dans cet exemple, BCL-6, à un 01:30 dilution en anticorps diluant à température ambiante pendant 60 min (voir Table des matières), a été la première étape du protocole multiplex. Laver avec le tampon TBS-D pendant 5 min.
- Incubez avec un anticorps secondaire marqué au HRP approprié basé sur l’espèce de l’anticorps primaire utilisé dans l’avant étape (voir la Table des matières) à température ambiante pendant 10 min. Lavez avec un tampon TBS-D pendant 5 min.
- Appliquer l’optimisé axée sur les tyramide fluorescent réactif (Cy5 dans cet exemple, 1/100 dans le diluant de l’amplification, voir Table des matières) avec une incubation à température ambiante pendant 5 min. Après l’incubation, laver avec le tampon TBS-D pendant 5 min.
Remarque : Le choix du réactif fluorescent axée sur la tyramide repose sur la monoplex optimisée si. - Vérifier l’efficacité de la coloration du premier anticorps à l’aide d’un microscope approprié (voir la Table des matières).
NOTE : Intérimaire d’imagerie des chèques peut être fait avec une facilité si l’échantillon est une TMA ou une seule diapositive. Si, toutefois, la tache est effectuée sur plusieurs diapositives, c’est peut-être peu pratique, et cette étape peut être omise. - Effectuer des micro-ondes décapage pour le deuxième anticorps dans le protocole, à l’aide de conditions optimisées à l’étape de monoplex. Ensuite, procéder à la coloration de l’anticorps primaire deuxième (en l’occurrence, BCL2) avec l’anticorps secondaire marqué au HRP et réactif fluorescent à base de tyramide (ici, 520, voir Table des matières). Vérifier l’efficacité de la coloration sous un microscope à fluorescence à l’issue du second tour de la coloration.
- De même, répétez la procédure à l’aide de la troisième, quatrième et cinquième anticorps dans la séquence (ici, c-Myc, CD20 et ki67, respectivement, avec des fluorophores 570, 540 et 620, respectivement). Effectuer des contrôles d’imagerie entre chaque étape si possible.
- Ajouter un contre-colorant nucléaire (DAPI, dilution au 1/100 en anticorps diluant) pendant 10 min et, ensuite, laver 2 x à SCT-D pendant 5 minutes chaque.
- Monter les diapositives à l’aide d’un réactif de fixation appropriée.
6. préparation de diapositives spectrales bibliothèque
NOTE : Articles 6 à 8 du présent protocole sont uniques à multiplexé des expériences qui sont imagés à l’aide d’une caméra spectrale.
- Créer bibliothèque de diapositives (images de référence de single-tache) pour chaque fluorophore, DAPI et autofluorescence sur le tissu témoin même, à utiliser pour l’analyse d’image multispectrale.
- Couper des sections de 2 x 3 µm-mince de type tissulaire d’intérêt (ici, un échantillon de lymphome ou une amygdale comme contrôle) à l’aide d’un microtome et déposer les éléments sur lames de verre enduits poly-L-lysine microscope.
- Processus les deux diapositives utilisant le protocole de monoplex (avec tous les dépouiller et étapes de lavage), mais sans addition d’anticorps ou fluorophore.
- Colorer une diapositive au DAPI comme par l’Etape 5,9 et laisser une diapositive non souillées enregistrée (pour la génération du spectre autofluorescence tissulaire).
Remarque : Les lames de monoplex optimisée (avec une teinture de fluorescence unique, sans DAPI) utilisable comme bibliothèque spectrale diapositives pour générer des spectres de chaque colorant de fluorescence.
- Numériser ces ensemble de diapositives à l’aide de filtres appropriés et les télécharger dans la bibliothèque de l’analyse d’images.
7. spectral Imaging
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Numérisation de diapositives monoplex
- Choisir les filtres de filtres disponibles épifluorescente standard (DAPI, FITC, CY3, Texas Red et CY5) appropriés pour le fluorophore indépendant.
Nota : Les cubes de filtre recommandé pour des fluorophores spécifiques utilisés dans cet exemple sont montrées dans le tableau 215. - Examinez chaque marqueur dans son canal de fluorescence correspondant pour identifier un temps d’exposition approprié pour obtenir un signal propre. Mettre l’accent sur la composante tissulaire qui est censé pour avoir le signal le plus fort pour le marqueur.
