Summary
Her beskriver vi en protokoll for multiplex fluorescerende immunohistochemical flekker og tenkelig den samtidige lokalisering av flere kreft-assosiert antigener i lymfom. Denne protokollen kan utvides til colocalization analyse av biomarkers i alle vev inndelinger.
Abstract
Immunohistochemical (IHC) metoder for på plass analyse av protein uttrykk av * lys er et kraftig verktøy for både forskning og diagnostiske formål. Men er visualisering og kvantifisering av flere antigener i et enkelt vev delen bruker konvensjonelle kromogent IHC utfordrende. Multiplex imaging er spesielt relevant i lymfom forskning og diagnostikk, der markører må tolkes i sammenheng med en kompleks svulst microenvironment. Her beskriver vi en protokoll for multiplex fluorescerende IHC flekker for å aktivere kvantitativ vurdering av flere mål i spesifikke celletyper interesse for lymfom. Metoden dekker aspekter av antistoff validering, antistoff optimalisering, multiplex optimalisering med markører av lymfom subtyper, farging av vev microarray (TMA) lysbilder og skanning av lysbildene, etterfulgt av dataanalyse, med bestemt Referanse til lymfom. Bruker denne metoden, genereres score for både bety intensiteten på en markør av interesse og prosent positivitet for å lette videre kvantitativ analyse. Multiplexing minimerer eksempel utnyttelse og gir romlig informasjon for hver indikator.
Introduction
Lymfoide neoplasms skyldes ukontrollert ondartet spredning av lymfocytter. Disse cellene er avgjørende komponenter i immunsystemet og lokalisere til de primære og sekundære immun organene, som benmargen, lymfeknuter, milt og andre mucosa-assosiert lymfoid systemet. Lymfoide svulster er en heterogen gruppe lidelser som klassifiseres basert på en konstellasjon av funksjoner, inkludert morfologi, immunophenotype, særtrekk og kliniske presentasjonen. Mens hver parameter spiller en rolle, avstamning forblir et definerende trekk og danner grunnlaget for WHO klassifikasjonssystem som gjenkjenner neoplasms avledet fra B-celler og T celler naturlig killer (NK) celler1.
Nøkkelen til klassifisering av lymphoma er karakterisering av antistoffer mot leukocytter overflate markører av ulike undertypene av lymfocytter2. Immunohistochemistry (IHC) har vært tradisjonelt brukes for analyse av slike indikatorer og er basert på prinsippet om spesifikt antigen-antistoff anerkjennelse å oppdage celle - og vev-basert molekyler som kan bli visualisert gjennom lys mikroskopet 3. identifikasjon av flere mål på ett lysbilde av konvensjonelle lys-feltet kromogent multiplex IHC har imidlertid begrensninger fordi det er vanskelig å skille flere fargesignaler på en enkelt vev delen pålitelig-spesielt for antigener med en svært lav uttrykk4. Visuell vurdering og kvantifisering av flekker kan også være subjektive, forårsaker variasjon i analysen og data tolkning5.
Konvensjonelle IHC på formalin-fast, parafin-embedded (FFPE) prøver er derfor ikke mulig for samtidige påvisning av flere mål i immunologisk ulike sykdommer som lymfom. Videre er skille neoplastic lymfocytter fra omkringliggende immunceller ofte upresis. Dette hindrer studier ser på relevansen av romanen biomarkers i lymfom. I denne sammenheng multiplex fluorescerende IHC (mf-IHC) tilbyr en lovende alternativ som det tillater kvantitativ vurdering av antigen coexpression og et romlige forhold med høyere presisjon mens bevaring begrenset prøver6,7. Når denne bildeteknologi er partner med digitalt bilde analyseprogramvare, data tolkningen gjøres mer effektiv og muliggjør studiet av svulsten og microenvironment heterogenitet8,9. I denne protokollen, en tyramide-baserte immunofluorescence (hvis) multipleksing metoden brukes til å forsterke signalet og er kompatibel med noen IHC-godkjent antistoff fra alle vert Art, selv de som er utviklet i samme arter5,7 , 10. tyramide-baserte protokollen tillater direkte Bøyning av fluorophore til vev rundt slik at det primære og sekundære antistoffet kan monteres etter hvert trinn, slik at for sekvensiell anvendelse av flere flekker uten antistoff kryssreaktivitet.
En multiplex strategi vil være nyttig for utstråling prognose og behandling ved å identifisere mål og deres variant immunologic mønstre i lymfomer. Multiplex fluorescerende IHC har vært brukt i vår lab for studier av et panel av T- og B-lymfocytt markører og T-follicular hjelper markører i angioimmunoblastic T-celle lymfom (AITL), en undertype av en ekstern T-celle lymfom preget av aggressiv klinisk atferd og tumor heterogenitet11. Nytten av denne metoden er også illustrert i diffus stor B-celle lymfom (DLBCL) der den økte signalene med en B-celle reseptor med samtidige C-MYC og BCL-2 uttrykket antyder den potensielle terapeutiske bruken av Brutons tyrosin kinase hemming 12 .
