Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Détection d’endotoxines dans les Nano-formulations utilisant la Limulus Amébocytes Lysate (LAL)

doi: 10.3791/58830 Published: January 30, 2019

Summary

Détection d’endotoxines dans les nanomatériaux représente un des grands défis dans le domaine de la nanomédecine. Nous présentons ici une étude de cas décrivant le cadre composé de trois formats différents de LAL pour évaluer la contamination potentielle d’endotoxines dans les nanoparticules.

Abstract

Lorsqu’ils sont présents dans les produits pharmaceutiques, une endotoxine de composant de paroi cellulaire bactérienne Gram négative (souvent aussi appelée lipopolysaccharide) peut provoquer une inflammation, fièvre, hypo - ou hypertension et, dans certains cas extrêmes, peut conduire à des dommages des tissus et des organes qui peuvent devenir fatale. Les montants de l’endotoxine dans les produits pharmaceutiques, par conséquent, sont strictement réglementés. Parmi les méthodes disponibles pour l’endotoxine détection et la quantification, le dosage de Limulus Amébocytes Lysate (LAL) est couramment utilisé dans le monde entier. Alors que tous les produits pharmaceutiques peuvent interférer avec le test LAL, nano-formulations représentent un défi particulier en raison de leur complexité. Le but de cet article est de fournir un guide pratique aux chercheurs inexpérimentés dans l’estimation des endotoxines en nanomatériaux et nanoparticules-formulé des médicaments. Dans les présentes, des recommandations pratiques pour l’exécution de trois formats LAL, y compris la turbidité, épreuve à développement chromogène et essais de gel-caillot sont discutées. Ces tests peuvent servir à déterminer la contamination d’endotoxines dans les médicaments basés sur la nanotechnologie, des vaccins et des adjuvants.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Une endotoxine est un bloc de construction de la paroi cellulaire bactérienne Gram négative1,2. Il peut activer les cellules immunitaires à très faible (picogramme) concentrations1,2. Les médiateurs pro-inflammatoires (cytokines, leucotriènes, eicosanoïdes, etc.) produites par les cellules en réponse à une endotoxine sont responsables de la fièvre, hypotension, hypertension et plus graves problèmes de santé, notamment une défaillance multiviscérale 1 , 2 , 3. la gravité des médiation immunitaire-effets secondaires provoqués par l’endotoxine dépend de sa puissance déterminée par la composition de l’endotoxine et structure et mesurée en unités d’endotoxine international (IUs ou EUs)3. Le nombre de ces unités par kilogramme de poids corporel est utilisé pour définir la dose seuil d’endotoxine pyrogène. Cette dose est que 5 EU/kg pour les médicaments administrés par toutes les voies, mais la voie intrathécale. Les médicaments dosés par mètre carré de surface corporelle, liquides intraoculaires, radiopharmaceutiques et produits administrés via intrathécale route ont une dose seuil différent pyrogène, c'est-à-dire 100 EU/m2, 0,2 UE/mL, EU 175/V (où V est la volume du produit destiné à l’administration) et 0,2 EU/kg, respectivement4. Plus de détails sur la dose seuil de pyrogène pour divers produits pharmaceutiques et dispositifs sont fournies et traitées ailleurs4,5,6.

Animaux varie grandement dans leur sensibilité aux réactions induite par l’endotoxine. Les humains, les primates non humains et les lapins sont parmi les espèces de plus extrêmement sensibles aux endotoxines3. Pour éviter les induite par l’endotoxine des effets secondaires chez les patients et éviter des conclusions inexactes de toxicité préclinique et les études d’efficacité, il est essentiel de correctement détecter et quantifier les endotoxines dans les deux formulations de grade clinique et préclinique. Plusieurs méthodes actuellement disponibles peuvent réaliser cette tâche. L’un d’eux est le test de Limulus Amébocytes Lysate (LAL), qui est couramment utilisé dans le monde entier à l’écran des produits biomédicaux pour l’éventuelle contamination d’endotoxine ainsi quant à détecter des infections bactériennes7,8,9. Le lysat est préparé à partir des amoebocytes, les cellules présentent dans le sang du limule Limulus polyphemus résidant sur la rive est du continent de l’Amérique du Nord,7. Fait intéressant, il y a quelques espèces différentes de limules (Tachypleus gigas et tridentatus Tachypleus) en Asie,10. Le lysat Tachypleus des Amébocytes (TAL) est utilisé dans plusieurs pays d’Asie pour la détection de l’endotoxine semblable à comment la LAL est utilisé dans une autre série de10. Les lysats (LAL et TAL) contiennent un groupe de protéines qui, lors de leur activation, confèrent une activité protéase. Une de ces protéines, le facteur de ce que l'on appelle C est activée au contact de l’endotoxine. C facteur activée Clive facteur B, qui à son tour devient une protéase et fend une enzyme coagulation pro afin de produire une enzyme de la coagulation. Le résultat de cette chaîne de réactions est la formation d’un gel, une augmentation de la turbidité de l’échantillon et, en présence d’un substrat chromogène, l’apparence d’un produit coloré, qui servent de base pour gel-caillot, turbidité et épreuves chromogènes, respectivement. Alors qu’il n’y a aucun format obligatoire de LAL, la Food and Drug Administration (FDA) explique les directives relatives à l’industrie, qu’en cas de divergence dans les résultats entre différents formats LAL, la décision est prise fondé sur l’essai de gel-caillot5 .