- Déterminer un temps d’exposition fixe pour chaque analyte (combinaison anticorps-fluorophore), pour permettre une comparaison croisée-échantillon d’intensité pixel (bien que certaines plates-formes commerciales ont des stratégies de normalisation pour tenir compte des différences dans l’exposition).
- Pour statuer sur une durée d’exposition fixe pour une chaîne donnée, utiliser un réglage de la caméra en direct pour régler la durée d’exposition jusqu'à ce qu’il n’y a pas de zones surexposées à l’image de la caméra en direct et répétez cette opération pour tous les canaux.
- Après la numérisation des diapositives monoplex, générer des images de fond clair simulée (si la fonction n’est disponible dans le logiciel utilisé) pour comparer visuellement le modèle normal de l’IHC et déterminer si le modèle de coloration est correct (Figure 1 et Figure 2 de ).
- Choisir les filtres de filtres disponibles épifluorescente standard (DAPI, FITC, CY3, Texas Red et CY5) appropriés pour le fluorophore indépendant.
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Analyse des échantillons de multiplexes (TMA diapositives / échantillons multiples)
- Définir les paramètres optiques tel que décrit pour la numérisation des images monoplex (étape 6.1). En premier lieu, régler la netteté manuellement ou automatiquement (suivez les instructions de l’image spécifique machine à balayage). Deuxièmement, régler le temps d’exposition pour chaque canal fluorescent pour s’assurer que tous les cœurs sur une TMA, ou toutes les zones sur une diapositive, sont correctement exposés.
Remarque : La zone sélectionnée pour ajuster la durée d’exposition est importante. Les utilisateurs doivent choisir la région de signal plus forte pour chaque filtre (c.-à-d.le signal de Ki67 est plus fort dans la région de centre germinatif amygdale que dans la région centre non ; par conséquent, les utilisateurs doivent utiliser la région de centre germinatif fixé à une exposition appropriée temps). Les utilisateurs peuvent adopter également une fonction de correction de sursaturation de l’appareil d’imagerie si elles sont disponibles. - Numériser des diapositives TMA sous un mode balayage TMA s’ils sont disponibles dans le système d’imagerie, avec un algorithme approprié autofocus.
- Pour les lames de section de l’ensemble des tissus, téléchargez les diapositives examinés par un pathologiste qualifié pour sélectionner images optimales dans les zones plus représentatives de la tumeur.
Remarque : Le protocole décrit ici est basé sur un système d’analyse microscope/image définie (voir Table des matières). Il y a des autres machines et logiciels d’analyse image pouvant lire et analyser les multiplex IHC diapositives7.
- Définir les paramètres optiques tel que décrit pour la numérisation des images monoplex (étape 6.1). En premier lieu, régler la netteté manuellement ou automatiquement (suivez les instructions de l’image spécifique machine à balayage). Deuxièmement, régler le temps d’exposition pour chaque canal fluorescent pour s’assurer que tous les cœurs sur une TMA, ou toutes les zones sur une diapositive, sont correctement exposés.
8. analyse des données
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Planification et évaluation préanalytique
- Utilisez la diapositive de référence pour l’autofluorescence pour soustraire l’autofluorescence à partir des images numérisées pour l’analyse.
- Revoir les images avant l’analyse pour s’assurer qu’ils sont en discussion et sans tacher les artefacts.
- Utiliser un marqueur de tumeur (par exemple, CD20 dans cet exemple) pour identifier les cellules d’intérêt et de procéder à la segmentation de la cellule, cotation et analyse de lots s’approche. Sélectionnez les cellules CD20-positifs pour l’analyse.
NOTE : par exemple, dans le LMNH échantillons analysés ici, le réglage et les paramètres définis pour la segmentation cellulaire reposent sur la taille du noyau et d’intensité, mais sont spécifiques au logiciel d’analyse de l’image utilisé (p. ex., un DAPI pixel intensité moyenne d’au moins de 0,05 ; taille entre 80-320 pixels, avec une sensibilité de fractionnement à 2 [il s’agit d’un paramètre de logiciel spécifique qui s’appuie fortement sur la morphologie de la tumeur : pour les cellules de petite tumeur, fractionnement de 0,7 - 1 convient ; pour les cellules tumorales grandes, fractionnement peut être réglé vers le haut à 4]). - Demande d’un pathologiste qualifié d’examiner des images individuelles et de décider si la segmentation de tissu est requise pour sélectionner la cellule tumorale enrichi en régions et exclure les cellules réactives abondante nécrose arearegion orand. Si segmentation de tissu supplémentaire est nécessaire, puis sélectionnez les régions de contrôle approprié (par exemple tumeur cellules/stroma/nécrose) et vérifier que le logiciel d’analyse de l’image peut identifier correctement ces régions
- Aller de l’avant avec la segmentation cellulaire après segmentation du tissu (le cas échéant), demande un pathologiste qualifié pour examiner le plan de segmentation cellulaire pour garantir la fidélité de la segmentation prévue approche5.