Beskriver her vi hele protokollen fra antistoff godkjenningen til valg av aktuelle kontrollen vev og multipleksing bruker lymfom FFPE vev, med en eventuell analyse av farget lysbilder ved hjelp av en skanning automatisert kvantitative patologi bildebehandling system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle vev som er brukt i denne protokollen ble innhentet under Singapore NHG domene spesifikk gjennomgang styret B studier 2014/00693.
1. valg og validering av antistoffer
Merk: Før du fortsetter med etableringen av et multiplex panel, sikre at alle antistoffer flekker robust, identifisere bare målet antigen rundt. Målet er å velge antistoffer som spesifikt gjenkjenner antigenet interesse vev deler.
- For et antistoff med veletablerte forskningsbruk eller rutinemessige klinisk bruk i IHC, Bekreft forhold som epitope henting og antistoff fortynning ved å utføre konvensjonelle IHC5,13 på positive og negative kontroll vev inndelinger. I vev deler av menneskets opprinnelse, sørge for at riktig etikk klaringen er på plass før starte eksperimenter.
Merk: Positiv kontroller er vev som forventes å uttrykke antigen rundt, og negative kontroller er som. Godartet mandel vev er valgt som en god vev for lymfom antigener fordi den inneholder en blanding av immunceller inkludert B celler, T-celler, og antigen presentere celler, samt stromal og epithelial celler. Sistnevnte tjene som nyttige negative internkontroll. - Ukjent mål eller kommersielle antistoffer med utilstrekkelig publiserte data, utføre antistoff validering ved å opprette matchet positiv og negativ kontroll FFPE celle blokkerer14, CRISPR bank-out eller siRNA sammenleggbare av antigen rundt i en aktuelle cellen linje gjennom standard molekylærbiologi teknikker. Bruk disse FFPE celleblokker i stedet for positive og negative kontroll vev for konvensjonelle IHC per trinn 1.1.
Merk: Jakten eller 293T celler brukes vanligvis for antigener som ikke celle-type spesifikke, som lymfom cellelinjer er vanskelig å transfect. For antigener som lymfocytter bestemt, kan lymfom cellelinjer brukes med viral signaltransduksjon eller electroporation som modus av gen levering (riktignok med lav effekt).
2. planlegge sekvensen av antistoffer og Fluorophores Multiplex panelet
- Planlegge en rekke reagensene den endelige multiplex flekker. For eksempel ble her rekkefølgen for multiplex protokollen opprinnelig planlagt som første, Bcl-6; andre, Bcl-2; tredje, C-Myc; fjerde, CD20; femte, Ki67.
Merk: For å bestemme rekkefølgen, antistoffer med en svak affinitet krever høyere konsentrasjoner bør være beiset først i den endelige multiplex flekker. Høy affinitet antistoffer som er sannsynlig å være resistente mot flere runder med mikrobølgeovn stripping brukes sist i multiplex protokollen for å unngå uspesifikke flekker. - Planlegge fluorophore partneren for hver antistoff i panelet. Se tabell 1 og Tabell for materiale for valgene i dette eksemplet.
Merk: For å bestemme den fluorophore partneren for hver antistoff, velge spectrally forskjellige fluorophores for antistoffer med lignende mønstre av lokalisering cellen og vev. Dette vil minimere spectral overlapping og problemer med unmixing.
3. Monoplex Tyramide-basert i et simulert 5-plex Multiplex Panel
Merk: I dette eksemplet protokollen for CD20 diskuteres, som er planlagt som fjerde antistoffer i en multiplex beskrevet ovenfor. Antall stripping tilleggstrinn forskjellig for plasseringen av antistoffer i sekvensen.
- Skjær 3 µm-tynne deler av positive og negative kontroll tissue benytter en mikrotom og plasserer delene på poly-L-lysin-belagt glass objektglass.
- Dewax inndelinger ved hjelp av en passende clearing løsning 3 x for 4 min. Rehydrate lysbildene i 100% alkohol, 90% alkohol og 70% alkohol, 4 min. Satt lysbilder i destillert vann i 2-3 minutter.
- Sted lysbildene i en mikrobølgeovn-safe glasskrukke i en standard antigen henting buffer (kommersielt tilgjengelig) for å fordype lysbildene. Utføre varme-indusert epitope henting (HIER) med egnet mikrobølgeovn, i pH9 antigen henting løsning på 98 ° C for 25 min.
Merk: Noen mikrobølgeovn med presset fra 800-1100 watt kan brukes, og HIER kan optimaliseres tilsvarende. I dette tilfellet ble en multifunksjonell mikrobølgeovn basert vevsprosessor (åpen til luft) brukt for HIER og stripping. Startinnstillingene for henting av en bestemt epitope er basert på den tidligere kunnskapen fra konvensjonelle IHC. - Utføre flere runder med mikrobølgeovn stripping (tre i dette tilfellet fjerde antistoffer i et panel), hver runde med 100% makt til 98 ° C og 20% strøm til 10 min å opprettholde ved samme temperatur. Avkjøl lysbildene i destillert vann i minst 10 min.