Beaucoup utilisés couramment des produits chimiques de laboratoire (p. ex.., EDTA) et essais de médicament connu produits (par exemple, la pénicilline) interfèrent avec la LAL11. L’interférence est habituellement identifiée en évaluant la récupération de l’endotoxine standard dopé à une concentration connue dans une solution contenant la substance d’essai. Si le recouvrement de spike est inférieure à 50 % ou plus de 200 %, puis le résultat de la LAL assay pour la substance d’essai donnée n’est pas valide en raison de l’inhibition ou le développement, respectivement4. Formulations à base de nanotechnologie sont souvent complexes et interfèrent avec la LAL au moyen de divers mécanismes12,13,14. Plusieurs approches ont été décrites pour surmonter l’interférence : reconstitution d’échantillon en tampons spécifiques et des agents tensio-actifs, inactivation des protéines en chauffant, la destruction des lipides à base de matériaux creux en chauffage et en complétant l’échantillon avec excès les cations divalents5,12,13,14,15. Méthodes alternatives pour les situations où l’interférence LAL ne puisse être surmonté ont également été décrits : ELISA, une cellule de journaliste HEK-TLR4 line test et spectrométrie de masse16,17,18, 19.

Dans les présentes, les procédures expérimentales pour tenue de gel-caillot, turbidité et chromogénique LAL dosages sont décrites. Ces tests sont également disponibles sur le laboratoire de caractérisation de nanotechnologie (NCL) site Web20 protocoles STE1.2 (turbidité LAL), STE1.3 (gel-caillot LAL) et STE1.4 (chromogénique LAL). Il est recommandé d’effectuer au moins deux différents formats afin de caractériser la même formulation-nano. Lorsque les résultats de la turbidité et chromogénique LAL sont en désaccord, les résultats de gel-caillot sont considérés5. Lorsque les résultats des deux formats LAL sont en désaccord, autres études utilisant un test d’activation des monocytes (MAT) ou sur lapin pyrogène (RPT) pour vérifier les LAL constatations sont effectué21. Il est important de noter que chaque méthode utilisée pour la détection d’endotoxines et évaluation de pyrogénicité a avantages et limites21,22,23,24. Reconnaissant les limites de la méthode utilisée pour caractériser une formulation donnée nanotechnologie est essentiel pour obtenir une justification scientifique pour l’utilisation de la procédure optimale pour cette nano-formulation.

Dans cette étude, doxorubicine liposomale pégylé a été utilisé comme une préparation de nanoparticules de modèle. Cette formulation a été approuvée par la FDA en 1995 et utilisée pour le traitement du cancer patients dans le monde entier25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. préparation des échantillons de nanoparticules

  1. Préparer l’échantillon étudié dans LAL l’eau de qualité.
  2. Si le pH de l’échantillon est en dehors de la gamme de 6-8, ajuster le pH à l’aide d’hydroxyde de sodium apyrogène ou l’acide chlorhydrique.
  3. À l’aide de LAL l’eau qualité préparer plusieurs dilutions de l’échantillon de l’étude. Assurez-vous que la dilution la plus élevée n’excède pas la dilution valide maximale (MVD). Reportez-vous à la section de discussion pour plus de détails sur l’estimation de la MVD.

2. préparation des réactifs commune entre Formats LAL

  1. Stock d’hydroxyde de sodium concentré dilué l’apyrogène LAL réactif eau pour préparer une solution à une concentration de 0,1 N.
  2. Diluer l’acide chlorhydrique concentré stock apyrogène LAL réactif eau et préparer une solution à une concentration finale de 0,1 N.
  3. Préparation de la commande Standard endotoxine (CST)
    1. Reconstituer le CST selon le certificat d’analyse fournie par le fabricant.
      Remarque : Reportez-vous à la section « discussion » pour des remarques importantes concernant les informations fournies dans le certificat. Se référer à la Table des matières pour les détails concernant le numéro de catalogue et l’application d’une formulation donnée de CST dans différents formats LAL.
  4. Préparation du réactif LAL
    1. Reconstituer le réactif LAL selon le certificat d’analyse fournie par le fabricant.
      Remarque : Reportez-vous à la section « discussion » pour les détails importants concernant la préparation du réactif LAL. Se référer à la Table des matières pour les détails concernant le numéro de catalogue et l’application d’une formulation de réactif LAL donnée dans différent format LAL.

