Summary
ここで多重蛍光免疫組織染色とリンパ腫における複数のがん関連抗原の同時定位のためのイメージング プロトコルについて述べる。このプロトコルは、すべての組織切片内バイオ マーカーの共局在解析に拡張できます。
Abstract
光学顕微鏡によるタンパク質発現の場分析のため免疫組織化学 (IHC) メソッドは、研究および診断目的の両方のための強力なツールです。しかし、可視化と従来の発色 IHC を使用して単一のティッシュ セクションで複数の抗原の定量化は困難です。多重化されたイメージングでは特に関連リンパ腫研究、診断、マーカーが複雑な腫瘍微小環境のコンテキストで解釈しなければなりません。ここで多重蛍光 IHC 染色リンパ腫への関心の特定の細胞型の複数のターゲットの定量的評価を有効にするためのプロトコルについて述べる。メソッドは、側面をカバーして抗体検証、抗体最適化、リンパ腫サブタイプのマーカーと多重最適化、組織マイクロ アレイ (TMA) スライドとスライドのスキャンの染色続いて特定のデータ解析リンパ腫を参照します。このメソッドを使用すると、両方の平均強度の関心と割合の陽性マーカーのスコアがさらに定量的な解析が容易に生成されます。多重サンプルの使用率を最小限に抑え、各マーカーに関心のある情報空間を提供します。
Introduction
リンパ系腫瘍はリンパ球の無秩序の悪性増殖によって引き起こされます。これらの細胞は、免疫システムの重要なコンポーネントし、骨髄、リンパ節、脾臓、その他粘膜関連リンパ系など、プライマリとセカンダリの免疫臓器にローカライズします。リンパ腫瘍は、機能、形態、イムノフェノ タイプ、遺伝的特徴、臨床症状などの星座に基づいて分類される無秩序の異質グループです。各パラメーターは、役割を果たしている、リネージュ定義の特徴のまま、B 細胞、T 細胞および自然なキラー (NK) 細胞1から派生した腫瘍を認識する WHO 分類体系のための基礎を形作る。
リンパ腫の分類にキーは、白血球リンパ球2のさまざまなサブタイプの表面マーカーに対する抗体の評価をされています。免疫組織染色 (IHC) は伝統的にそのようなマーカーの分析のために使用されているし、顕微鏡的に視覚化できる細胞・組織ベースの分子を検出する抗体抗原認識の原則に基づいて3ですしかし、従来明視野発色多重 IHC によって 1 枚のスライドに複数のターゲットの同定、制限単一ティッシュ セクションで複数の色信号を確実に区別するために困難なことが多いため、特に。非常に低い式4抗原の視感評価と染色の定量化は、主観的、分析およびデータ解釈5の変動を引き起こすことができます。
そのため、ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) サンプルに従来の IHC はリンパ腫のような多様な免疫学的疾患の複数のターゲットを同時検出するため不可能です。さらに、周囲の免疫細胞から腫瘍性リンパ球を区別する正確ではありません多くの場合です。これはリンパ腫における新規バイオ マーカーの関連性を見て研究を妨げています。多重蛍光 IHC (mf IHC) をこのコンテキストではそれにより抗原共発現の定量的評価と限定を節約しながら、精度の高い空間的な関係のサンプル6,に有望な代替手段を提供しています7.このイメージング技術は、デジタル画像解析ソフトウェアと提携して、データ解釈はさらに効率的、腫瘍微小環境の不均一性8,9の研究が容易になります。このプロトコルの多重化通信方式パスチラミドシグナル ベースの蛍光 (IF) 信号を増幅するのに適用され、あらゆるホスト種であっても同じ種5,7の開発から IHC 検証抗体と互換性のあります。,10. パスチラミドシグナル ベースのプロトコルは、興味のティッシュに fluorophore の直接接合複数汚れの逐次適用を可能にする、各ステップの後、一次および二次抗体を取り除くことができますので、なし抗体の交差反応します。
多重化された戦略は、ターゲットとリンパ腫におけるバリアント免疫学的パターンを特定することにより予後の治療成績を予測するため役に立つでしょう。多重蛍光 IHC の T および B リンパ球のマーカーと T 濾胞ヘルパー T 細胞血管免疫芽球性リンパ腫 (AITL)、マーカー パネルの調査のため研究室に適用されている積極的なによって臨床的に特徴づけられる末梢性 T 細胞リンパ腫のサブタイプ行動と腫瘍の不均一性の11。このメソッドの有用性を示したびまん性大 B 細胞リンパ腫 (DLBCL)、ブルートンのチロシンキナーゼ阻害の潜在的な治療上の使用を示唆している同時 C-MYC と BCL 2 式と B 細胞受容体の信号を増加しました。12.