- Déterminer la méthode la plus biologiquement/cliniquement appropriée d’analyse pour un biomarqueur donnée d’intérêt (par exemple, pourcentage de positivité ou moyenne intensité par cellule).
- Choisir une valeur de seuil pour chaque marqueur (par pourcentage de positivité).
- Déterminer la valeur de seuil positif d’intensité optique pour chaque marqueur en conjonction avec un pathologiste. Générer des histogrammes en analysant la distribution des fréquences de la cellule/intensité de marqueur dans le logiciel de statistiques appropriées (voir Table des matières).
Remarque : Un histogramme de valeur d’intensité peut offrir un aperçu de la distribution des intensités du signal. - Déterminer un seuil approximatif de l’histogramme et le vérifier par un examen du pathologiste, en corrélation avec les seuils déterminés manuellement sur des images sélectionnées. Dans certaines situations, un seuil unique uniform ne sera pas possible en raison de la variabilité dans la coloration, et il faudra une valeur de coupure manuelle pour chaque échantillon.
NOTE : L’article 8.1 se fasse dans le logiciel d’analyse image (voir la Table des matières) sauf indication contraire.
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Marquage des cellules positives et négatives
- Pour chaque marqueur d’intérêt, selon le nombre de seuil déterminé (à travers des histogrammes ou manuellement), utiliser un « IF » ou formule logique similaire pour marquer les cellules positives et négatives avec marqué valeur : numéro 1 pour les cellules positives, numéro 0 pour les cellules négatives.
- La positivité de tous les marqueurs, multipliez la valeur nette de chaque marqueur (1 ou 0) avec les produits dans des colonnes distinctes. Si le produit est égal à 1, cela signifie que la cellule est positive pour tous les marqueurs. Pour la positivité et négativité d’un marqueur spécifique, utilisez un algorithme de logique IF.
NOTE : L’article 8.2 doit être fait dans les logiciels de statistiques (voir Table des matières).
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Générer des données de pourcentage et de données numériques à l’aide d’un tableau croisé dynamique
- Générer des données de pourcentage pour des marqueurs spécifiques d’intérêt, au sein des cellules déterminées (par exemple, CD20 positif de cellules ou cellules négatives CD20) (Figure 6).
- Insérer un tableau croisé dynamique dans la feuille de données.
- Pour calculer le pourcentage de positivité d’un seul marqueur, comme CD20, sélectionnez la fonction somme en vertu de la partie de la valeur du tableau croisé dynamique pour compter le nombre total de cellules CD20-positifs à l’aide de la somme de la CD20+ cellules divisé par la nombre total de cellules. Le résultat est le CD20+ cellule pourcentage dans une carotte ou une étude nombre (dépend de la sélection de la ligne de table pivot).
- Calculer le pourcentage de positivité des marqueurs multiples en utilisant la même méthode (Figure 3).
- Générer des données numériques. Extrait le nombre normalisé médian pour chaque marqueur de chaque carotte ou le numéro de chaque étude en obtenant l’intensité moyenne de chaque marqueur d’intérêt dans toutes les cellules étudiées dans un échantillon (Figure 4).
Remarque : La valeur médiane ne peuvent pas être dérivée directement dans le tableau croisé dynamique. Il peut être dérivé à l’aide de cette formule : médiane (IF (colonne d’étude nombre = nombre d’étude spécifique, colonne de valeur normalisée)).
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Tracer les données dans un graphique approprié
- Tracer les résultats du pourcentage de positivité ou médiane intensité par marqueur dans un type de cellule d’intérêt de manière appropriée pour les autres analyses statistiques et de présentation.
- Créer des emplacements de point de fournir une visualisation du nombre et de la distribution.