3. test LAL turbidité

  1. Élaboration des normes d’étalonnage
    1. À partir de 900 µL d’eau grade LAL et 100 µL du CST, préparer des dilutions intermédiaires autant que nécessaire pour permettre la préparation d’une solution étalon avec une gamme de concentrations de 0,001 à 1 UE/mL.
    2. Tout d’abord identifier tubes et ajouter 900 μL d’eau LAL-grade dans chaque tube. Puis ajouter 100 μL de 10 solutionn UE/mL pour préparer l’étalon avec concentration de 1EU/mL.
    3. Répétez les dilutions 10 fois comme décrit ci-dessus pour préparer les trois étalons inférieurs. Vérifiez que les quatre étalons variant de 0,001 à 1 UE/mL ont été préparés.
  2. Préparation des contrôles qualité
    1. Préparer un contrôle de qualité UE/mL 0,05 en combinant 50 µL de la solution de MCS UE/mL 1 950 µL d’eau LAL-grade.
      Remarque : Reportez-vous à la section « discussion » pour plus de détails au sujet de la préparation de la commande.
  3. Préparation des contrôles d’Inhibition et d’amélioration (IEC)
    1. Préparer la CEI avec concentration de 0,05 UE/mL en combinant 25 µL de la solution de MCS UE/mL 1 et 475 µL du nanomatériau test à une dilution donnée.
      Remarque : Reportez-vous à la section « discussion » pour plus de détails.
  4. Procédure expérimentale
    1. Laissez l’instrument pour se réchauffer en le tournant sur environ 30 min à l’avance. Réglage de la longueur d’onde de détection à 660 nm comme il convient pour la turbidité LAL.
    2. Identifiez-vous en tapant le nom d’utilisateur et mot de passe.
    3. Ouvrez le logiciel (Table des matières) en cliquant sur l’icône correspondante sur un écran d’ordinateur.
    4. Sélectionnez collecter les données sur l’écran d’accueil logiciel. Entrez les informations du groupe test ID et des données dans l’espace correspondant dans l’onglet général , sur l’écran d’accueil.
    5. Cliquez sur l’onglet matériel choisir le type d’instrument dans un menu déroulant.
    6. Réglage de la longueur d’onde de détection à 660 nm car c’est approprié pour la turbidité LAL en choisissant la méthode de turbidité LAL.
    7. Vérifiez qu’un numéro de série, les ID système et les informations de port série apparaissent sur l’écran. Cliquez sur OK. Cliquez sur OK une fois de plus pour confirmer.
    8. Entrez l’ID de l’échantillon dans le même ordre que l’échantillon est testé. Utilisez les boutons par défaut pour saisir le témoin négatif, des exemples de courbe et test standard.
    9. Préparer les tubes en double pour chaque échantillon et ajouter 200 µL (test ratio 4:1) ou 100 µL (test ratio 1:1) de contrôle négatif (eau), étalons, contrôle qualité, IEC et test de nanoparticules dans des tubes de verre préalablement marqué.
    10. Ajouter 50 µL (test ratio 4:1) ou 100 µL (ratio 1:1 de test) de LAL réactif à première éprouvette, vortex brièvement à nouveau et insert en test slot dans le carrousel de l’instrument. Si le ratio 1:1 est utilisé, le volume de réactif LAL est de 100 µL.
    11. Répéter la procédure décrite ci-dessus pour les autres échantillons. Processus d’échantillons à la fois.
      Remarque : Reportez-vous à la section « discussion » pour plus de détails.

4. chromogénique LAL

  1. Préparation des étalons
    1. À partir de 900 µL d’eau grade LAL et 100 µL du CST, préparer des dilutions intermédiaires autant que nécessaire pour permettre la préparation d’une solution étalon avec une concentration de 1 UE/mL.
    2. À l’aide d’eau de LAL-grade 900 µL et 100 µL de l’étalon UE/mL 1, préparer un second étalon à une concentration de 0.1 UE/mL.
    3. Répétez les dilutions 10 fois comme décrit ci-dessus pour préparer deux étalons plus bas. Vérifiez que les quatre étalons variant de 0,001 à 1 UE/mL ont été préparés.
  2. Préparation des contrôles de qualité.
    1. Préparer un contrôle de qualité UE/mL 0,05 en combinant 50 µL de la solution de MCS UE/mL 1 950 µL d’eau LAL-grade.
      Remarque : Reportez-vous à la section « discussion » pour plus de détails au sujet de la préparation de la commande.
  3. Préparation des contrôles d’Inhibition et d’amélioration (IEC)
    1. Préparer 0,05 UE/mL en combinant 25 μL de la solution de MCS UE/mL 1 à 475 μL de test nanomatériau.
      Remarque : Reportez-vous à la section « discussion » pour plus de détails.
  4. Procédure expérimentale
    1. Laissez l’instrument pour se réchauffer en le tournant sur environ 30 min à l’avance. Réglage de la longueur d’onde de détection à 405 nm comme il convient pour la turbidité LAL.
    2. Ouvrez le logiciel en cliquant sur l’icône correspondante sur un écran d’ordinateur. Identifiez-vous en tapant le nom d’utilisateur et mot de passe.
    3. Sélectionnez collecter les données sur l’écran d’accueil logiciel. Entrez test ID et des données d’informations de groupe dans l’espace correspondant dans l’onglet général , sur l’écran d’accueil.
    4. Cliquez sur l’onglet matériel choisir le type d’instrument dans un menu déroulant. Le choix de l’instrument.
    5. Vérifiez qu’un numéro de série, les ID système et les informations de port série apparaissent sur l’écran. Cliquez sur OK. Cliquez sur OK une fois de plus pour confirmer.
    6. Entrez l’ID de l’échantillon dans le même ordre que l’échantillon est testé. Les boutons par défaut permet d’entrer le témoin négatif, des exemples de courbe et test standard.
    7. Préparer les tubes en double pour chaque échantillon et ajouter 200 µL (test ratio 4:1) ou 100 µL (test ratio 1:1) de contrôle négatif (eau), étalons, contrôle qualité, IEC et test de nanoparticules dans des tubes de verre préalablement marqué.
    8. Ajouter 50 µL (test ratio 4:1) ou 100 µL (ratio 1:1 de test) de LAL réactif à première éprouvette, vortex brièvement à nouveau et insert en test slot dans le carrousel de l’instrument. Si le ratio 1:1 est utilisé, le volume de réactif LAL est de 100 µL.
    9. Répéter la procédure décrite ci-dessus pour les autres échantillons. Processus d’échantillons à la fois.