ここで適切な管理組織の選択に抗体検証から全体のプロトコルについて述べるし、リンパ腫 FFPE を用いた多重スキャンを使用して染色スライドの最終的な分析と組織自動定量病理学画像システム。
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Protocol
このプロトコルで使用されているすべての組織がシンガポール NHG ドメイン特定のレビュー ボード B の下で得られた 2014/00693 を研究します。
1. 選択と抗体の検証
注: 任意の多重パネルの設立前に、全ての抗体染色堅牢興味のターゲット抗原のみを識別するを確認します。目的は、具体的にはティッシュ セクションの興味の抗原を認識する抗体を選択します。
- 確立研究の使用、または IHC で日常的に臨床使用の抗体、正と負のコントロール組織で従来 IHC5,13を実行してエピトープの取得と抗体の希釈などの条件を確認します。セクション。人間の起源のティッシュ セクション、実験を開始する前に適切な倫理のクリアランスが設定されているを確認します。
注: ポジティブ コントロールは、興味の抗原を表現すると予想される組織とマイナス コントロールかどうかです。良性の扁桃組織は、B 細胞を含む免疫細胞、T 細胞、抗原提示細胞と間質ならびに上皮細胞の混合物を含んでいるためリンパ腫抗原の良い組織コントロールとして選択されます。便利な否定的な内部統制としての後者。 - 不明な目標や商業の抗体が不足してパブリッシュされたデータを持つ、一致した陽性を作成することによって抗体検証を実行し、ネガティブ コントロール FFPE セル ブロック14、CRISPR ノックアウトや siRNA を使用して興味の抗原のノックダウン標準的な分子生物学の技術を適切なセル行。手順 1.1 に従って従来 IHC に正と負のコントロール組織の代わりにこれらの FFPE セルのブロックを使用します。
注: hela 細胞または 293 t 細胞が使われています細胞型は抗原特定、リンパ腫細胞株は transfect に困難で。ある特定のリンパ球の抗原のために、(ただし、効力感が低い) リンパ腫細胞をウイルス導入とエレクトロポレーション遺伝子配達のモードとして使用できます。
2. 多重パネルの抗体と Fluorophores のシーケンスの計画
- 最終的な多重染色用試薬のシーケンスを計画します。たとえば、ここで多重プロトコルのシーケンスは当初計画として最初に、Bcl-6;第二に、Bcl-2;第三に、C-myc;第四に、CD20;第五に、キ67。
注: シーケンスの決定に高濃度を必要とする弱い親和性を持つ抗体を染色する最初最終的な多重染色で。複数回のマイクロ波除去に耐性があることが多い高親和性抗体は非特異的染色避けるために多重プロトコルの最後に適用されます。 - パネルで各抗体で蛍光パートナーを計画します。この例では選択肢の表 1と表の資料を参照してください。
注: 各抗体で蛍光パートナーを決定するローカリゼーション セル内および組織内の似たようなパターンが付いている抗体のスペクトル明確な fluorophores が付いてを選択します。これは、スペクトル重複と分離の難易度を最小限になります。
3. 模擬 5 プレックス多重パネルの場合 Monoplex パスチラミドシグナル ベース
注: この例では CD20 のプロトコルが説明されて、上記多重順番 4 番目の抗体として計画しました。抗体のシーケンス内の位置のストリップの追加の手順の数が異なります。
- ミクロトームを使用して正と負のコントロール組織の 3 μ m 薄いセクションをカットし、ポリ L リジン コーティングした顕微鏡用スライド グラス上のセクションを配置します。
- 3 適切な決済ソリューションを使用してセクションを dewax x 4 分。100% アルコール、アルコール 90%、70% アルコール、4 分でスライドを水分補給します。2-3 分の蒸留水でスライドを置きます。
- スライドを没頭する (市販) 標準抗原検索バッファーで電子レンジ対応ガラスの瓶にスライドを配置します。熱誘起エピトープ検索 (HIER) 25 分 98 ° C で pH9 抗原検索ソリューションに適した電子レンジを使用してを実行します。
注: 800-1,100 ワットに至る圧力と、電子レンジが使えると HIER をそれに応じて最適化することができます。この場合、(空気に開いている) マイクロ波ティッシュ プロセッサは HIER とストリッピング用だった。特定の epitope の検索の初期設定は、従来の IHC から事前の知識に基づいています。 - マイクロ波除去 (パネルの 4 番目の抗体のこの場合は 3 つ) の追加のラウンド、98 ° C に 100% 力と同じ温度で維持するために 10 分間 20% 力と各ラウンドを行います。少なくとも 10 分の蒸留水でスライドを冷やします。