Merk: Utfør flere runder med mikrobølgeovn stripping under monoplex hvis foranstaltningen å utsette målet antigen til samme antall oppvarming trinnene som foreslåtte multipleks. Siden CD20 er planlagt som fjerde antistoffer, mikrobølgeovn stripping 3 x før og en gang etter den primære antistoff inkubering. - Kontroller og fylle bufferen etter hver 5 min under flere mikrobølgeovn stripping. Viktigere, ikke la lysbilder tørke ut under flere stripping prosedyrene. Når du tar lysbildene av mikrobølgeovn, bruk tang og varmebestandig hansker for å plassere dem i en egen krukke med destillert vann. Vent til antigen henting løsningen å avkjøle naturlig.
- Blokkere vev peroxidase aktiviteten ved å bruke en kommersiell peroxidase blokk 10 min (3% hydrogenperoksid kan brukes som en alternativ reagens). Vask med Tris-bufret saltvann (SS) og en ikke-ionisert vaskemiddel i 5 min.
Merk: Ss består av 50 mM Tris-Cl, pH 7.5 og 150 mM NaCl.TBS å gjøre SS-D. - Blokk med antistoff fortynner eller storfe serum albumin i 15 min etterfulgt av inkubasjon med det primære antistoffet av interesse (f.eksCD20, 1:2,000 fortynning i antistoff fortynningsmiddel, se Tabellen for materiale) ved romtemperatur for 30 min. vaske 3 x med TBS-D bufferen for 5 min hver gang. Det bør være tilstrekkelig TBS-D buffer å fordype lysbildet helt i alle vask skritt.
Merk: Bovine serum albumin kan brukes som et alternativ antistoff fortynner. Volumet av antistoff fortynner avhenger av størrelsen på vevet, mellom 50 µL (for biopsi prøver) 400 µL (for excision prøver eller microarray vevsprøver). - Inkuber med en passende pepperrotperoksidase (HRP)-merket sekundære antistoff, valgt på grunnlag av arten av opprinnelsen til primære antistoffer i 15 min ved romtemperatur. Vask 3 x med SS-D bufferen for 5 min hver gang.
- Bruke en riktig tyramide-baserte fluorescerende reagens (1: 100 i forsterkning fortynningsmiddel) og ruge ved romtemperatur for 5 min, for å tillate fluorophore Bøyning til vev prøven på nettsteder av primære antistoff binding. Vask 3 x med SS-D bufferen for 5 min hver gang.
- Utføre en ekstra mikrobølgeovn-baserte stripping for å fjerne de primære og sekundære antistoffet. Gjenta etter behov basert på plasseringen av antistoffer i sekvensen.
- Sett lysbildet i destillert vann avkjølt. Inkuber med DAPI (1: 100 fortynning i antistoff fortynner) i 10 min, etterfulgt av vask 3 x med SS-D bufferen for 5 min hver gang. Tørr området på lysbildet uten vevet med våtservietter og montere lysbildet med riktig montering media.
- Bilde lysbildet (se avsnittene 6 og 7 i denne protokollen) og fastslå hensiktsmessigheten av den flekker (som definert av klar diskriminering av positive og negative kontroll vev).
Merk: Hvis flekker mønsteret er feil, gjøre om monoplex flekker etter justere ett eller flere av følgende parametere: antall varme henting trinn, hvor mye varme henting, inkubering periode/konsentrasjonen av antistoffer (primær og sekundær), plasseringen av antistoff i sekvensen, og valg av fluorophore. Monoplex flekker trinn vanligvis krever flere runder med optimalisering å få et passende sett med parametere for aktuelle flekker. Det er lurt å teste en rekke fluorophores med hver primære antistoff, som dette vil gi fleksibilitet i å avgjøre den endelige multiplex settet.
4. repetisjon av Monoplex for hver antistoff Multiplex protokollen
- Gjenta monoplex farging for andre antistoffer i en lignende måte ved å justere antall mikrobølgeovn stripping trinn, basert på plasseringen av antistoffer i sekvensen. For eksempel når du utfører monoplex flekker tredje antistoffer i en seks-plex multiplex panel, utføre to mikrobølgeovn stripping trinn før og tre mikrobølgeovn stripping trinn etter den primære antistoff inkubering.
Merk: Det er viktig å verdsette at mikrobølgeovn-baserte stripping av antistoffer også avslører prøve å HIER. Hvis et spesifikt antistoff krever en annen epitope henting strategi, må dette tas i betraktning når du planlegger multiplex sekvensen. I dette eksemplet krever Ki67 epitope henting pH 9, for 30 min. Siden 25 min av HIER foretas før KI67 farging i sekvensielle protokoll, bare en ekstra 5 minutter av HIER er nødvendig.
5. multipleks flekker protokollen
Merk: Fortsett med multipleks flekker protokollen bare når alle komponentene har blitt optimalisert med monoplex hvis flekker. Gå gjennom resultatene av den monoplex flekker og tabellen viser siste oppsettet av multipleks og valg av fluorophore for hver antistoff. Detaljene av antistoff konsentrasjon, varigheten av flekker, og den rekkefølgen og typen varme henting for hver antistoff her er gitt i tabell 1.