5. gel-caillot LAL

Remarque : Ce test identifie la présence d’endotoxines dans l’échantillon basé sur l’observation visuelle et la détection d’un caillot dans le tube de réaction. Les étapes expérimentales sont décrites ci-dessous. Utiliser une feuille de banc pour enregistrer les résultats. Cette feuille de banc n’est pas obligatoire, et les autres façons d’enregistrer les résultats d’analyse sont également acceptables. Un exemple d’une telle feuille de banc est fourni dans les documents complémentaires pour la commodité d’un lecteur. Lambda (l) est la sensibilité de l’essai de gel-caillot et 0,03 UE/mL.

  1. Étiqueter les tubes de réaction autant que nécessaire pour accueillir le nombre d’échantillons analysés. Référer à la fiche de banc pour plus de détails sur le nombre de répétitions utilisé dans l’étape 1, étape 2 et l’étape 3 du dosage.
  2. Aliquote 100 μL d’échantillon de l’eau, des contrôles ou des essais par tube.
  3. Préparer le CST telle que la concentration finale est égale à 4λ.
  4. Mélanger 100 μL de la norme susmentionnée avec 100 μL d’échantillon test ou de l’eau pour atteindre la concentration finale du CST de 2λ. Répétez trois fois plus pour atteindre lambda et moitié-lambda et un quart lambda.
  5. Assurez-vous que la température de l’eau du bain est de 37 ° C.
  6. Ajouter 100 μL de lysat par tube à essai, vortex brièvement et placez la grille avec tous les tubes dans le bain-marie pendant 1 h.
  7. Il faut inverser le tube avec un mouvement souple.
  8. Résultats records manuellement à l’aide de «+» (caillot ferme) ou «-» (pas de caillot ou de caillot lâche) sur la feuille de banc.
  9. Procéder à l’analyse selon l' USP BET 854; utiliser la feuille de banc comme documents justificatifs

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

L’exemple de données générées après avoir testé cette formulation lors d’essais de LAL est présenté au tableau 1. Doxorubicine liposomale pégylé a interféré avec chromogénique LAL à dilution 5. Toutefois, cette interférence a été compensée par une plus grande dilution. Récupération de Spike était entre 50 et 200 % lorsque cette formulation a été testée à des dilutions 50 et 500 de turbidité et chromogénique LAL, ainsi qu’à dilution 5 turbidité LAL. Quand rajustés selon le facteur de dilution, les résultats étaient uniformes entre les dilutions dans les deux tests. En outre, les résultats concordaient entre les formats d’essai de trois.

Prise d’essai Turbidité LAL, EU/mg (spike récupération, %) Épreuve à développement chromogène LAL, EU/mg, (spike récupération, %) Gel-caillot LAL, EU/mg (test valide, oui ou non)
Doxorubicine liposomale pégylé (voir la Table des matières)
Dilution 5 0,01 (141) interférence < 0,75 (Y)
Dilution 50 < 0,025 (187) 0,029 (82) < 1.5 (Y) *
Dilution 500 < 0,25 (182) < 0,25 (86) < 3 (Y) **

Tableau 1 : détection d’endotoxines dans pégylé doxorubicine liposomale à l’aide de LAL assays. Des analyses de pégylé doxorubicine liposomale a été testé à l’aide de turbidité, épreuve à développement chromogène et LAL gel-caillot. Interférence de l’échantillon a été estimée à l’aide de Sava. Récupération de Spike est indiquée entre parenthèses. Valeurs comprises entre 50 et 200 % sont jugés acceptables selon l’USP BET 85 standards d’endotoxine détection4. * et ** les résultats des tests de cet échantillon ont été obtenus à des dilutions de 100 et 200, respectivement. Les dilutions de dosage de gel-caillot sont différentes de celles utilisées dans l’épreuve à développement chromogène et turbidité LAL car sensibilité et une dilution valide maximale de ce dosage soient plus faible.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Les informations fournies dans le présent protocole a été décrit avant15,26 et s’appuie sur plusieurs documents de réglementation publiées par la US Food, Drug Administration (US FDA ou FDA) et United States Pharmacopoeia (USP)4 , 5 , 6 , 27et est également disponible sur le site Web NCL20 protocoles STE1.2 (turbidité LAL), STE1.3 (gel-caillot LAL) et STE1.4 (chromogénique LAL).