注: は、マイクロ波除去提案多重化と手順を暖房の同じ数にターゲット抗原を公開する monoplex の場合ステップの間に複数回を実行します。CD20 は、4 番目の抗体として計画され、以来は、除去前に 3 倍し、一次抗体の孵化を行った後 1 回マイクロ波を行います。 - 確認し、追加マイクロ波除去中にすべての 5 分後、バッファーを補充します。重要なは、複数のストリップのプロシージャの間に乾くのスライドを聞かせてはいけません。電子レンジからスライドを撮影するときは、蒸留水の別の jar ファイルにそれらを配置するのに鉗子と耐熱手袋を使用します。抗原検索ソリューション自然冷却するを待ちます。
- 10 分間商業ペルオキシダーゼ ブロックを使用して、組織のペルオキシダーゼ活性をブロック (3% 過酸化水素は代替試薬として使用することができます)。トリス緩衝生理食塩水 (TBS) と 5 分の非イオン性洗剤で洗います。
注: TBS、50 mM トリス Cl、pH 7.5、150 mM に TBS + NaCl.TBS で構成されます。 - 抗体希釈液または関心の一次抗体の孵化後 15 分のウシ血清アルブミンのブロック (例えばCD20、1:2,000 抗体希釈液で希釈材の表を参照) 室温で 30 分間洗うと 3 x5 分たびに TBS D バッファー。すべての洗浄のステップで完全にスライドを没頭する十分な TBS D バッファーする必要があります。
注: ウシ血清アルブミンは、代替抗体希釈剤として使用できます。抗体希釈液の量は、(生検) を 50 μ L から 400 μ L (の切除サンプルまたは組織マイクロ アレイ サンプル) に至るまで、組織のサイズによって異なります。 - 適切なペルオキシダーゼ (HRP) を孵化させなさい-標識二次抗体、室温で 15 分間一次抗体の原産種に基づいて選ばれました。たびに 5 分間 TBS D バッファーで 3 x を洗ってください。
- 適切なパスチラミドシグナル ベース蛍光試薬 (1: 100 希釈増幅) を適用し、一次抗体の結合のサイトで組織サンプルに fluorophore 活用できるように、5 分間室温でインキュベートします。たびに 5 分間 TBS D バッファーで 3 x を洗ってください。
- ストリップを行う、その他マイクロ波に基づく一次および二次抗体を削除します。抗体のシーケンス内の位置に基づいて必要に応じて繰り返します。
- 蒸留水を冷却するためにスライドを配置します。洗浄後、10 分間インキュベート DAPI (1: 100 希釈抗体希釈液) で 5 分たびに TBS D バッファーの 3 倍。ワイプで組織することがなくスライド上の領域を乾燥し、メディアを適切なマウントを使用してスライドをマウントします。
- 画像のスライド (セクション 6 および 7 のこのプロトコルを参照) と染色 (正と負のコントロール組織の明確な差別によって定義される) としての妥当性を判断します。
注: 染色パターンが正しくない場合やり直す 1 つまたは複数の次のパラメーターを調整した後染色 monoplex: 熱取得数の手順は、抗体の孵化期間/濃度の熱取得量 (プライマリとセカンダリ)、順序、および蛍光体の選択の抗体の位置。通常ステップを染色 monoplex 適切な汚損のためのパラメーターの適切なセットを取得するための最適化の複数のラウンドが必要です。それぞれの一次抗体との同時の範囲をテストするこれは最終的な多重セットを決定する際に柔軟性を提供するようお勧めします。
4. 多重プロトコルの各抗体 Monoplex の繰り返し
- 同様の方法で他の抗体染色除去手順、抗体のシーケンス内の位置に基づく電子レンジの数を調整することによって monoplex を繰り返します。例えば、6 プレックス多重パネルにおける 3 抗体染色 monoplex を実行すると、一次抗体の孵化後は前に 2 つのマイクロ波除去手順と 3 つのマイクロ波除去手順を実行します。
注: 抗体のマイクロ波ベース ストリップで HIER にサンプルも公開することに感謝することが重要です。特定の抗体は、異なるエピトープ検索戦略を必要とする場合は、マルチプレックス シーケンスを計画するときを考慮するこの必要があります。この例では、キ67 エピトープ検索では、30 分間 pH 9 が必要です。HIER の 25 分前に行われるのでキ67 染色 HIER の余分な 5 分だけ順次プロトコルが必要です。
5. 多重化プロトコルを汚す
注: は、すべてのコンポーネントは、染色する場合、monoplex を使用して最適化されている後にのみプロトコルを汚す多重を続行します。Monoplex 染色の結果を確認し、多重化、各抗体で蛍光体の選択の順序の最終的なレイアウトを示す表をデザインします。抗体濃度の詳細は、染色とシーケンスの期間およびここで使用される各抗体の熱取得の性質は表 1にされます。
- 正と負のコントロール組織のカット 3 μ m 薄いセクション (ここでは、リンパ腫の FFPE サンプル) 関心の対象組織として、ミクロトームを使用して、セクション ポリ L リジン コーティングした顕微鏡用スライド グラス (材料の表を参照してください) にします。