NOTE : Qui représentent des données avec des graphiques à barres n’implique pas d’informations sur la distribution. Estimation de parcelles sont aussi recommandés une bonne méthode de représentation des données, en mettant l’accent sur l’ampleur de la différence entre les échantillons16.
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Representative Results
MF-IHC image pour un échantillon de LMNH avec C-MYC et réarrangement génique de BCL2 (double-hit lymphome) sont affichées à la Figure 1. La figure 2 illustre les images simulées lumineux-zone immunohistochimique. La figure 3 indique la génération des données de pourcentage. La figure 4 affiche les détails d’une formule médiane pour la génération de données numériques. Figure 5 illustre l’application de mf-IHC d’un groupe de cellules T dans les lymphomes de lymphocytes angioimmunoblastic. La figure 6 montre l’image de l’optimisation de l’échantillon de contrôle amygdale et de l’analyse des données de cet exemple.
Figure 1 : B-cell multiplexés images panneau immunofluorescence d’un diffuse large échantillon de lymphome (LMNH) B-cellule avec réarrangement de gène C-MYC et CL2 (double-hit, lymphome). Magenta = CD20 (membrane) ; blanc = BCL2 (cytoplasme) ; jaune = Ki67 (nucléaire) ; vert = C-MYC (nucléaire) ; rouge = BCL6 (nucléaire), bleu = DAPI (contre-colorant nucléaire). Les cellules tumorales CD20-positifs montrent une forte expression de C-MYC (80 %) et BCL2 (> 90 %), et l’indice de prolifération Ki67 est aussi élevé (90 %). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : simulé des images lumineuses-champ immunohistochimique (générés à partir de la Figure 1) du même échantillon LMNH avec C-MYC et BCL2 réarrangement génique (double-hit lymphome). CD20 montre membrane coloration dans les cellules tumorales. Bcl2 montre cytoplasme coloration à > 90 % des cellules tumorales. C-MYC positivité est d’environ 80 %. BCL6 montre nucléaire coloration chez environ 20 % des cellules. Ki67 est positive dans 90 % des cellules. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : tableau croisé dynamique indiquant comment générer des données de pourcentage selon étude nombre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : formule de la médiane pour la valeur normalisée de Ki67 OD selon étude nombre. L’instruction IF trouve tous les nombres de l’étude qui sont égaux à un certain nombre d’étude spécifique (c'est-à-dire 52 dans cette figure). Il renvoie ensuite la valeur correspondante de Ki67 normalisé . Ctrl + Maj + Enter les combinaisons de touches peuvent être utilisés pour calculer la médiane (Median Ki67) pour ces valeurs retournées, qui est 11,56 pour étude numéro 52. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : multiplexés images panneau immunofluorescence pour obtenir un exemple angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL). (A), l’image composite montre l’hétérogénéité cellulaire d’un échantillon AITL. Magenta = CD20 (membrane) ; jaune = CD4 (membrane) ; vert = PD1 (membrane) ; rouge = BCL6 (nucléaire) ; cyan = CD8 (membrane) ; bleu = DAPI (contre-colorant nucléaire). (B) la rangée supérieure des images montre une vue agrandie de la région sélectionnée dans la boîte blanche dans le groupe A. La rangée inférieure des images montre correspondantes segmenté masques de cellule : jaune/rouge/vert montrant les cellules CD4/BCL6/PD1-positif, respectivement. Bleu représente les cellules négatives et blanc indique les cellules positives double. Les images révèlent que 50 % des CD4+ cellules sont PD1+ (gauche, blanc), alors que 20 % de CD4+ cellules sont également positifs pour BCL6 (milieu, blanc). Le taux de positivité double pour PD1 et BCL6 est d’environ 10 % (droit, blanc). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : multiplexés images optimisation immunofluorescence pour tissu témoin amygdale. (A), l’image composite montre la zone de centre germinatif d’un échantillon de contrôle amygdale. Jaune = C-Myc (nucléaire) ; rouge = BCL6 (nucléaire) ; cyan = BCL2 (cytoplasme) ; Magenta = CD20 (membrane) ; vert = Ki67 (nucléaire) ; bleu = DAPI (contre-colorant nucléaire). C-Myc est positive que dans quelques cellules. BCL6 et Ki67 sont positifs principalement dans le centre germinatif, BCL2 est un progrès, principalement en dehors du centre germinatif. CD20 est diffusément positive à l’intérieur et à l’extérieur du centre germinatif. (B), le tableau montre que les cellules de centre germinatif CD20-positifs sont également positives pour BCL6 et Ki67 mais négatif pour BCL2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Séquence d’anticorps | L’anticorps primaire (voir table des matières) | HIER total requis | Tache de réelles avant HIER | Anticorps secondaire | Fluorophore | Post-TSA anticorps décapage |
| 1 | Anti souris-Bcl6 (01:30, 60 min RT) | 25minutes, Ph9 | 25minutes, Ph9 | HRP-conjugués anti-souris, 1/1000 ' à 10' | OPALE Cy5 au 1/100 | 1 tour 100 % de puissance 1 min, puissance de 20 % pendant 10min |
| 2 | La souris anti-Bcl2(1:50,60 min RT) | 25minutes, Ph9 | Aucun | HRP-conjugués anti-souris, 1/1000 ' à 10' | OPALE 520 à 1/100 | 1 tour 100 % de puissance 1 min, puissance de 20 % pendant 10min |
| 3 | Lapin anti-c-MYC(1:50,30 min RT) | 25minutes, Ph9 | Aucun | HRP-conjugués anti-lapin, 1/1000 ' à 10' | OPALE 570 à 1/100 | 1 tour 100 % de puissance 1 min, puissance de 20 % pendant 10min |
| 4 | La souris anti-CD20(1:2000,30 min RT) | 25minutes, Ph9 | Aucun | HRP-conjugués anti-souris, 1/1000 ' à 10' | OPALE 540 à 1/100 | 1 tour 100 % de puissance 1 min, puissance de 20 % pendant 10min |
| 5 | La souris anti-Ki-67(1:50,45 min RT) | 30minutes, Ph9 | 5 minutes pH9 | HRP-conjugués anti-souris, 1/1000 ' à 10' | OPAL 620 à 1/100 | 1 tour 100 % de puissance 1 min, puissance de 20 % pendant 10min |
Tableau 1 : exemple d’une mise en page finalisée pour multiplex si coloration. Ce tableau fournit un exemple de la façon de spécifier la quantité d’HIER et axée sur les micro-ondes décapage se fait à chaque étape, une fois que les taches de monoplex ont été optimisés.
Tableau 2 : Guide pour la sélection du filtre pour fluorophores. Ce tableau vous propose un petit guide vers des filtres appropriés qui permet de visualiser les fluorophores d’intérêt sur certains équipements. Il est recommandé de vérifier les spécifications de filtre du microscope utilisé en relation avec le profil d’émission/excitation des fluorophores utilisés.
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Discussion
MF-IHC a le potentiel pour permettre des pathologistes d’affiner diagnosticcriteria en pathologie lymphoïde et d’analyser le rôle des biomarqueurs dans les types spécifiques de cellules vers une prévision des résultats cliniques. Comme une nouvelle méthode de recherche, mf-IHC est plus appliquée à la détermination quantitative et spatiale des multiples paramètres immunitaires des cellules de tumeur17. La détection de mf-IHC pour la co-expression de biomarqueurs de la tumeur s’est avérée être fiable et reproductible5. Toutefois, la technologie reste naissante et soumis à la variabilité découlant de réactif - et/ou des facteurs axés sur les tissus, tels que ceux en raison du manque d’uniformité dans le traitement et la fixation du tissu.
Critique de la technique est l’utilisation d’anticorps bien validées spécifiques, sensibles et donnent des résultats reproductibles. Il y a des exemples dans la littérature des anticorps initialement décrit pour être plus précis pour leurs antigènes et par la suite démontré que reconnaissent des protéines non reliées au moyen de modèles knock-out14. La méthode de validation knock out / précipitation dans laquelle sauvage ou les cellules avec des antigènes surexprimée servent comme témoins positifs tandis que les cellules cibles assommé ou renversé par les siARN ou méthodes CRISPR sont utilisés comme témoins négatifs.
Comme le classique IHC, mf-IHC a plusieurs variables critiques nécessitant d’être optimisé pour chaque expérience, pour une coloration optimale et des résultats. Il s’agit du pH de la solution de l’antigène, la dilution de l’anticorps, l’affectation d’un fluorophore à chaque marqueur et la concentration du fluorophore. Les solutions de récupération de l’antigène couramment utilisés sont de pH 6 et 9. Il est intéressant de tester quel pH donne le patron de coloration optimale et l’intensité avec moins de fond.