Test-nanomatériaux est préparés dans l’eau à réactif LAL ou PBS stérile et apyrogène. Le pH de l’échantillon de l’étude est important car faible (< 6) et le pH élevé (> 8) interférera avec le comportement optimal du lysat. Si le pH de la nanoparticule-test en dehors de la fourchette de 6 à 8, il peut être ajusté à l’aide d’hydroxyde de sodium apyrogène ou l’acide chlorhydrique. Lorsque cet ajustement est effectué, il est vital d’éviter la contamination des échantillons de Microélectrodes. Par conséquent, pour effectuer cette procédure, une petite aliquote de l’échantillon est retirée dans une éprouvette et utilisée pour mesurer le pH.

Lorsque l’échantillon est préparé en PBS ou un autre tampon, le tampon vide est également inclus dans ce test. La concentration de chaque nanomatériau est spécifique. Le test est utilisé pour estimer la quantité de contaminant endotoxine / mg de l’ingrédient pharmaceutique actif (API). Toutefois, selon le type de formulation-nano, la concentration peut également être estimée en mg de la formulation totale ou l’élément total (e.g., or, argent ou fer d’or, d’argent et des nanoparticules d’oxyde de fer, respectivement). L’échantillon a été testé sur le stock à l’aide de plusieurs dilutions n’excédant ne pas le MVD. Toutes les dilutions des nanoparticules-test sont préparées à l’aide de l’eau LAL-qualité.

Trois paramètres sont utilisés pour calculer le MVD. Ils sont la limite de l’endotoxine (EL), la concentration de l’échantillon et le test sensibilité (λ)4. Utilisez la formule suivante pour calculer la limite de l’endotoxine (EL) : EL = K/M, où K est une dose seuil de substances pyrogènes (e.g., 5 EU/kg comme indiqué dans l’introduction) et M est la dose maximale du nanomatériau test destinée à l’administration par kilogramme de corps poids en une seule heure4. Comme indiqué ci-dessus, l’estimation de EL aux nanomatériaux utilisés comme médicament radiopharmaceutique ou comme dispositif médical s’appuie sur une dose seuil de pyrogène ou formule, qui diffère du 5/M. Ces détails sont mentionnés dans l’introduction et pouvaient être examinées plus loin à l’USP et US FDA directives4,5,6. La limite recommandée d’endotoxine pour solutions ophtalmiques et dispositifs intraoculaires est fournie dans les directives de la FDA pour ces produits6. Lorsqu’un modèle animal (e.g., souris) a été utilisée pour établir la dose de nanoformulation, cette information est utilisée pour estimer l’homme soi-disant équivalent de dose (HED). L’HED est calculé en divisant la dose animale par un facteur de conversion, qui est propre à chaque espèce animale. Par exemple, le facteur de conversion est de 12,3, 6.2 et 3.1 pour la souris, le rat et le lapin, respectivement le27. La procédure de conversion et de la justification pour l’utiliser sont décrites en détail dans la ligne directrice de US FDA,27. Traitements du cancer sont souvent dosés par exprimée en mg/m2de surface de corps surfacique. On peut suivre la recommandation de l’USP pour calculer EL pour médicaments dosés en milligrammes par mètre carré ou convertir cette dose en mg/kg gamme. La dose en mg/m2 peut être ajustée à la dose en mg/kg en utilisant un facteur de conversion spécifiques à l’espèce27. Pour un homme adult, c’est 37 et indiquées comme Km pour désigner la masse constante27. Le facteur de km a unités de kg/m2; Elle est égale à la masse en kilogrammes (kg) divisé par la superficie en mètres carrés (m2),27. Par exemple, une dose humaine ou HED 74 mg/m2 correspond à 2 mg/kg ou 74/37. Pour déterminer le MVD, utilisez la formule suivante, qui est également disponible dans la norme USP BET 85 : MVD = (EL x concentration de l’échantillon) / λ)4. Dans un scénario hypothétique, une concentration de l’échantillon nanoparticule est de 10 mg/mL et sa dose maximale chez la souris est 615 mg/kg. Dans ce cas l’HED est 615/12.3 = 50 mg/kg ; EL sur toutes les lignes sauf par voie intrathécale est de 0,1 EU/mg (5 EU/kg/50 mg/kg) et le MVD est 1 000 ((0,1 EU/mg x 10 mg/mL)/0.001 UE/mL).