注: 各抗体パネルでの正と負のコントロールを含めることは勧められる、多重の実際のサンプルと一緒に。これにより汚損のプロトコルが正しく実行されたことを確認できます。 - Dewax、熱誘起エピトープ検索 (HIER) を実行し、monoplex プロトコルの手順で 3.3 3.5 組織ペルオキシダーゼ活性をブロックします。
- 以前に monoplex 場合手順を使用して決定、最適化されたマルチプレックス シーケンスの最初の一次抗体とインキュベートします。この例では、1:30 で BCL-6、60 分間室温で希釈抗体希釈 (材料の表を参照) は多重プロトコルの最初のステップ。5 分間 TBS D バッファーで洗浄します。
- 事前に使用される一次抗体の種に基づく適切な HRP 標識二次抗体とインキュベート室温で 10 分間洗浄 5 分 TBS D バッファーでステップ (材料の表を参照)。
- 最適化されたパスチラミドシグナル ベース蛍光試薬 (この例では、増幅の希釈液で 1: 100 Cy5 参照テーブルの材料) で 5 分間室温で放置を適用します。、孵化後 5 分間 TBS D バッファーで洗浄します。
注: パスチラミドシグナル ベースの蛍光試薬の選択に基づいて最適化された monoplex 場合。 - 適切な顕微鏡を用いた最初の抗体の染色性を確認 (材料の表を参照してください)。
注: 中間チェックの画像はサンプルが TMA または 1 つのスライドの場合、簡単に実行できます。ただし、汚れは、複数のスライドで実行されているが場合、これは実用的でない可能性があります、この手順は省略できます。 - 電子レンジは monoplex の手順で最適化された条件を使用して、プロトコルの 2 番目の抗体の除去を実行します。2 番目の一次抗体の汚損に進みます (ここでは、BCL2) HRP 標識二次抗体とパスチラミドシグナル ベースの蛍光試薬 (ここでは、520、材料表を参照)。蛍光顕微鏡下での染色の 2 番目のラウンドを完了した後染色の効率を確認してください。
- 同様に、3 番目を使用して手順を繰り返しますシーケンスの 4 番目と 5 番目の抗体 (ここで、C-myc、CD20、キ67、570、540、620、fluorophores が付いているそれぞれ、それぞれ)。可能であれば、各ステップの間に画像のチェックを実行します。
- 核対比染色 (DAPI、抗体希釈 1: 100 希釈) 10 分間を追加し、その後、5 分ごとに TBS D で 2 x を洗います。
- 適切な取り付け試薬を使用してスライドをマウントします。
6. スペクトル ライブラリのスライドの準備
注: このプロトコルのセクション 6-8 スペクトル カメラを用いたイメージングは多重実験に固有です。
- マルチ スペクトル画像解析に使用する同じコントロール組織上各 fluorophore、DAPI、自発にライブラリ スライド (単一染色参照画像) を作成します。
- (ここで、リンパ腫のサンプルまたはコントロールとして扁桃) 興味の組織型の 2 x 3 μ m 薄いセクションをカット ミクロトームを使用して、セクションをポリ L リジン コーティングした顕微鏡用スライド グラス上に配置します。
- 両方のプロセスのスライド (すべてのと剥離洗浄の手順)、monoplex プロトコルを使用して抗体または蛍光体の追加はありません。
- 染色 DAPI で 5.9 の手順に従って 1 つのスライド、スライド (組織の自家蛍光スペクトルの世代) の無染色のまま。
注: (DAPI なしの単一蛍光色素) に最適化された monoplex スライドは、各蛍光色素のスペクトルを生成するスペクトル ライブラリのスライドとして使用することができます。
- これら一連の適切なフィルターを使用してスライドをスキャン、画像解析ライブラリにアップロードします。
7. 分光イメージング
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Monoplex スライドをスキャン
- 採用の蛍光体の適切な利用可能な標準的なエピ蛍光フィルター (DAPI、FITC、CY3、テキサス赤および cy5 の組合せ) からフィルターを選択します。
注: この例で使用されている特定の fluorophores の推奨されるフィルター キューブはテーブル 215のとおりです。 - クリーンな信号を取得する適切な露光時間を識別する、対応する蛍光チャネルの各マーカーを調べます。マーカーの最も強力な信号を持っているはずです組織のコンポーネントに焦点を当てます。
- (ただし、いくつかの商用のプラットフォームは、露出の違いを考慮して正規化戦略を持っている)、ピクセル強度のクロス サンプル比較を許可するように各検体 (抗体蛍光体の組み合わせ) の露光時間を決定します。
- 特定のチャネルの露光時間を決定するには、ライブ カメラの設定を使用して、ライブカメラ画像の露出オーバーの領域がなくなるまでは、露出時間を調整する、すべてのチャンネルのこの手順を繰り返します。
- Monoplex スライドをスキャンした後模擬明視野画像を生成する (使用しているソフトウェアで利用可能な機能の場合) 通常 IHC パターンと視覚的に比較して染色パターンが正しい (図 1および図 2 のを判断するには).