- Klipp 3 µm-tynne deler av positive og negative kontroll vev, så vel som vevet rundt (her, FFPE prøver lymfom), bruker du en mikrotom, og plasserer delene på poly-L-lysin-belagt glass objektglass (se Tabell for materiale).
Merk: Inkludering av positive og negative kontroller for hver antistoff i panelet er tilrådelig, sammen med de faktiske eksemplene for multipleks. Dette gir en bekreftelse på at fargeprotokoll ble utført riktig. - Dewax, utføre varme-indusert epitope henting (HIER) og blokkere vev peroxidase aktivitet som monoplex protokollen trinnene 3.3-3,5.
- Inkuber med det første primære antistoffet av optimalisert multiplex sekvensen, som tidligere bestemmes ved hjelp av monoplex Hvis trinn. I dette eksemplet BCL-6, på en 1:30 fortynning i antistoff fortynningsmiddel ved romtemperatur for 60 min (se Tabell for materiale), var det første skrittet av multiplex-protokollen. Vask med SS-D bufferen for 5 min.
- Inkuber med et passende HRP-merkede sekundære antistoff basert på arten av primære antistoffer brukt i tidligere trinn (se Tabell for materiale) ved romtemperatur for 10 min. vask med SS-D bufferen for 5 min.
- Bruke optimalisert tyramide-baserte fluorescerende reagensen (Cy5 i dette eksemplet 1: 100 i forsterkning fortynningsmiddel, se Tabellen for materiale) med inkubering ved romtemperatur for 5 min. Inkubasjon vaskes med SS-D bufferen for 5 min.
Merk: Valg av tyramide-baserte fluorescerende reagensen er basert på den optimaliserte monoplex om. - Kontrollere effektiviteten av farging av første antistoffer ved hjelp av en passende mikroskopet (se Tabell for materiale).
Merk: Midlertidig imaging sjekker kan gjøres enkelt hvis prøven er en TMA eller ett lysbilde. Hvis imidlertid flekken blir utført på flere lysbilder, dette kan være upraktisk, og dette trinnet kan utelates. - Utføre mikrobølgeovn stripping andre antistoffer i protokollen, betingelser optimalisert i monoplex trinn. Deretter fortsette med den flekker av andre primære antistoffer (her, BCL2) med HRP-merkede sekundære antistoff og tyramide-baserte fluorescerende reagens (her 520, se Tabellen for materiale). Kontrollere effektiviteten av flekker under fluorescerende mikroskop etter ferdigstillelse av den andre runden av flekker.
- Tilsvarende gjenta med tredje, fjerde, og femte antistoffer i rekkefølge (her, c-Myc, CD20 og ki67, henholdsvis med fluorophores 570 540 og 620, henholdsvis). Utføre tenkelig kontroller mellom hvert trinn hvis mulig.
- Legg en kjernefysisk counterstain (DAPI, 1: 100 fortynning i antistoff fortynningsmiddel) på 10 min og deretter vaske 2 x i SS-D i 5 minutter.
- Montere lysbildene bruker et riktig montering reagens.
6. forberedelse Spectral biblioteket lysbilder
Merk: Avsnitt 6-8 i denne protokollen er unike for multiplex eksperimenter som er avbildet med en spektral kamera.
- Opprette biblioteket lysbilder (single-flekken referanse bilder) for hver fluorophore, DAPI og autofluorescence på samme kontroll vev, som skal brukes for multispectral bildeanalyser.
- Klipp 2 x 3 µm-tynne snitt av vev interesse (her, et lymfom utvalg eller en mandel som kontroll) bruker en mikrotom og plasserer delene på poly-L-lysin-belagt glass objektglass.
- Prosessen både lysbilder ved hjelp av monoplex-protokollen (med alle stripping og vaske trinn), men uten antistoff eller fluorophore tillegg.
- Stain ett lysbilde med DAPI per trinn 5.9 og la ett lysbilde unstained kvinne (for generering av vev autofluorescence spektrum).
Merk: Optimalisert monoplex lysbilder (med en enkelt fluorescens fargestoff, uten DAPI) kan brukes som spectral biblioteket lysbilder for å generere spektra av hver fluorescens fargestoff.
- Skanne disse sett av lysbilder ved hjelp av riktig filtre og laste dem inn analyse bildebiblioteket.
7. spectral Imaging
-
Skanning monoplex lysbilder
- Velg filtrene tilgjengelig standard epi-fluorescens filtre (DAPI, FITC, CY3, Texas rød og CY5) passer til den næringsdrivende fluorophore.
Merk: De anbefalte filter kubene for bestemte fluorophores i dette eksemplet bruker vises i tabell 215. - Undersøke hver merketråd i sine tilsvarende fluorescens kanal å identifisere en passende eksponeringstid å få en ren signal. Fokus på vev komponenten som skal ha det sterkeste signalet for markøren.
- Finne en fast eksponeringstid for hver analytt (antistoff-fluorophore kombinasjon), tillate tvers utvalg sammenligning av pixel intensitet (men noen kommersielle plattformer har normalisering strategier hensyn til forskjeller i eksponering).
- For å bestemme en angitt eksponeringstid for en bestemt kanal, bruk en live kamera innstillingen til å justere eksponeringstid før det er ingen overeksponert områder i live kamerabildet, og gjenta dette for alle kanaler.
- Etter skanning monoplex lysbilder, generere simulert brightfield bilder (Hvis funksjonen er tilgjengelig i programvaren brukes) visuelt sammenligne med normal IHC mønster og finne ut om flekker mønsteret er riktig (figur 1 og figur 2 ).
- Velg filtrene tilgjengelig standard epi-fluorescens filtre (DAPI, FITC, CY3, Texas rød og CY5) passer til den næringsdrivende fluorophore.
-
Skanning multiplex prøver (TMA lysbilder / flere eksempler)
- Angi parametrene optisk som skanne monoplex bilder (trinn 6.1). Først justere fokus manuelt eller automatisk (Følg instruksjonene på det bestemte bildet skanning maskinen). For det andre, justere eksponeringstid for hver fluorescerende kanal å sikre at alle kjernene på en TMA eller alle områder på et lysbilde, vises riktig.
Merk: Markert justere eksponeringstiden er viktig. Brukere må velge sterkeste signalet området for hvert filter (dvs.Ki67 signalet er sterkere i mandel germinal sentrum regionen enn i regionen nongerminal center, derfor brukere bør bruke regionen germinal sentrum ligger ved en riktig eksponering tid). Brukere kan også ta en oversaturation korreksjon funksjon av tenkelig system hvis tilgjengelig. - Skanne TMA lysbildene under en TMA-skanningsmodus hvis det tenkelig systemet, med en passende autofokus algoritme.
- Hele-vev delen lysbilder, få lysbilder gjennomgått av en kvalifisert patologen velge optimale bilder fra de mest representative svulst områdene.
Merk: Protokollen beskrevet her er basert på et definert mikroskop/bilde analysesystem (se Tabell for materiale). Det er andre maskiner og analyseprogramvare som kan skanne og analysere multiplex IHC lysbilder7.
- Angi parametrene optisk som skanne monoplex bilder (trinn 6.1). Først justere fokus manuelt eller automatisk (Følg instruksjonene på det bestemte bildet skanning maskinen). For det andre, justere eksponeringstid for hver fluorescerende kanal å sikre at alle kjernene på en TMA eller alle områder på et lysbilde, vises riktig.
8. analyse
-
Preanalysis vurdering og planlegging
- Bruk referanse lysbildet for autofluorescence å trekke autofluorescence fra bilder som er skannet for analyse.
- Se bildene før analyse for å sikre at de er i fokus og uten flekker gjenstander.
- Bruke en svulst markør (f.eksCD20 i dette eksemplet) til å identifisere celler av interesse og for å fortsette med cellen segmentering, scoring og satsvis analyse tilnærminger. Velg CD20-positive celler for analyse.
Merk: For eksempel i DLBCL prøver analysert her, den innstillingen og parametere som er definert for cellen segmentering er basert på kjernefysisk størrelse og intensitet, men er spesifikke for bildet analyseprogramvare brukt (f.eksen DAPI mener pixel intensitet på minst 0,05; størrelse mellom 80-320 piksler, med en splitting følsomhet på 2 [Dette er en programvare-spesifikke parameter som er sterkt avhengig av morfologi av svulsten: for liten kreftceller, deling av 0,7 - 1 er riktig, for stor svulst celler, deling kan justeres opp 4]). - Forespørsel om kvalifisert patologen gjennom enkeltbilder og avgjøre om vev segmentering er nødvendig å velge svulst celle beriket regioner og ekskludere regioner med nekrose arearegion orand rikelig reaktive celler. Hvis flere vev segmentering er nødvendig, velger du aktuelle kontrollen regioner (som tumor celler/stroma/nekrose) og kontrollere at bildet analyseprogramvare kan identifisere slike områder
- Fortsette med cellen segmentering etter vev segmentering (hvis noen), forespørsel en kvalifisert patologen å vurdere celle segmentering kartet for å sikre at gjengivelsen av den tiltenkte segmenteringen tilnærming5.
- Bestemme mest biologisk/klinisk metoden analyse for en gitt biomarkør av interesse (f.eksprosent positivitet og mener intensitet per celle).
- Velg en cut-off verdi for hver indikator (for prosent positivitet).
- Bestemme optisk intensitet positiv cut-off verdi for hver indikator i forbindelse med en patologen. Generere histogrammer ved å analysere frekvensfordeling markør intensitet/cellen i riktig statistikk programvare (se Tabell for materiale).
Merk: En intensitet verdien histogrammet kan tilby en oversikt over fordelingen av signal intensiteten. - Angi en omtrentlig cut-off fra histogrammet og bekrefte dette med en patologen gjennomgang, å korrelere med manuelt bestemt avskjær på valgte bilder. I noen tilfeller en ensartet enkelt cut-off kan ikke mulig på grunn av variasjoner i flekker, og en manuell cut-off verdi for hvert utvalg må.
Merk: Delen 8.1 bør gjøres i analyseprogramvare (se Tabell for materiale) med mindre annet er angitt.
-
Merking positiv og negativ celler
- For hver markør av interesse, i henhold til cut-off antallet bestemt (gjennom histogrammer eller manuelt), bruke en "Hvis" eller lignende logikk formel merke positiv og negativ celler med merket verdi: nummer 1 for positiv celler, nummer 0 for negativ celler.
- For positivitet i all markørene, multiplisere merkede verdien av hver merketråd (1 eller 0) med produktene i separate kolonner. Hvis produktet er lik 1, betyr det cellen er positivt for alle merkene. For positivitet og negativitet på en bestemt markør, bruke en hvis logisk forkortingsalgoritme.
Merk: Seksjon 8.2 må gjøres i statistikk programvare (se Tabell for materiale).
-
Generere prosent og numeriske data ved hjelp av en pivottabell
- Generere prosent data for bestemte markører av interesse, i definerte celler (f.eks, CD20-positive celler eller CD20-negativ celler) (figur 6).
- Sette inn en pivottabell i dataarket.
- For å beregne den positivitet en enkelt markør, som CD20, Velg funksjonen SUM under verdi -delen av pivottabellen telle antall CD20-positive celler med summen av CD20+ celler delt den total-celle nummer. Resultatet er CD20+ celle prosent innen en kjerne eller en studie tall (avhengig av valg av pivot tabellraden).
- Beregne den positivitet flere indikatorer på samme måte (Figur 3).
- Generere numeriske data. Ekstra median normalisert teller hver merketråd på hver kjerne eller tallverdien studie av skaffe mener intensiteten av hver indikator på interesse for alle cellene studerte i en prøve (Figur 4).
Merk: Medianverdien kan ikke hentes i pivottabellen direkte. Det kan utledes ved hjelp av denne formelen: MEDIAN (hvis (kolonnen antall studie = konkret studie nummer, normalisert verdi-kolonnen)).
-
Plotte dataene i en passende graf
- Tegne inn resultatene av prosentandel positivitet eller median intensitet per markør i en celle type interesse i en hensiktsmessig måte for ytterligere statistiske tester og presentasjon.
- Opprette dot tomter å gi en visualisering av tall og distribusjon.
Merk: Som representerer data med søylediagrammer ikke formidle informasjon på distribusjon. Estimering tomter er også anbefalt som en god metode for datarepresentasjon, med vekt på omfanget av forskjellen mellom prøver16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MF-IHC bilder for et DLBCL utvalg med C-MYC og BCL2 gene omorganisering (dobbel-hit lymfom) er vist i figur 1. Figur 2 viser simulert lyse-feltet immunohistochemical bilder. Figur 3 viser generasjonen av prosentandel data. Figur 4 viser detaljene for en median formel for generering av numeriske data. Figur 5 viser anvendelsen av mf-IHC av en T-celle panel i angioimmunoblastic T-celle lymfomer. Figur 6 viser bildet optimalisering av mandel kontroll prøven og dataanalyse for dette eksemplet.
Figur 1: B-celle multiplekset immunofluorescence panelet bilder for en diffus stor B-celle lymfom (DLBCL) prøve med C-MYC og CL2 genet omorganisering (dobbel-hit lymfom). Magenta = CD20 (membran); hvit = BCL2 (cytoplasma); gul = Ki67 (kjernefysisk); grønn = C-MYC (kjernefysisk); rød = BCL6 (kjernefysisk), blå = DAPI (kjernefysisk counterstain). Kreftceller CD20-positive viser en høy uttrykk for C-MYC (80%) og BCL2 (> 90%), og Ki67 spredning indeksen er også høy (90%). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: simulert lyse-feltet immunohistochemical bilder (generert fra figur 1) på samme DLBCL utvalget med C-MYC og BCL2 gene omorganisering (dobbel-hit lymfom). CD20 viser membran farging i kreftceller. BCL2 viser cytoplasma flekker i > 90% av kreftceller. C-MYC positivitet er ca 80%. BCL6 viser kjernefysiske farging i omtrent 20% av cellene. Ki67 er positivt i 90% av cellene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Pivot-tabell som viser hvordan å generere prosent data etter studere antallet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Median formel for den normaliserte Ki67 OD verdien etter studere antallet. Hvis-uttrykket finner alle studie tall som er lik en konkret studie tall (som er 52 i figuren). Deretter returnerer det tilsvarende Ki67 normalisert verdien. CTRL + SKIFT + Enter tastekombinasjoner kan brukes til å beregne medianen (Ki67 Median) for disse returnerte verdiene, som er 11.56 for studere antallet 52. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: multiplekset immunofluorescence panelet bilder for en angioimmunoblastic T-celle lymfom (AITL) prøve. (A) det sammensatte bildet viser den cellulære heterogenitet i et AITL utvalg. Magenta = CD20 (membran); gul = CD4 (membran); grønn = PD1 (membran); rød = BCL6 (kjernefysisk); cyan = CD8 (membran); blå = DAPI (kjernefysisk counterstain). (B) den øverste raden av bilder viser en forstørret visning i regionen som er valgt i den hvite boksen i panelet A. Den nederste raden av bilder viser den tilsvarende segmentert celle masker: gul/rød/grønn viser enkeltceller CD4/BCL6/PD1-positiv, henholdsvis. Blå representerer negativ celler, og hvit angir dobbel-positive celler. Bildene viser at 50% av CD4+ celler er PD1+ (venstre, hvit), mens 20% av CD4+ celler er også positivt for BCL6 (midten, hvit). Den doble positivitet for PD1 og BCL6 er ca 10% (høyre, hvit). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: multiplekset immunofluorescence optimalisering bilder for mandel kontroll vev. (A) det sammensatte bildet viser germinal sentrum området en mandel kontroll prøven. Gul = C-Myc (kjernefysisk); rød = BCL6 (kjernefysisk); cyan = BCL2 (cytoplasma); magenta = CD20 (membran); grønn = Ki67 (kjernefysisk); blå = DAPI (kjernefysisk counterstain). C-Myc er positivt bare i noen celler. BCL6 og Ki67 er positive hovedsakelig i germinal sentrum, mens BCL2 er positivt hovedsakelig utenfor germinal sentrum. CD20 er diffusely positivt i og utenfor germinal sentrum. (B) tabellen viser at germinal sentrum CD20-positive celler er også positivt for BCL6 og Ki67 men negativ for BCL2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Sekvensen av antistoff flekker | Primære antistoff (se tabell av materialer) | Totalt HIER kreves | Faktisk pre flekken HIER | Sekundær antistoff | Fluorophore | Post-TSA antistoff stripping |
| 1 | Musen anti-Bcl6 (1:30, 60min RT) | 25minutes, Ph9 | 25minutes, Ph9 | HRP-konjugerte anti-mus, 1:1000' for 10' | OPAL Cy5 på 1: 100 | 1 omg 100% strøm 1 min, 20% strøm til 10min |
| 2 | Musen anti-Bcl2(1:50,60 min RT) | 25minutes, Ph9 | Ingen | HRP-konjugerte anti-mus, 1:1000' for 10' | OPAL 520 på 1: 100 | 1 omg 100% strøm 1 min, 20% strøm til 10min |
| 3 | Kanin anti-c-MYC(1:50,30 min RT) | 25minutes, Ph9 | Ingen | HRP-konjugerte anti-kanin, 1:1000' for 10' | OPAL 570 på 1: 100 | 1 omg 100% strøm 1 min, 20% strøm til 10min |
| 4 | Musen anti-CD20(1:2000,30 min RT) | 25minutes, Ph9 | Ingen | HRP-konjugerte anti-mus, 1:1000' for 10' | OPAL 540 på 1: 100 | 1 omg 100% strøm 1 min, 20% strøm til 10min |
| 5 | Musen anti-Ki-67(1:50,45 min RT) | 30minutes, Ph9 | 5 minutter pH9 | HRP-konjugerte anti-mus, 1:1000' for 10' | OPAL 620 på 1: 100 | 1 omg 100% strøm 1 min, 20% strøm til 10min |
Tabell 1: eksempel et ferdig oppsett for multipleks hvis farging. Denne tabellen inneholder et eksempel på hvordan du angir mengden HIER og mikrobølgeovn-baserte stripping gjøres på hvert trinn, når monoplex flekker er optimalisert.
Tabell 2: Guide mot filteret valget for fluorophores. Denne tabellen gir en grov tommelfingerregel mot riktig filtre som kan brukes på angitte utstyr, visualisere fluorophores rundt. Det anbefales å sjekke filter spesifikasjonene til mikroskopet brukes i forhold til utslipp/eksitasjon profilen i fluorophores brukes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MF-IHC har potensial til å aktivere patologer å avgrense diagnosticcriteria i lymfoide patologi og analysere rollen biomarkers i spesifikke celletyper mot en forutsigelse av kliniske utfallet. Som en ny forskning metoden brukes mf-IHC stadig kvantitative og romlig identifikasjon av flere immun parametere tumor celler17. Gjenkjenning av mf-IHC for co uttrykket av svulst biomarkers har vist å være reproduserbare og pålitelig5. Men fortsatt teknologien begynnende og utsettes for variasjon som følge av reagens - og/eller vev-relaterte faktorer, slik som på grunn av inkonsekvenser i vev fiksering og behandling.
Kritisk til teknikken er bruk av godt validert antistoffer som er bestemt, følsom, og gi reproduserbar resultater. Det finnes eksempler i litteraturen av antistoffer opprinnelig beskrevet for å være spesifikke for deres antigener og senere vist for å gjenkjenne urelaterte proteiner ved bruk av bank-out modeller14. Knock-out / sammenleggbare Valideringsmetoden i som vill-type eller celler med overexpressed antigener tjene som positive kontroller mens celler med målene slått ut eller slått ned av siRNA eller CRISPR metoder brukes som negativ kontroller.
Som den konvensjonelle IHC har mf-IHC mange viktige variabler som må optimaliseres for hver eksperimentet, optimal flekker og resultater. Disse inkluderer pH i antigen henting løsningen, antistoff fortynning, tildeling av en fluorophore for hver markør, og konsentrasjonen av fluorophore. De brukte antigen henting løsningene er pH 6 og 9. Det er verdt å teste hvilke pH gir optimal flekker mønster og intensitet med mindre bakgrunn.
Det er ingen spesifikke retningslinjer å bestemme rekkefølgen av antistoff program i multiplex eksperimentet som det ikke bare avhenger affinitet av antistoffer, men også på styrken av opal fluorophores. Generelt, antistoffer med en svak affinitet ofte krever høyere konsentrasjoner basert på den monoplex flekker og brukes først i multiplex sekvensen. Sterk affinitet antistoffer som er sannsynlig å være resistente mot stripping brukes sist, for å unngå uspesifikke flekker. Med hensyn til valget av en bestemt fluorophore er det best å unngå å bruke fluorophores med lignende spectral bølgelengder for antigener som colocalize i samme mobilnettet seksjonene. Antigener med lav uttrykk nivåer tilordnes smarteste fluorophores og omvendt. Hvis i studien utvalget, signalet intensiteten er svak, kan justere opal TSA fortynning gjøres for å oppnå ønsket signal18. I noen tilfeller fungerer det prøver forskjellige antigen uttaksmetodene dine, eller øke primære antistoff konsentrasjonen. Den første fortynning av primære antistoffer kan være den samme som i en vanlig IHC eksperiment. Men hvis hvis signalet er ikke klart, vil testing av andre antistoff fortynninger være nødvendig, som forholdene optimalisert for IHC ikke alltid oversette hvis. Signalet intensitet påvirkes av ordren eller sekvens av immunostaining. Noen epitopes er overeksponert etter to eller tre runder med MWT, mens noen kan svekkes på grunn av overflødig MWT. Enkelte fluorophores kan også påvirkes av MWT og må testes for demping.
Denne protokollen fokuserer på colocalization og måling av intensiteten av markører i undergrupper av celler i en ondartet B-celle lymfom. Den sentrale utfordringer i utviklingen av gjeldende protokollen innebære generering av en optimalisert multiplex panel for antigener som colocalize i samme mobilnettet seksjonene. Det må være en nøyaktig unmixing av fluorophores for presis kvantifisering. Når multiplex panelet er på plass, er bildebehandling farget lysbildene relativt enkelt. Den neste hinderet omfatter analyse av fotografert dataene. I motsetning til i immun infiltrasjon studier, der kvantifisering av spesifikke immun celletyper i en epithelial svulst er enkel, avhengige colocalization studier i lymfom definisjonen av positivitet av en utdannet patologen for hver markør for interesse. Deriving på en passende diagnostiske cut-off som kan brukes på rutinemessige klinisk praksis fortsatt et pågående arbeid. Ytterligere forbedringer i metoder informasjon om datanormalisering og automatisert cut-off triangulering vil være nødvendig før denne teknikken kan integreres rutinemessig diagnostikk.
Til tross for gjeldende begrensninger gjøre den potensielle anvendelser av mf-IHC og kunnskap som kan være samlet fra studiet av kreftceller og deres romlige forhold med microenvironment det en attraktiv verktøy, spesielt for utfordrende histologiske kreftformer som lymfoide kreft. Videre arbeid er nødvendig for å etablere protokoller i vev fiksering og vev behandling som er optimale for foreslåtte arbeidsflyten, samt en forbedring i flekker teknikker, å tillate samtidig analyse av et økt antall mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
A.D.J. har mottatt finansiering fra PerkinElmer mot reise til brukergruppen møter. Forfatterne har ingen andre interessekonflikt avsløre.
Acknowledgments
S.-B.N. og A.D.J. støttes av Singapore helsedepartementets nasjonale Medical Research Council overgang Awards (NMRC/TA/0020/2013 og NMRC/TA/0052/2016). Forfatterne bekrefter et Yong Siew Yoon forskningsstipend til A.D.J. fra den National University Cancer Institute of Singapore mot kjøp av Vectra spectral tenkelig mikroskop. Denne studien er godkjent av Singapore NHG domene spesifikk gjennomgang styret B (2014/00693).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
References
- Swerdlow, S. H., et al. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , Revised Fourth Edition, Stylus Pub LIc. (2017).
- Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
- Dabbs, D. J. Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , Saunders. (2010).
- Kim, S. -W., Roh, J., Park, C. -S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Anderson, M. W., Natkunam, Y. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. Jones, D. , Humana Press. 21-44 (2010).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
- Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Tóth, Z. E., Mezey, É Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Ng, S. -B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
- Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).
- Kalyuzhny, A. E. Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , Humana Press. (2011).
- Bordeaux, J., et al.
- PerkinElmer. Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User's Manual. , PerkinElmer, Inc. (2012).
- Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
- Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
- PerkinElmer. Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , PerkinElmer, Inc. (2017).