Souvent, quand on a besoin évaluer la contamination des endotoxines dans un nanomatériau de grade de recherche, l’information sur les doses n’est pas disponible. Il n’y a pas de procédure harmonisée pour l’estimation de la MVD et EL pour ces matériaux. Cette étude de cas effectue le test directement à partir de stock (généralement la concentration de cette solution est de 1 mg/mL) et à plusieurs dilutions, généralement 5, 50, 500 - et 5 000 plis. Lorsque la dose, la voie d’administration, la concentration de l’échantillon et la perfusion du temps pour le changement de nanomatériau test donné, l’EL et le MVD sont également modifiées. Par conséquent, il faut évaluer les renseignements et effectuer l’estimation de EL et MVD dans le contexte d’autres paramètres liés à la quantité, temps, prévue voie d’administration et de la concentration de la formulation donnée.

Il est important de noter que le numéro de catalogue et les spécifications du produit (p. ex.., puissance, s’élève par flacon) de l’ESC sont différentes pour les différents formats de LAL. Le CST utilisé que LAL peut également être utilisé dans une LAL gel-caillot de la turbidité. Cependant, le CST pour un chromogénique LAL est spécifique à ce format d’épreuve. Conformément aux instructions ci-dessous sont généraux et applicables à l’ESC utilisée dans tous les formats d’essai. Le CST est un e. coli de lipopolysaccharides (LPS), fourni sous forme de poudre lyophilisée. Cette norme est certifiée par le fabricant contre une endotoxine Standard de référence (RSE) avec une puissance connue. Le contenu de la fiole contenant le CST doit être reconstitué avec ~3.2 - 5,0 mL d’eau à réactif LAL apyrogène. Outre la différence entre CST utilisée pour le dosage de différents formats, le volume de reconstitution est spécifique à chaque lot de cette norme. Par conséquent, il faut calculer la concentration finale de la solution mère de CSE pour chaque lot de la norme. Le calcul est effectué en fonction de la puissance de la norme et la quantité contenue dans chaque flacon. Le certificat d’analyse spécifique pour chaque lot d’endotoxine standard contient les informations sur l’activité et le montant par flacon. Il faut rigoureusement vortex la norme pendant 30 à 60 secondes, durant la reconstitution et l’utilisation. Il est également recommandé d’effectuer la reconstitution à l’aide de 5-10 min temps de décantation et sur une durée de 30 à 60 min, laps de temps pour s’assurer que tous lyophilisé matériel passe en solution. Avant d’utiliser lors de l’essai, équilibrer le stock CST à température ambiante. Après la reconstitution, le stock CSE peut être réfrigéré pour le stockage et est stable pendant quatre semaines.

Semblable à la CST, le réactif LAL est aussi spécifique pour chaque format. Conformément aux instructions ci-dessous sont généraux et applicables à tous les formats d’essai LAL. Le réactif LAL est fourni sous forme de poudre lyophilisée. Les recommandations du fabricant sont respectées afin de reconstituer chaque flacon. L’eau de grade LAL ou tampon inhibant les bêta-glucanes peut être utilisé. Le tampon inhibant les bêta-glucanes est préférable dans cette étude de cas car il permet à l’exclusion de l’interférence de bêta-glucanes. Cette ingérence de faux-positifs est très commune dans les nanomatériaux, parce que l’acétate de cellulose filtres est couramment utilisés au cours de la synthèse de nanomatériaux et service de source de contamination de glucane15. La plupart des flacons exigera reconstitution pour un volume final de 5 mL. Après plus de 10 ans d’expérience de l’auteur avec ce test, il a été remarqué que l’inclusion de ce tampon ralentit la réaction et peut nécessiter d’augmenter le temps de déclenchement maximale dans les paramètres de l’instrument pour permettre le calibrateur le plus bas à un concentration de 0,001 UE/mL à développer.

Pour assurer la dilution précise lors de l’élaboration des normes, il est recommandé d’utiliser un facteur 10 étapes de dilution. 10 fois des dilutions successives peuvent être préparées par la fortification 100 µL de stock ou d’une norme avec une concentration plus élevée en 900 µL d’eau apyrogène. Étant donné que la concentration du stock CSE est généralement élevée (~ 1 000 UE/mL), préparation des dilutions intermédiaires avec des concentrations de 100 et 10 UE/mL est recommandé avant de préparer le calibrateur de dosage avec une concentration de 1 UE/mL. Deux ratios entre l’échantillon et le lysat sont décrites dans le présent protocole. Même si les deux rapports sont couramment utilisés, la linéarité de la courbe est acceptable, mais n’est pas idéal lorsqu’on utilise le ratio 4:1 et le tampon inhibant les bêta-glucanes (voir la Table des matières).

Les mêmes règles comme décrit ci-dessus au sujet de la préparation standard de calibration s’appliquent également à la préparation des contrôles de qualité (QC). Ces contrôles sont utilisés pour vérifier que le test fonctionne correctement. Il est préparé par la quantité connue du CST dans l’eau apyrogène de fortification. La concentration de QC est habituellement choisie dans le milieu de la fourchette de mesure. Les paramètres de l’essai LAL de turbidité est de 0,001 à 1 UE/mL. Par conséquent, conseiller de la reine à une concentration de 0,05 UE/mL est utilisé. D’autres concentrations dans la fourchette de mesure permet également à la préparation du contrôle qualité.