- 採用の蛍光体の適切な利用可能な標準的なエピ蛍光フィルター (DAPI、FITC、CY3、テキサス赤および cy5 の組合せ) からフィルターを選択します。
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多重サンプルをスキャン (TMA スライド/複数のサンプル)
- 前述の monoplex 画像 (ステップ 6.1) をスキャン光学パラメーターを設定します。まず、手動でまたは自動的にフォーカスを調整 (スキャン マシン特定のイメージの指示に従ってください)。第二に、各蛍光チャネルが、TMA のすべてのコア、またはスライドのすべてのエリアに適切に公開されることを確認するための露光時間を調整します。
注: 露出時間を調整する選択領域は重要です。ユーザーは各フィルターの最も強い信号の領域を選択する必要があります (すなわち、キ67 信号は nongerminal センター領域でより扁桃胚中心領域で強い; したがって、ユーザーは適切な露出に設定胚中心領域を使用する必要があります時間)。ユーザーも利用可能な場合は、イメージング システムの過飽和補正機能を採用できます。 - TMA TMA スキャン モード イメージングにおける適切なオート フォーカス アルゴリズムで使用可能な場合の下でスライドをスキャンします。
- 全体組織切片スライド、スライドを最も代表的な腫瘍領域から最適な画像を選択する修飾された病理学者によってレビューを取得します。
注: ここで説明されているプロトコルは定義された顕微鏡・画像解析システムに基づいて (材料の表を参照してください)。他のマシンや画像解析ソフトウェアをスキャンし、多重 IHC スライド7を分析することができますがあります。
- 前述の monoplex 画像 (ステップ 6.1) をスキャン光学パラメーターを設定します。まず、手動でまたは自動的にフォーカスを調整 (スキャン マシン特定のイメージの指示に従ってください)。第二に、各蛍光チャネルが、TMA のすべてのコア、またはスライドのすべてのエリアに適切に公開されることを確認するための露光時間を調整します。
8. データ分析
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切替の評価とプランニング
- 蛍光の参照スライドを使用して、分析をスキャンした画像から蛍光を減算します。
- フォーカスを確実に分析前に、アーティファクトを染色することがなく画像を確認します。
- 興味のセルを識別するために (例えば、この例では CD20) 腫瘍マーカーを使用して、セル分割、得点、およびバッチ分析を続行するアプローチします。CD20 陽性細胞解析を選択します。
注: たとえば、DLBCL のサンプル分析ここで、核の大きさに基づいてセル分割と強度が使用する画像解析ソフトウェアに固有に定義されているパラメーターの設定および (例えば、DAPI 意味ピクセル強度の少なくとも 0.05;サイズ 80-320 ピクセル、2 分割の感度との間に [これは腫瘍の形態に大きく依存するソフトウェア固有のパラメーター: 小さな腫瘍細胞、分裂の 0.7 - 1 は適切な; 大型の腫瘍細胞の分割を調整できますを4])。 - 個々 の画像を確認し、腫瘍細胞を選択する組織の分割が必要かどうかを決定する修飾された病理学者の要求は濃縮領域と除外領域壊死 arearegion 不在豊かな反応性細胞と。追加の組織分割が必要な場合は、(腫瘍細胞・間質/壊死) などの適切なコントロール領域を選択し、画像解析ソフトがこのような領域を正しく識別できることを確認してください。
- 組織の分割 (もしあれば) 後のセル分割を進める目的のセグメンテーションの忠実性を確保するためのセル分割マップを確認修飾病理学者アプローチ5要求。
- 最も生物学的/臨床的に適切な解析の一手法 (例えば、割合陽性またはセルごとの平均強度) の興味の特定のバイオ マーカーを決定します。
- (割合陽性) の各マーカーのカットオフ値を選択します。
- 病理医と組み合わせて各マーカーに光強度陽性カットオフ値を決定します。適切な統計ソフトウェアのマーカーの強度/セルの度数分布を分析してヒストグラムを生成 (材料の表を参照してください)。
メモ: 輝度値ヒストグラムは、信号強度の分布の概要を提供できます。 - ヒストグラムからおおよそのカットオフを決定する選択した画像を手動で決定されたカットオフと相関する病理学者の検討とこれを確認してください。いくつかの状況で均一な単一のカットオフは染色の可変性のためことはできません、各サンプルの手動のカットオフ値が必要になります。
注: セクション 8.1 は、画像解析ソフトで行う必要があります (表の材料を参照) 特に指定しない限り。
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正と負のセルをマーキング