Il n’y a pas de lignes directrices spécifiques pour décider sur la séquence de demande d’anticorps dans l’expérience de multiplex, car elle dépend non seulement de l’affinité de l’anticorps, mais aussi sur la force des fluorophores opale. En général, avec une faible affinité des anticorps souvent nécessitent des concentrations plus élevées, basées sur la coloration à le monoplex et sont appliquées en premier dans la séquence multiplexe. Anticorps de forte affinité qui sont susceptibles de s’opposer au décapage sont appliqués en dernier, pour éviter la coloration non spécifique. En ce qui concerne le choix d’un fluorophore spécifique, il est préférable d’éviter d’utiliser des fluorophores avec des longueurs d’onde spectrales semblables pour les antigènes qui sont colocalisées dans les mêmes compartiments cellulaires. Et les plus brillants fluorophores et vice versasont attribués aux antigènes avec les niveaux d’expression faible. Si, dans l’échantillon de l’étude, l’intensité du signal est faible, réglage de la dilution de TSA opale peut être fait pour atteindre le signal désiré18. Dans certains cas, essayer les méthodes de récupération différents antigènes ou augmentation de la concentration d’anticorps primaire peut fonctionner. La dilution initiale de l’anticorps primaire peut être identique à celui établi dans une expérience classique de IHC. Toutefois, si le signal IF n’est ne pas claire, l’essai d’autres dilutions anticorps devra, comme les conditions optimisées pour IHC n’est toujours pas traduisent en IF. Intensité du signal est affectée par l’ordre ou la séquence d’immunomarquage. Certains épitopes sont surexposés après deux ou trois tours de MWT, tandis que certains peuvent se dégrader en raison de l’excès MWT. Certains fluorophores peut également être affectées par MWT et doivent être testés pour l’atténuation.
Ce protocole met l’accent sur la colocalisation et la mesure de l’intensité des marqueurs dans les sous-ensembles des cellules dans un lymphome malin B. Les principaux enjeux de l’élaboration du protocole actuel impliquent la génération d’un panneau de multiplex optimisée pour les antigènes qui sont colocalisées dans les mêmes compartiments cellulaires. Il faut faire une déconvolution précis des fluorophores pour une quantification précise. Une fois le panneau multiplex est en place, l’imagerie des lames colorées est relativement simple. La prochaine étape consiste à l’analyse des données imagées. Contrairement aux études immunitaire infiltration, où la quantification des types de cellules immunitaires spécifiques au sein d’une tumeur épithéliale est simple, études de colocalisation des lymphomes s’appuient fortement sur la définition de la positivité par un pathologiste formé pour chaque marqueur de intérêt. Dérivant à un seuil de diagnostic approprié qui peut être appliqué à la pratique clinique de routine reste un work in progress. Autres améliorations dans les méthodes de normalisation des données et de la triangulation de coupure automatique sera nécessaires avant que cette technique peut être intégrée dans le diagnostic de routine.
Malgré les limites actuelles, les applications potentielles du mf-IHC et les connaissances qui peuvent être tirées de l’étude des cellules tumorales et leur relation spatiale avec le microenvironnement en font un outil attrayant, surtout pour contester histologique cancers tels que les tumeurs malignes lymphoïdes. Travaux supplémentaires sont nécessaires pour établir des protocoles dans le traitement de tissus qui sont optimales pour le flux de travail proposé, mais aussi une amélioration dans la coloration des techniques, permettant l’analyse simultanée d’un augmentation du nombre de cibles et de fixation du tissu.
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Disclosures
A.D.J. a reçu un financement de PerkinElmer vers voyage aux réunions de groupe d’utilisateurs. Les auteurs n’ont aucun autre conflit d’intérêt à divulguer.
Acknowledgments
S.-B.N. et A.D.J. sont pris en charge par nationale médicale recherche Conseil Transition Awards le Singapour ministère de la santé (NMRC/TA/0020/2013 et NMRC/TA/0052/2016). Les auteurs reconnaissent une subvention de recherche de Yoon Yong Siew à A.D.J. de l’Université nationale du Cancer Institut de Singapour pour l’achat d’un microscope d’imagerie spectral de Vectra. Cette étude est approuvée par le Singapore NHG domaine spécifique Review Board B (2014/00693).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
References
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