Le contrôle de mise en valeur d’inhibition (IEC) est également connu sous le nom de contrôle de produit positif (PPC). Il est préparé par une concentration connue de CSE dans la prise d’essai de fortification. La concentration de la CEI (PPC) est habituellement choisie dans le milieu de la fourchette de mesure. Les paramètres de l’essai LAL de turbidité est de 0,001 à 1 UE/mL. Par conséquent, la CEI à une concentration de 0,05 UE/mL est utilisée. Pour préparer cette CEI, il faut combiner 50 µL de la solution de MCS UE/mL 1 950 µl de test-nanoparticules. La CEI est établie pour chaque dilution d’un nanomatériau-test. Par exemple, si une formulation-nano est testée à trois dilutions (01:50, 1/500 et 5 000:1), il faut préparer trois Sava, un pour chacune de ces dilutions. D’autres concentrations dans la fourchette de mesure permet également à la préparation des échantillons de la CEI. Ce contrôle est utilisé pour comprendre la validité des résultats des tests pour la nano-formulation donnée. Selon l’USP, les résultats du test sont valables si le recouvrement de l’épi de la CEI (PPC) est entre 50 et 200 %4. Spike récupération et moins de 50 % signifie que le test-nanomatériau inhibe la détection d’endotoxines et, par conséquent, le test résultat sous-estimations endotoxine contamination et n’est pas valide. Spike récupération plus de 200 % suggère que la substance d’essai améliore le résultat de test ou contient un niveau trop élevé de l’endotoxine contaminante. Dans le cas de la mise en valeur, le résultat du dosage est aussi inexact. Exemples de telles ingérences et quelques moyens pour surmonter ont été décrites plus tôt12,15.

Lorsque vous effectuez la turbidité et épreuves chromogènes, il est recommandé d’utiliser une pipette de répéteur pour ajouter le réactif LAL à tous les échantillons. Le temps de fonctionnement moyen instrument est 7200 secondes. Cependant, la réaction peut être plus rapide ou plus lent avec certains lots du lysate. Dans les cas, lorsque la réaction est lente, on peut avoir besoin de changer les réglages de l’instrument à 9600 s ou plus. Ce changement permettra à l’étalon le plus bas à développer.

Doxorubicine liposomale pégylé est une formulation contenant un ingrédients pharmaceutiques actifs (API) à une concentration de 2 mg/mL. Il est utilisé en clinique comme une dose de 50 mg/m2. Pour convertir cette dose en mg/kg de portée, il est divisé par facteur 3727. La dose de doxorubicine liposomale pégylé en mg/kg, est donc de 1,35. Pour calculer EL, 5 (la dose seuil pyrogène en EU/kg) est divisée par 1,35 (la dose de Doxil en mg/kg) et obtenir 3,7 EU/mg4. Ce numéro signifie que pégylé doxorubicine liposomale à la dose de 1,35 mg/kg peut être en toute sécurité administré par heure unique si l’endotoxine dans la formulation n’excède pas 3,7 EU/mg, où mg fait référence à l’API.

Utilisez ensuite cette information pour calculer le MVD pour des dosages LAL. La sensibilité (lambda) de la turbidité, épreuve à développement chromogène et essais de gel-caillot présentés dans cette étude est de 0,001, 0,001 et 0,03 UE/mL, respectivement. MVD est donc 7 407 pour la turbidité et épreuves chromogènes ((5 EU/kg x 2 mg/mL)/0.001 UE/mL) et 247 pour l’essai de gel-caillot ((5 EU/kg x 2 mg/mL)/0.03 UE/mL).

Doxorubicine a un spectre d’absorption large qui chevauche la longueur d’onde de dosage de la chromogénique LAL28,29. En outre, la plupart des formulations de liposome sont turbides et apparaissent laiteuses. Cette turbidité inhérente est la cause très fréquente de l’interférence des liposomes avec test de turbidité. Dans le cas de la doxorubicine liposomale pégylé, les perturbations dues à la turbidité a été surmontée par la dilution cinq comme en témoignent les valeurs de récupération de pointe entre 50 et 200 % (tableau 1). Toutefois, à la doxorubicin dilution même concentration était encore assez élevée pour gêner le chromogénique LAL (tableau 1). Deux dilutions suivantes (50 et 500) a aidé à surmonter les interférences doxorubicine liposomale pégylé avec chromogénique LAL. Depuis l’essai de gel-caillot est indépendante de la turbidité et la couleur de l’échantillon, et le niveau de l’endotoxine dans la formulation se situe entre gel-caillot, la doxorubicine liposomale pégylé n’interfère pas avec l’essai de gel-caillot dilutions du tout testées. Dans cette étude de cas, plusieurs dilutions de doxorubicine liposomale pégylé ont été utilisées pour ces tests. Les dilutions 5, 50 et 500 pour la turbidité et chromogénique ainsi que 50, 100 et 200 pour le dosage de gel-caillot ont été choisies parce qu’ils sont dans le MVD. Le MVD de l’essai de gel-caillot est inférieur à celui de la turbidité et l’épreuve à développement chromogène LALs parce que la sensibilité de ce test est également plus faible. Si la formulation trafiqué le LAL à dilution 500, turbidité et épreuves chromogènes, l’analyse à des dilutions plus élevées (p. ex., 5 000, 6 000, 7 000 ou 7 407) pourrait être réalisée. Puisque le niveau de l’endotoxine obtenu à dilution 50 dans l’essai de gel-caillot était au-dessous de l’EL, l’analyse de cette formulation à des dilutions inférieures ne se faisait pas. Cependant, dans d’autres cas, l’essai pourrait être poursuivie à Dilutions 20, 10, 5 ou 2 pour indiquer le plus faible de ne pas interférer de dilution et de comprendre si le niveau de l’endotoxine dans la formulation est au-dessous de l’EL.