- (ヒストグラムまたは手動で) を決定、カットオフの数に応じて、関心の各マーカーを使用して、"IF"または同様の論理式に正と負の細胞値の: 陽性細胞のナンバーワン、番号負の値セルの 0。
- すべてのマーカーの陽性、別々 の列に製品と各マーカー (1 または 0) のマークの値を乗算します。製品では、1 と等しい場合は、セルがすべてのマーカーに陽性を意味します。陽性と特定のマーカーの陰性、場合ロジック アルゴリズムを使用します。
注: セクション 8.2 は、統計ソフトウェアで行う必要がある (材料の表を参照してください)。
-
割合データとピボット テーブルを使用して、数値データを生成します。
- 定義されたセル (例えば、CD20 陽性細胞、または CD20 陰性細胞) 内の興味の特定のマーカーの割合のデータを生成する (図 6)。
- データ ・ シートにピボット テーブルを挿入します。
- CD20 などの単一のマーカーの陽性率を計算、CD20 の和を用いる CD20 陽性細胞数の合計ピボット テーブルの値の部分の下でSUM関数を選択+セルで割ると、総セル数です。結果は、CD20+セルの 1 つのコアまたは 1 つの調査数 (ピボット テーブル行の選択範囲に依存) 内の割合。
- (図 3).と同じ方法を使用して複数のマーカーの陽性率を計算します。
- 数値データを生成します。サンプル (図 4) で検討したすべての細胞への関心の各マーカーの平均強度を取得することによって各コアまたは各研究数の各マーカーの中央値正規化された数を抽出します。
注: 中央値は派生できませんピボット テーブルで直接。この式を使用して派生できます: 中央 (IF (試験番号の列 = 特定番号、正規化された値の列))。
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適切なグラフにデータをプロットします。
- 割合陽性またはさらに統計的検定とプレゼンテーションの適切な方法で興味のセル型でマーカーあたり平均強度の結果をプロットします。
- ドット数と分布の可視化を提供するためにプロットを作成します。
注: 棒グラフのデータを表す分布に関する情報が伝達されないは。推定プロットもサンプル16の違いの大きさに重点を置いた、データ表現のための良い方法として推奨されます。
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Representative Results
mf IHC C-MYC と BCL2 遺伝子転位 (ダブル ヒット リンパ腫) DLBCL サンプル画像は、図 1のとおりです。図 2は、シミュレートされた明るいフィールド免疫組織学的イメージを示しています。図 3は、パーセント データの生成を示します。図 4には、数値データの生成のための中央値式の詳細が表示されます。図 5は、血管免疫芽球 T 細胞リンパ腫における T 細胞パネルの mf IHC のアプリケーションを示します。図 6は、へんとう腺コントロールのサンプルとこのサンプルのデータ分析の最適化画像を示しています。
図 1: B 細胞は、C-MYC と CL2 の遺伝子再構成 (ダブル ヒット リンパ腫) とびまん性大 B 細胞リンパ腫 (DLBCL) サンプルの蛍光パネル画像を多重化します。マゼンタ = CD20 (膜);白 = BCL2 (細胞質);黄色 = キ67 (原子力);緑 = C-MYC (原子力);赤 = BCL6 (原子力)、青 = DAPI (核対比染色)。CD20 陽性腫瘍細胞は C-MYC (80%) および BCL2 の高発現を表示 (> 90%)、キ67 増殖指数も高い (90%)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: C-MYC と BCL2 遺伝子転位 (ダブル ヒット リンパ腫) と同じ DLBCL サンプルの明視野免疫組織化学画像 (図 1から生成される) をシミュレートします。CD20 染色で腫瘍細胞膜を示しています。BCL2 は、細胞質の染色を示しています > 腫瘍細胞の 90%。C-MYC の陽性は、約 80% です。BCL6 を核染色細胞の約 20% で示しています。キ67 は 90% の細胞で陽性です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 試験番号に応じて割合データを生成する方法を示すピボット テーブル。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 試験番号に従って正規化されたキ67 OD 値の中央値式。IF ステートメントは、特定の調査数 (この図では 52 である) に等しいすべての研究番号を検索します。次に、対応するキ67 正規化された値を返します。CtrlキーとShiftキーを押しながらEnterキーの組み合わせは、研究数 52 11.56 であるこれらの戻り値の中央値 (キ67 中央) を計算する使用できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: T 細胞血管免疫芽球性リンパ腫 (AITL) サンプルの蛍光パネル画像を多重化します。(A) 合成画像 AITL サンプルの細胞の不均一性を示しています。マゼンタ = CD20 (膜);黄色 = CD4 (膜);緑 = PD1 (膜);赤 = BCL6 (原子力);シアン = CD8 (膜);青 = DAPI (核対比染色)。(B) 画像の上段はパネルAの白いボックスで選択領域の拡大ビューを示しています。画像の下の行をセル マスクを分割対応する示しています: 黄/赤/緑単細胞 PD1 正/CD4 BCL6 をそれぞれ示します。青は負のセルを表し、白ダブル陽性細胞。画像を明らかにする CD4 の 50%+細胞は PD1+ (左、白)、一方、CD4 の 20%+セル、BCL6 の肯定的なも (中央、白)。PD1 と BCL6 の二重陽性率が約 10% (右・白です)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 扁桃コントロール組織蛍光抗体法の最適化画像を多重化します。(A) 合成画像は、へんとう腺コントロール サンプルの胚中心領域を示しています。黄色 = C-myc (原子力);赤 = BCL6 (原子力);シアン = BCL2 (細胞質);マゼンタ = CD20 (膜);緑 = キ67 (原子力);青 = DAPI (核対比染色)。C-myc は少数の細胞でのみ肯定的です。BCL6 キ67、胚の中心の内で主に肯定的な BCL2 が胚の中心の外に主に肯定的です。CD20 は胚中心の内外びまん性陽性です。(B) 表示して BCL6 のキ67 正いるまた胚中心 CD20 陽性細胞が、BCL2 陰性。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 抗体の汚損のシーケンス | 一次抗体 (材料の表参照) | 必要な合計 HIER | 実際前汚れ HIER | 二次抗体 | 蛍光体 | ポスト TSA 抗体除去 |
| 1 | マウス抗 Bcl6 (1:30、60 分 RT) | 25 分、Ph9 | 25 分、Ph9 | HRP 標識抗マウス 1: 1000 ' 10 ' | 1: 100 でオパール cy5 の組合せ | 1 ラウンド 100% の電力を 1 分、10 分で 20% の消費電力 |
| 2 | マウス抗 Bcl2(1:50,60 min RT) | 25 分、Ph9 | どれも | HRP 標識抗マウス 1: 1000 ' 10 ' | 1: 100 でオパール 520 | 1 ラウンド 100% の電力を 1 分、10 分で 20% の消費電力 |
| 3 | ウサギ抗-c-MYC(1:50,30 min RT) | 25 分、Ph9 | どれも | HRP 標識抗家兎 1: 1000 ' 10 ' | 1: 100 でオパール 570 | 1 ラウンド 100% の電力を 1 分、10 分で 20% の消費電力 |
| 4 | マウス抗 CD20(1:2000,30 min RT) | 25 分、Ph9 | どれも | HRP 標識抗マウス 1: 1000 ' 10 ' | 1: 100 でオパール 540 | 1 ラウンド 100% の電力を 1 分、10 分で 20% の消費電力 |
| 5 | マウス抗-キ-67(1:50,45 min RT) | 30 分、Ph9 | 5 分 pH9 | HRP 標識抗マウス 1: 1000 ' 10 ' | 1: 100 でオパール 620 | 1 ラウンド 100% の電力を 1 分、10 分で 20% の消費電力 |
表 1: 多重染色する場合の最終レイアウトの例です。このテーブルは HIER としたら monoplex の汚れに最適化されている各ステップで行うストリッピング マイクロ波ベースの量を指定する方法の例を示します。
表 2: fluorophores のフィルターの選択へのガイドです。このテーブルは、関心のフルオロを視覚化する特定機器に使用できる適切なフィルターへの大まかなガイドを提供します。使用される蛍光物質の発光・励起プロファイルに関連して使用されている顕微鏡のフィルター仕様を確認することをお勧めします。
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Discussion
mf IHC 病理リンパ病理学における diagnosticcriteria を修正し、臨床転帰の予測に向けた特定の細胞型におけるバイオ マーカーの役割を分析するを有効にする可能性があります。新しい研究方法としては、mf IHC ますます腫瘍細胞17の複数の免疫パラメーターの定量的および空間同定に適用されます。腫瘍マーカーの共発現の mf IHC の検出は、再現性と信頼性の高い5に示されています。しかし、初期と試薬およびティッシュの固定および処理の矛盾によるものなど、組織関連の要因から生じる変動を受ける技術のまま。
技術に重要な固有、よく検証された抗体の使用を区別する、および再現可能な結果を与える。最初の抗原のために特定する説明し、後でノックアウト モデル14を使用して無関係なタンパク質を認識する抗体の文献に例があります。どの野生型のノックアウト/ノックダウン検証メソッドまたはノックアウトか siRNA や CRISPR メソッドによってノックダウン ターゲットを持つ細胞がネガティブ コントロールとして使用されてポジティブ コントロールとして発現抗原提供細胞。
従来の IHC のような mf IHC が最適な染色の結果、すべての実験のために最適化する必要がある多くの重要な変数です。抗原検索ソリューション、抗体希釈、各マーカーに fluorophore の割り当て、および蛍光体の濃度の pH が含まれます。一般的に使用される抗原検索ソリューションである pH 6 と 9。PH を与える最適な染色パターンと背景が少ない強度をテストする価値があります。
親和性抗体、しかしまたオパール fluorophores にだけではなく依存多重実験では抗体のアプリケーションのシーケンスを決定する特定のガイドラインがないです。一般に、弱い親和性抗体はしばしば monoplex 染色に基づいて高濃度を必要とし、マルチプレックス シーケンスに最初に適用されます。除去に耐性がある可能性のある強い親和性抗体は、非特異的染色を避けるために最後に適用されます。特定の fluorophore の選択に関して同じ細胞コンパートメントに colocalize 抗原の類似スペクトル波長のフルオロを使用しないようにすることをお勧めします。低発現量と抗原は、明るい fluorophores が付いて、逆に割り当てられます。研究サンプルの信号強度が弱い場合、オパール TSA 希釈を調整は所望信号18を達成するために行うことができます。いくつかのケースでは異なる抗原検索方法をしようとしているまたは一次抗体濃度を増加させる動作可能性があります。一次抗体の初期希釈は、従来 IHC の実験で確立されたと同じにすることができます。ただし、IF 信号がオフにしない場合、他の抗体希釈液のテスト必要があります、IHC 用に最適化された条件が場合に常に翻訳しないと。信号強度、免疫染色、その順序を受けます。いくつかが過剰な MWT により低下する間、MWT の 2 つまたは 3 つの円形の後いくつかのエピトープが露出します。特定のフルオロ MWT によっても影響を受けることができ、減衰をテストする必要があります。
このプロトコルは、共存と悪性 B 細胞リンパ腫細胞のサブセット内のマーカーの強度の測定に焦点を当てください。現在のプロトコルの開発の主要な課題には、同じ細胞コンパートメントに colocalize 抗原の最適化された多重パネルの生成が含まれます。正確な定量化のため蛍光物質の正確な分離する必要があります。多重パネルが、ステンド グラスのスライドの画像は比較的簡単です。次のハードルは、イメージ データの分析を含みます。異なり、上皮性腫瘍内の特定の免疫細胞の種類の定量は簡単です、免疫浸潤学リンパ内の共存研究に大きく依存のマーカーごとに訓練を受けた病理学者によって陽性の定義関心します。日常診療に適用できる適切な診断カットオフで派生する、進行中の作業が残っています。この技術は、定期的な診断に統合できる前に、データの正規化および自動カットオフ三角測量の方法でさらに改良が必要となります。
現在の制限にもかかわらず mf IHC と腫瘍細胞の研究と、微小環境との空間的関係から収集することができる知識の潜在的なアプリケーションは、それの特に組織学的挑戦のための魅力的なツールを作るがんリンパ系悪性腫瘍など。ティッシュの固定および染色ターゲット数の増加の同時分析を可能にするための技術の向上と同様に、提案のワークフローに最適なティッシュの処理のプロトコルを確立するさらなる作業が必要です。
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Disclosures
A.D.J. は、ユーザー グループのミーティングに旅行に向けてパーキンエルマー社から資金を受けています。著者はあるその他利益相反を開示します。
Acknowledgments
S. B.N. と A.D.J. は、シンガポール保健省国立医療研究評議会移行賞 (ナノ材研/TA/0020/2013 とナノ材研/TA/0052/2016) でサポートされます。著者は、ベクトラ スペクトル イメージング顕微鏡の購入に向けてシンガポールの国民大学癌研究所から A.D.J. に容 Siew 尹研究助成を認めます。本研究はシンガポール NHG ドメイン特定のレビュー ボード B によって承認されて (2014/00693)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
References
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