Il est important de mentionner que, pour l’essai de gel-caillot, il est essentiel d’éteindre la fonction de circulation d’eau dans le bain-marie pendant la durée de cet essai ou utiliser un bain d’eau sans cette option parce que le débit d’eau endommage le caillot et peut affecter la précision du g test LAL El-caillot. Il n’est pas toujours possible de surmonter des nanoparticules interférence avec des essais de LAL en augmentant les dilutions de l’échantillon. Des stratégies et des approches visant à surmonter les divers types de brouillage et des exemples de nanoparticules couramment ce qui représente un problème pour LAL dosages ont été traitées par d’autres groupes et nous ailleurs12,13,14 ,15,30,31. L’analyse présentée dans ce manuscrit est issu d’une formulation du modèle. L’expérience avec les autres nanoformulations peut être différente.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

L’étude a été financée par des fonds fédéraux de l’Institut National du Cancer, National Institutes of Health, sous contrat HHSN261200800001E. Le contenu de cette publication ne reflète pas nécessairement les vues ou les politiques du département de Health and Human Services, ni mentionne des noms commerciaux, des produits commerciaux, ou organisations impliquent l’approbation par le gouvernement américain.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Turbidity LAL Assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL Reagent Associates of Cape Cod T0051 This reagent can be used with turbidity assay only
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Chromogenic LAL Assay
Pyrochrome LAL Reagent Associates of Cape Cod CG1500-5 This reagent is specific to the Chromogenic Assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod EC010 This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Gel-Clot LAL Assay
LAL Reagent Associates of Cape Cod G5003 This reagent is specific to the gel-clot assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm Associates of Cape Cod TS050 These tubes are for use with the gel-clot assay
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Water bath, 37 C any brand Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36, (7), 454-461 (2016).
  2. Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview. Journal of Endotoxin Research. 11, (6), 333-339 (2005).
  3. Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS. Microbes and Infection. 4, (9), 903-914 (2002).
  4. US Pharmacopeia. Bacterial Endotoxins Test. (2011).
  5. FDA, U. Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. (2012).
  6. FDA, U. Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. (2015).
  7. Fennrich, S., et al. More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives. Alternatives to Laboratory Animals. 44, (3), 239-253 (2016).
  8. Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection. Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).
  9. Solano, G., Gomez, A., Leon, G. Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL). Toxicon. 13-18 (2015).
  10. Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples. International Food Research Journal. 19, (2), 423-425 (2012).
  11. Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test. Analytical Biochemistry. 409, (1), 46-53 (2011).
  12. Dobrovolskaia, M. A. Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy. Journal of Controlled Release. 220, (Pt B), 571-583 (2015).
  13. Dobrovolskaia, M. A., et al. Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations. Nanomedicine (London). 5, (4), 555-562 (2010).
  14. Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation. Nanomedicine (London). 9, (12), 1847-1856 (2014).
  15. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations. Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).
  16. Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System. Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).
  17. Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).
  18. Uhlig, S., et al. Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).
  19. Smulders, S., et al. Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods. Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).
  20. NCL. NCL assay cascade. Available from: https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols (2015).
  21. Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. Evaluation of nanoparticle immunotoxicity. Nature Nanotechnology. 4, (7), 411-414 (2009).
  22. Borton, L. K., Coleman, K. P. Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test. Altex. (2018).
  23. Stoppelkamp, S., et al. Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT). Drug Testing and Analysis. 9, (2), 260-273 (2017).
  24. Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines. Altex. 33, (1), 47-53 (2016).
  25. Barenholz, Y. Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. Journal of Controlled Release. 160, (2), 117-134 (2012).
  26. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays. Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).
  27. FDA, U. Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. (2005).
  28. Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking. Molecular Pharmaceutics. 7, (6), 1959-1973 (2010).
  29. Dabbagh, A., et al. Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition. International Journal of Hyperthermia. 31, (8), 920-929 (2015).
  30. Li, Y., et al. Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles. Nanotoxicology. 9, (4), 462-473 (2015).
  31. Li, Y., et al. Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation. Nanotoxicology. 11, (9-10), 1157-1175 (2017).
Détection d’endotoxines dans les Nano-formulations utilisant la Limulus Amébocytes Lysate (LAL)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).More

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter