Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

doi: 10.3791/58830 Published: January 30, 2019

Summary

זיהוי של endotoxins של ננו-חומרים מהונדסים מייצג אחד האתגרים הגדול ביותר בתחום של ננו-רפואה. כאן, אנו מציגים חקר מקרה המתארת את המסגרת המורכבת LAL שלושה פורמטים שונים כדי להעריך את פוטנציאל זיהום אנדוטוקסין בחלקיקים.

Abstract

כאשר נוכח מוצרים פרמצבטיים, אנדוטוקסין רכיב הקיר תא החיידק גראם שליליים (הנקרא לעתים קרובות גם ליפופוליסכריד) יכול לגרום דלקת, חום, היפו - או יתר לחץ דם, במקרים קיצוניים, יכול לגרום נזק לרקמות ו עוגב זה ייתכן להיות קטלני. כמויות אנדוטוקסין במוצרי תרופות, לכן, הם מווסתים. בין השיטות הזמינות אנדוטוקסין זיהוי, כימות, וזמינותו Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) הוא נפוץ ברחבי העולם. בעוד כל מוצר התרופות עלולות להפריע וזמינותו לל, ננו-ניסוחים מייצגים אתגר מסוים עקב המורכבות שלהם. מטרת מאמר זה היא לספק מדריך מעשי חוקרים מנוסים באומדן endotoxins של ננו-חומרים מהונדסים וסמים ניסח ננו-חלקיק. במסמך זה, המלצות מעשיות לביצוע שלוש תבניות LAL כולל עכירות, הדפסות כסף, ג'ל-קריש מבחני נידונות. מבחני אלה יכול לשמש כדי לקבוע אנדוטוקסין זיהום מוצרים מבוססי ננו-טכנולוגיה תרופות, חיסונים, adjuvants.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אנדוטוקסין היא אבן בניין של הקיר תא החיידק גראם שליליים1,2. זה יכול להפעיל את התאים החיסוניים ב מאוד נמוכה (picogram) ריכוזים1,2. המתווכים proinflammatory (ציטוקינים, לאוקוטריאנים, eicosanoids, וכו ') המיוצר על ידי תאי בתגובה אנדוטוקסין אחראים קדחת, תת לחץ דם, יתר לחץ דם, בעיות בריאות חמורות יותר, כולל אי ספיקת איברים מרובים 1 , 2 , 3. חומרת בתיווך החיסון תופעות המופעלות על-ידי אנדוטוקסין תלוי מחריפותו נקבעים על-ידי אנדוטוקסין הרכב ואת מבנה ומדד אנדוטוקסין הבינלאומי יחידות (IUs או EUs)3. המספר של יחידות אלה לכל קילוגרם של משקל גוף משמשת להגדרת מנה פירוגני הסף של אנדוטוקסין. מינון זה הוא ש-5 האיחוד האירופי לק"ג למוצרים סמים מנוהל באמצעות כל נתיבי אבל המסלול במחלה. סמים עצומות למטר מרובע של פני השטח של הגוף, נוזלים תוך-עיני, radiopharmaceuticals מוצרים מנוהל באמצעות מסלול במחלה יש מנה פירוגני סף שונות, אשר הוא 100 האיחוד האירופי/m2, האיחוד האירופי 0.2/mL, האיחוד האירופי 175/V (איפה V נפח של המוצר מיועד עבור ניהול), ו- 0.2 האיחוד האירופי לק"ג, בהתאמה4. פרטים נוספים אודות המנה פירוגני מסף סמים מוצרים והתקנים שונים הינם מסופקים, נדון במקום אחר4,5,6.

חיות להשתנות באופן נרחב את רגישותם בתיווך אנדוטוקסין תגובות. בני אדם, קופים, ארנבים הם בין המינים רגישים ביותר ביותר endotoxins3. כדי למנוע תופעות לוואי בתיווך אנדוטוקסין בחולים ולמנוע המסקנות לא מדויק של רעילות פרה ולימודי היעילות, זה חיוני כדי לזהות ולכמת endotoxins ניסוחים כיתה-קליניים ומחקרים קליניים מראש שני במדויק. מספר שיטות זמין כרגע ניתן להשיג משימה זו. אחד מהם הוא וזמינותו Limulus Amoebocyte Lysate (LAL), אשר נמצא בשימוש נפוץ ברחבי העולם מוצרים ביו מסך עבור פוטנציאל אנדוטוקסין לזיהום גם באשר לזהות זיהומים חיידקיים7,8,9. Lysate הוא מוכן מן amoebocytes, התאים הנוכחי בדם של הפרסה סרטנים Limulus פוליפמוס המתגוררים לחוף המזרחי של יבשת צפון אמריקה7. מעניין, יש כמה מינים שונים של סרטנים פרסה (Tachypleus גיגס , Tachypleus tridentatus) ב אסיה10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (טל) משמש במספר מדינות אסיה איתור אנדוטוקסין הדומה איך LAL משמש cuntries10. Lysates (LAL וטל) מכילים קבוצה של חלבונים המקנים בעת הפעלת פרוטאז פעילות. אחד החלבונים האלה, הגורם כביכול C מופעל בעת מגע עם אנדוטוקסין. C גורם שהופעל cleaves Factor B, אשר בתורו גם הופך פרוטאז ודבק אנזים קרישת pro כדי לייצר אנזים קרישת דם. התוצאה של תגובות שרשרת הזאת היא היווצרות של ג'ל, עלייה של עכירות מדגם ו, בנוכחות מצע הדפסות כסף, המראה של מוצר צבעוניים, אשר לשמש בסיס ג'ל-קריש דם, עכירות, מבחני הדפסות כסף, בהתאמה. אמנם יש תבנית LAL אין חובה, של מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) מסביר ההדרכה עבור תעשיית המסמך, כי במקרה של אי-התאמה בתוצאות הבדיקה בין פורמטים שונים לל, ההחלטה בהתבסס על וזמינותו ג'ל-קריש5 .

רבים נפוץ כימיקלים המעבדה (למשל., EDTA), סמים ידוע מוצרים (לדוגמה פניצילין) להפריע LAL מבחני11. ההפרעות מזוהה בדרך כלל על-ידי הערכת ההתאוששות של אנדוטוקסין תקן עלה בריכוז ידוע לתוך פתרון המכיל את החומר. אם השחזור ספייק הוא פחות מ- 50% או יותר מאשר 200%, אז התוצאה של LAL assay עבור החומר מבחן נתון אינו חוקי עקב עיכוב או שיפור, בהתאמה4. ניסוחים המבוסס על ננו-טכנולוגיה מורכבים לעיתים קרובות ומשבשים LAL באמצעות מגוון רחב של מנגנונים12,13,14. גישות רבות תוארו להתגבר על ההפרעות: שיחזור מדגם מאגרים ספציפיים, פיתחה, חלבון איון על ידי חימום, הרס של חומרי חלול מבוססי השומנים על ידי חימום ומשלימות את הדגימה. עם עודף קטיונים דו ערכיים5,12,13,14,15. שיטות אלטרנטיביות במצבים כאשר לא ניתן להתגבר על הפרעות LAL גם תוארו: אליסה, תא כתב HEK-TLR4 קו assay, ספקטרומטר מסה16,17,18, 19.

במסמך זה, מתוארים הליכים ניסיוני לעריכת ג'ל-קריש דם, עכירות, מבחני LAL הדפסות כסף. מבחני אלה הינם גם זמינים על אתר ננוטכנולוגיה אפיון מעבדה (NCL)20 בפרוטוקולים STE1.2 (עכירות LAL), STE1.3 (LAL ג'ל-clot) ו STE1.4 (LAL הדפסות כסף). מומלץ לבצע לפחות שתי תבניות שונות לאפיון הננו-ניסוח זהה. כאשר תוצאות של עכירות, הדפסות כסף LAL מסכימים, התוצאות ג'ל-קריש דם נחשבים5. כאשר התוצאות של שתי תבניות LAL מסכימים, נוספים הם ממצאי מחקרים באמצעות מונוציט הפעלת מבחן (MAT) או ארנב pyrogen מבחן (RPT) כדי לוודא LAL ערכו21. חשוב לציין כי כל שיטה המשמש לצורך זיהוי אנדוטוקסין לפירוגניות הערכה יש יתרונות ומגבלות21,22,23,24. הכרה במגבלות של ההליך שימוש כדי לאפיין את ניסוח ננוטכנולוגיה נתון חיוני להשגת הצדקה מדעית לשימוש של האופטימלית עבור הננו-ניסוח זה ההליך.

במחקר זה, שימש PEGylated liposomal דוקסורוביצין ניסוח nanoparticle מודל. ניסוח זה אושר על ידי FDA בארה ב בשנת 1995 ומשמשת לטיפול סרטן מטופלים ברחבי העולם25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנת דוגמאות ננו-חלקיק

  1. הכנת המדגם במחקר ב- LAL כיתה מים.
  2. אם ה-pH הדגימה מחוץ לטווח 6-8, להתאים את ה-pH באמצעות pyrogen ללא סודה קאוסטית או חומצה הידרוכלורית.
  3. באמצעות LAL כיתה מים להכין מספר דילולים המדגם במחקר. ודא כי דילול הגבוה ביותר לא יעלה על דילול מרבי חוקי (MVD). עיין בסעיף ' דיון ' לקבלת פרטים אודות MVD שערוך.

2. הכנת ריאגנטים משותף בין תבניות לל

  1. לדלל נתרן הידרוקסידי מרוכז מניות באמצעות מים ריאגנט LAL ללא pyrogen להכין את הפתרון עובד-ריכוז של 0.1 ש
  2. לדלל מלאי חומצה הידרוכלורית מרוכזת באמצעות ללא pyrogen לל ריאגנט מים ולהכין הפתרון עובד-ריכוז סופי של 0.1 ש
  3. הכנת אנדוטוקסין סטנדרטי שליטה (ס)
    1. לשקם ס להנדסה ולמדעיי המחשב על פי האישור של ניתוח המסופקים על ידי היצרן.
      הערה: עיין בסעיף הדיון עבור הערות חשובות בנוגע למידע הכלול באישור. עיין בטבלה של חומרים עבור הפרטים לגבי מספר קטלוג ויישום של ניסוח של ביה ס נתון בתבניות LAL שונות.
  4. הכנת הכימית לל
    1. לשקם הכימית לאל על פי האישור של ניתוח המסופקים על ידי היצרן.
      הערה: עיין בסעיף הדיון פרטים חשובים לגבי הכנה ריאגנט לל. עיין בטבלה של חומרים עבור הפרטים לגבי מספר קטלוג ויישום של ניסוח ריאגנט LAL נתון בתבנית LAL שונים.

3. עכירות LAL Assay

  1. הכנת הסטנדרטים כיול
    1. שימוש µL 900 LAL כיתה מים 100 µL של ביה ס, להכין כמה שיותר דילולים ביניים לפי הצורך, כדי לאפשר הכנת כיול סטנדרטי עם טווח הריכוז מ 0.001 האיחוד האירופי 1/mL.
    2. תחילה תווית צינורות ולהוסיף μL 900 LAL-כיתה מים לתוך כל שפופרת. לאחר מכן להוסיף 100 μL של solutionn של האיחוד האירופי/mL 10 להכין כיול סטנדרטי עם ריכוז של 1EU/mL.
    3. חזור על דילול 10-fold טורי כמתואר לעיל כדי להכין שלושה סטנדרטים כיול נמוכה יותר. ודא כי היה מוכן ארבעה סטנדרטים כיול ועד 0.001 האיחוד האירופי 1/mL.
  2. הכנה של פקדים איכות
    1. להכין בקרת איכות של האיחוד האירופי/mL 0.05 על ידי שילוב µL 50 של הפתרון של האיחוד האירופי/mL ביה ס 1 עם µL 950 מים LAL-כיתה.
      הערה: עיין בסעיף ' דיון ' לקבלת פרטים לגבי הכנה שליטה.
  3. הכנה של פקדים עיכוב/שיפור (חברת החשמל)
    1. להכין IEC עם ריכוז של האיחוד האירופי 0.05/mL על-ידי שילוב µL 25 של הפתרון של האיחוד האירופי/mL ביה ס 1 µL 475 של nanomaterial הבדיקה לדילול נתון.
      הערה: עיין בסעיף הדיון לפרטים נוספים.
  4. ניתוח ניסיוני
    1. לאפשר את המכשיר להתחמם על-ידי הפעלת הוא כ 30 דקות מראש. הגדרת אורך הגל זיהוי כדי 660 ננומטר כמו זה מתאים עכירות לל.
    2. היכנס על-ידי הקלדת את שם המשתמש והסיסמה.
    3. פתח את התוכנה (טבלה של חומרים) על-ידי לחיצה על הסמל המתאים על מסך המחשב.
    4. בחר לאסוף נתונים במסך הבית של התוכנה. הזן את המידע קבוצת הבדיקה מזהה ונתונים לחלל המתאים בכרטיסייה ' כללי ' במסך הבית.
    5. לחץ על הכרטיסיה חומרה לבחור את סוג מכשיר מתוך התפריט הנפתח.
    6. הגדרת אורך הגל זיהוי כדי 660 ננומטר כפי שהוא מתאים עכירות לאל על-ידי בחירת השיטה עכירות לל.
    7. ודא כי המספר הסידורי, מזהה המערכת ומידע יציאה טורית מופיעים על המסך. לחץ על אישור. לחץ על אישור שוב כדי לאשר.
    8. הזן את מזהה מדגם באותו סדר שהמדגם נבדק. השתמש ללחצני ברירת מחדל כדי להזין את שליטה שלילי, דגימות עיקול ו מבחן סטנדרטי.
    9. להכין צינורות כפולים עבור כל דגימה ולהוסיף 200 µL (מבחן היחס 4:1) או 100 µL (מבחן יחס 1:1) של שליטה שלילי (מים), סטנדרטים כיול, בקרת איכות, חברת החשמל ו מבחן חלקיקים לתוך צינורות זכוכית שכותרתו מראש.
    10. להוסיף 50 µL (מבחן היחס 4:1) או 100 µL (מבחן יחס 1:1) של ריאגנט LAL הראשון הבקבוקון הבדיקה, מערבולת זה בקצרה, והוספה לתוך מבחן חריץ של הקרוסלה כלי. אם היחס 1:1, הנפח של הכימית LAL לא 100 µL.
    11. חזור על הפעולות המתוארות לעיל לקבלת דוגמאות אחרות. תהליך דוגם אחד בכל פעם.
      הערה: עיין בסעיף הדיון לפרטים נוספים.

4. הדפסות כסף לל

  1. הכנת סטנדרטים כיול
    1. שימוש µL 900 LAL כיתה מים 100 µL של ביה ס, להכין כמה שיותר דילולים ביניים לפי הצורך, כדי לאפשר הכנת כיול סטנדרטי עם ריכוז של האיחוד האירופי 1/mL.
    2. באמצעות מים כיתה LAL µL 900 ו 100 µL של הכיול האירופי/mL 1 רגיל, להכין תקן כיול השני-ריכוז של האיחוד האירופי 0.1/mL.
    3. חזור על דילול 10-fold טורי כמתואר לעיל כדי להכין שני סטנדרטים כיול נמוכה יותר. ודא כי היה מוכן ארבעה סטנדרטים כיול ועד 0.001 האיחוד האירופי 1/mL.
  2. הכנת פקדים איכות.
    1. להכין בקרת איכות של האיחוד האירופי/mL 0.05 על ידי שילוב µL 50 של הפתרון של האיחוד האירופי/mL ביה ס 1 עם µL 950 מים LAL-כיתה.
      הערה: עיין בסעיף ' דיון ' לקבלת פרטים לגבי הכנה שליטה.
  3. הכנה של פקדים עיכוב/שיפור (חברת החשמל)
    1. הכן האיחוד האירופי 0.05/mL על ידי שילוב של 25 μL של הפתרון של האיחוד האירופי/mL ביה ס 1 עם μL 475 של מבחן nanomaterial.
      הערה: עיין בסעיף הדיון לפרטים נוספים.
  4. ניתוח ניסיוני
    1. לאפשר את המכשיר להתחמם על-ידי הפעלת הוא כ 30 דקות מראש. הגדרת אורך הגל זיהוי כדי 405 ננומטר כמו זה מתאים עכירות לל.
    2. פתח את התוכנה על ידי לחיצה על הסמל המתאים על מסך המחשב. היכנס על-ידי הקלדת את שם המשתמש והסיסמה.
    3. בחר לאסוף נתונים במסך הבית של התוכנה. הזן מידע קבוצת זהות ונתונים מבחן לחלל המתאים בכרטיסייה ' כללי ' במסך הבית.
    4. לחץ על הכרטיסיה חומרה לבחור את סוג מכשיר מתוך התפריט הנפתח. לבחור את המכשיר.
    5. ודא כי המספר הסידורי, מזהה המערכת ומידע יציאה טורית מופיעים על המסך. לחץ על אישור. לחץ על אישור שוב כדי לאשר.
    6. הזן את מזהה מדגם באותו סדר שהמדגם נבדק. השתמש בלחצני ברירת המחדל כדי להזין בקרה שלילית, דגימות עיקול ו מבחן סטנדרטי.
    7. להכין צינורות כפולים עבור כל דגימה ולהוסיף 200 µL (מבחן היחס 4:1) או 100 µL (מבחן יחס 1:1) של שליטה שלילי (מים), סטנדרטים כיול, בקרת איכות, חברת החשמל ו מבחן חלקיקים לתוך צינורות זכוכית שכותרתו מראש.
    8. להוסיף 50 µL (מבחן היחס 4:1) או 100 µL (מבחן יחס 1:1) של ריאגנט LAL הראשון הבקבוקון הבדיקה, מערבולת זה בקצרה, והוספה לתוך מבחן חריץ של הקרוסלה כלי. אם היחס 1:1, הנפח של הכימית LAL לא 100 µL.
    9. חזור על הפעולות המתוארות לעיל לקבלת דוגמאות אחרות. תהליך דוגם אחד בכל פעם.

5. ג'ל-קריש לל

הערה: זו assay מזהה הנוכחות של endotoxins במדגם בהתבסס על התצפית הויזואלית גילוי של קריש דם בצינור התגובה. השלבים ניסיוני שיפורטו להלן. להשתמש סדין הספסל כדי לתעד את התוצאות. גיליון ספסל זה לא חובה, דרכים אחרות של הקלטה התוצאות assay מקובלים גם. דוגמה כזו גיליון ספסל מסופק בחומרים משלים לנוחיות הקורא. למבדה (l) היא הרגישות של ג'ל-קריש וזמינותו והיא האיחוד האירופי 0.03 נקודות/mL.

  1. תווית צינורות התגובה רבים לפי הצורך כדי להתאים את מספר הבדיקה שנותחה דוגמאות. עיין בגיליון ספסל לקבלת פרטים אודות מספר משכפל בשימוש שלב 1, שלב 2, שלב 3 מתוך וזמינותו.
  2. ΜL 100 aliquot דגימת מים, פקדים או מבחן למחזור.
  3. הכן של ביה ס כך הריכוז הסופי שווה ל- 4λ.
  4. לשלב 100 μL של תקן הנ עם μL 100 דגימת מים או מבחן כדי להשיג את הריכוז הסופי של ביה ס של 2λ. חזור עוד שלוש פעמים כדי להשיג למדא, חצי-למבדה, רבע למדא.
  5. ודא כי הטמפרטורה באמבט מים היא 37 מעלות צלזיוס.
  6. להוסיף 100 μL של lysate לכל מבחנה, מערבולת בקצרה ומניחים על האצטבה עם כל הקברים לאמבט מים לשעה.
  7. היפוך ברכבת התחתית עם תנועה חלקה.
  8. תוצאות לתעד באופן ידני באמצעות "+" (חברת קריש) או "" (אין קריש דם או קריש דם חופשי) בגיליון ספסל.
  9. להמשיך עם הניתוח על פי ה USP ההימור 854; להשתמש בגליון ספסל תמיכה חומר

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הדוגמה של נתונים שנוצרו לאחר בדיקות ניסוח זה מבחני LAL מוצג בטבלה 1. PEGylated liposomal דוקסורוביצין התערב עם הדפסות כסף LAL-דילול 5. עם זאת, הפרעה זו הוכרע על ידי דילולים רבתי. שחזור ספייק היה בין 50 ל- 200%, כאשר ניסוח זה נבחנה ב דילולים 50 ו-500 עכירות ו לל הדפסות כסף, כמו גם דילול 5 בעכירות לל. כאשר הוא מותאם על ידי הגורם דילול, התוצאות היו עקביות בין דילולים, בשני מבחני. יתר על כן, התוצאות היו עקביות בין התבניות assay שלוש.

מבחן לדוגמה עכירות לל, האיחוד האירופי/mg (ספייק התאוששות, %) הדפסות כסף לל, האיחוד האירופי/mg, (ספייק התאוששות, %) ג'ל-קריש לל, האיחוד האירופי/mg (מבחן חוקי, כן או לא)
PEGylated liposomal דוקסורוביצין (ראה טבלה של החומרים)
דילול 5 0.01 (141) הפרעות < 0.75 (Y)
דילול 50 < 0.025 (187) 0.029 (82) < 1.5 (Y) *
דילול 500 < 0.25 (182) < 0.25 (86) < 3 (Y) * *

טבלה 1: זיהוי אנדוטוקסין ב- PEGylated liposomal דוקסורוביצין באמצעות LAL מבחני. מבחני PEGylated liposomal דוקסורוביצין נבדקה באמצעות עכירות, הדפסות כסף ו- LAL ג'ל-קריש. דוגמה הפרעות הוערך באמצעות IECs. ספייק השחזור מוצג בסוגריים. ערכים בין 50 ל- 200% נחשבים מקובל על פי 85 ההימור USP רגיל עבור זיהוי אנדוטוקסין4. * ו * * תוצאות הבדיקה של דוגמה זו התקבלו ב דילולים 100 ו- 200, בהתאמה. דילולים וזמינותו ג'ל-קריש הם שונים מאלה המשמשות הדפסות כסף, עכירות לל כי רגישות, מרבית חוקי לדילול assay הזה נמוכים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

במידע הנמסר פרוטוקול זה תואר קודם15,26 ומסתמך על מספר מסמכי רגולציה שפורסם על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA או ה-FDA) ואת ארצות הברית פרמקופיאה (USP)4 , 5 , 6 , 27, והוא גם זמין באתר NCL20 בפרוטוקולים STE1.2 (עכירות LAL), STE1.3 (LAL ג'ל-clot) ו STE1.4 (LAL הדפסות כסף).

מבחן-ננו מוכנות LAL ריאגנט מים או PBS סטרילי, נטולי pyrogen. ה-pH של המדגם במחקר חשוב כי נמוך (< 6) ו- pH גבוהים (> 8) יפריעו הביצועים המיטביים של lysate. אם ה-pH של המבחן-ננו-חלקיק הוא מחוץ לטווח 6-8, זה יכול להיות מותאם משתמש ללא pyrogen סודיום הידרוקסיד או חומצה הידרוכלורית. כאשר מבוצע התאמה כזו, זה חיוני כדי למנוע זיהום הדגימה של microelectrode. לכן, כדי לבצע הליך זה, aliquot קטן של המדגם הוא הסיר לתוך צינור נפרד, המשמש למדידת pH.

כאשר המדגם הינו מוכן PBS או מאגר נוסף, המאגר ריק כלולה גם בדיקה זו. הריכוז של כל nanomaterial הוא מקרה ספציפי. המבחן משמש כדי להעריך את כמות מזהם אנדוטוקסין לכל מיליגרם של המרכיב הפעיל (API). עם זאת, בהתאם לסוג של ננו-ניסוח, הריכוז יכול גם להיות משוער ב מ"ג של ניסוח הכולל או רכיב הכולל (למשל., זהב, כסף או ברזל עבור זהב וכסף חלקיקי תחמוצת ברזל, בהתאמה). המדגם נבדק מן המלאי באמצעות מספר דילולים להחלטתו של MVD. כל דילולים של המבחן-חלקיקים מוכנות באמצעות מים LAL-כיתה.

שלושה פרמטרים משמשים לחישוב את MVD. הם הגבול אנדוטוקסין (EL), את הדגימה לריכוז assay רגישות (λ)4. להשתמש בנוסחה הבאה לחישוב מגבלת אנדוטוקסין (EL): EL = K/M, כאשר K הוא מנה pyrogen הסף (למשל., 5 האיחוד האירופי/kg כפי שפורט במבוא) ו M הוא המינון המרבי של nanomaterial המבחן מיועדת לכל קילוגרם של הגוף משקל יחידה שעה4. כפי שצוין לעיל, ההערכה של EL עבור ננו משמש radiopharmaceutical או כמו מכשור רפואי מסתמך על מנה פירוגני הסף או נוסחה, לכן הוא שונה 5/M. פרטים אלה מוזכרים במבוא ונבדקים יכול להיות עוד יותר ב- USP ו- FDA הנחיות4,5,6. מגבלת אנדוטוקסין המומלצת עבור פתרונות אופטלמולוגיות והתקנים תוך-עיני מסופק ב- FDA המנחה עבור מוצרים אלה6. כאשר במודל חיה (למשל., העכבר) היה להשתמש בה כדי לקבוע את המינון של nanoformulation, מידע זה משמש כדי להעריך את המינון המקבילה האנושית כביכול (הד). הד מחושב על ידי חלוקת המינון בעלי חיים במקדם ההמרה, אשר הוא ספציפי על כל מיני בעלי חיים. לדוגמה, הגורם ההמרה הוא 12.3, 6.2 ו- 3.1 העכבר, העכברוש של הארנב, בהתאמה27. הליך הגיור ואת הרציונל לשימוש זה מתוארים בפירוט רב מנחה FDA27. ותרופות לסרטן לעיתים קרובות במינון לפי אזור הגוף השטח לידי ביטוי mg/m2. אחד באפשרותך לעקוב אחר מנחה USP לחישוב EL לסמים עצומות ב מיליגרם למטר מרובע או להמיר מנה זו לטווח מ"ג/ק"ג. ניתן לכוונן את המינון mg/m2 המינון באמצעות של פקטור המרה תלויי מין27מ"ג/ק"ג. לאדם מבוגר, זה 37 המוצע Km כדי להפנות המוני קבוע27. הגורם ק מ יש יחידות של kg/m2; . זה שווה משקל הגוף מחולק שטח מ ר (m2)27קילוגרמים (ק ג). לדוגמה, מינון או הד של 74 mg/m2 מקבילה 2 מ"ג/ק"ג או 74/37. כדי לקבוע MVD, השתמש בנוסחה הבאה, אשר זמין גם מתקן USP ההימור 85: MVD = (EL x ריכוז לדוגמה) / λ)4. בתרחיש היפותטי, ריכוז מדגם ננו-חלקיק הוא 10 מ"ג/מ"ל, המינון המקסימלי שלה העכבר הוא 615 מ"ג/ק"ג. במקרה זה הד הוא 615/12.3 = 50 מ ג/ק ג; EL עבור כל נתיבי למעט במחלה הוא האיחוד האירופי 0.1/mg (5 האיחוד האירופי/ק ג/50 מ"ג/ק"ג) MVD היא 1,000 ((0.1 mg/האיחוד האירופי x 10 mg/mL)/0.001 של האיחוד האירופי/mL).

לעתים קרובות, כאשר אחד צריך להעריך אנדוטוקסין מזהמים nanomaterial כיתה המחקר, המידע מנה אינה זמינה. יש אין הליך harmonized כיצד מעריכים את MVD EL לחומרים אלה. מקרה המחקר מבצעת את הבדיקה ישירות מן המניות (בדרך כלל הריכוז של פתרון זה הוא 1 מ"ג/מ"ל) ואת מספר דילולים, בדרך כלל 5-, 50-, 500 - ו 5,000-קיפולים. כאשר המינון, התוואי של ניהול, הריכוז לדוגמה, החדרת זמן השינוי nanomaterial מבחן נתון, EL MVD גם לשנות. לכן, יש להעריך את המידע ולבצע הערכה של אל ושל MVD בהקשר של פרמטרים נוספים הקשורים את כמות, זמן, נועד תוואי ניהול וריכוז של ניסוח נתון.

חשוב לציין כי את מספר קטלוג ומפרטי המוצר (למשל., האון, סכומים לכל מבחנה) של ס להנדסה ולמדעיי המחשב הן שונות עבור תבניות LAL שונות. ס להנדסה ולמדעיי המחשב בשימוש עכירות ש-LAL יכול לשמש גם ב- LAL ג'ל-קריש. עם זאת, ס להנדסה ולמדעיי המחשב עבור LAL הדפסות כסף הוא ספציפי לתבנית זו וזמינותו. ההוראות המפורטות להלן הן כלליות החלים ס להנדסה ולמדעיי המחשב בשימוש בכל הפורמטים וזמינותו. ס להנדסה ולמדעיי המחשב הוא ליפופוליסכריד e. coli (תקליטונים) שסופקו כאבקה lyophilized. תקן זה מוסמכת על ידי היצרן נגד הפניה סטנדרטי אנדוטוקסין (RSE) עם עוצמת האנרגיה הידועים. צריך להיות מחדש את תכולת המבחנה המכילה של ביה ס עם ~3.2 - 5.0 מיליליטר מים ריאגנט LAL ללא pyrogen. בנוסף ההבדל בין להנדסה ולמדעיי המחשב המשמש עבור תבניות שונות assay, הנפח של שיחזור הוא גם ספציפית כל חלקה של תקן זה. לכן, יש לחשב את הריכוז הסופי של הפתרון של ביה ס מניות עבור כל חלקה של התקן. החישוב מתבצע לפי עוצמת התקן ואת הסכום הכלול בכל מבחנה. האישור של ניתוח ספציפיות עבור כל הרבה אנדוטוקסין רגיל מכיל המידע על העוצמה ועל סכום לפי המבחנה. יש בקפדנות מערבולת התקן 30-60 שניות, במהלך את בנייתו מחדש והן במהלך השימוש. מומלץ גם לבצע את בנייתו מחדש באמצעות 5-10 דקות להתיישב פעמים, מעל 30-60 דקות מסגרת זמן כדי להבטיח כי כל lyophilized חומר נכנס פתרון. לפני השימוש בוזמינותו, equilibrate את המניה של ביה ס לטמפרטורת החדר. לאחר בנייתו מחדש, המניה של ביה ס יכול להיות בקירור לאחסון, יציב במשך ארבעה שבועות.

בדומה ס להנדסה ולמדעיי המחשב, הכימית LAL הוא גם ספציפי עבור כל תבנית. ההוראות המפורטות להלן הן כלליות החלים על כל תבניות assay לל. הכימית LAL מסופק כאבקה lyophilized. המלצות היצרן עוקבים צריך להשרות כל מבחנה. ניתן להשתמש במים כיתה LAL או מאגר עיכוב בטא-glucans. המאגר עיכוב בטא-glucans הוא העדיף במחקר במקרה זה משום שהיא מאפשרת למעט ההפרעות של בטא-glucans. זו הפרעה חיובי-false שכיחה מאוד אצל ננו כי אצטט תאית מסננים משמשים בדרך כלל במהלך סינתזה nanomaterial ולשמש מקור זיהום גלוקן15. בקבוקונים רוב ידרוש שיחזור לאמצעי הסופי של 5 מ. על סמך מעל 10 שנות הניסיון של המחברים עם זה וזמינותו, כבר הבחין כי הכללת מאגר זה מאט את התגובה, מחייבים הגדלת בפעם התפרצות המקסימלי בהגדרות המכשיר כדי לאפשר את כיל הנמוך ב ריכוז של האיחוד האירופי/mL 0.001 לפתח.

כדי להבטיח דילול מדויק במהלך הכנת תקנים, מומלץ להשתמש 10-fold צעדים דילול. טורי דילולים 10-fold ניתן להכין על ידי עולה µL 100 של המניה או תקן עם ריכוז גבוה יותר לתוך 900 µL של מים נטולי pyrogen. מאז הריכוז של המניה של ביה ס הוא בדרך כלל גבוה (~ 1,000 האיחוד האירופי/mL), הכנת דילולים ביניים עם ריכוזים של האיחוד האירופי/mL 100 ו- 10 מומלץ לפני הכנת את כיל assay עם ריכוז של האיחוד האירופי 1/mL. פרוטוקול זה מתוארים שני יחסי גודל בין הדגימה הבדיקה, lysate. למרות יחסי הן משמשות, ליניאריות עקומה היא קבילה אך לא אידיאלי כאשר נעשה שימוש ביחס 4:1 של המאגר עיכוב בטא-glucans (ראה טבלה של חומרים).

אותם הכללים כפי שתואר לעיל לגבי הכנת כיול סטנדרטי חלים גם הכנת פקדים איכות (QC). פקדים אלה משמשות לאימות וזמינותו פועלת כהלכה. זה מוכן על ידי עולה כמות ידועה של ביה ס לתוך המים ללא pyrogen. הריכוז של QC נבחר בדרך כלל באמצע הטווח וזמינותו. הטווח של עכירות LAL וזמינותו הוא האיחוד האירופי 0.001 ל- 1/mL. לכן, משמש QC-ריכוז של האיחוד האירופי 0.05/mL. ריכוזים אחרים בתוך הטווח assay יכול לשמש גם בהכנת בקרת האיכות.

הפקד שיפור עיכוב (חברת החשמל) נקרא גם בקרת המוצר חיוביות (PPC). זה מוכן על ידי עולה ריכוז ידוע של ביה ס לתוך הדגימה הבדיקה. הריכוז של חברת החשמל (PPC) נבחר בדרך כלל באמצע הטווח וזמינותו. הטווח של עכירות LAL וזמינותו הוא האיחוד האירופי 0.001 ל- 1/mL. לכן, חברת החשמל-ריכוז של האיחוד האירופי 0.05/mL משמש. כדי להכין את חברת החשמל צריך לשלב 50 µL של הפתרון של האיחוד האירופי/mL ביה ס 1 עם µL 950 של מבחן-nanoparticle. חברת החשמל היא מוכנים לכל לדילול מבחן-nanomaterial. לדוגמה, אם ננו-ניסוח נבדק דילולים שלוש (1:50, שבערך ו- 1:5, 000), יש להכין שלוש IECs, כל אחד מהם דילולים אלה. ריכוזים אחרים בתוך הטווח assay יכול לשמש גם כדי להכין את הדגימה IEC. פקד זה משמש כדי להבין את החוקיות של תוצאות הניסוי הננו-ניסוח נתון. על-פי USP, תוצאות הבדיקה תקפים אם ספייק ההתאוששות של חברת החשמל (PPC) הוא בין 50 ל-200%4. ספייק שחזור פחות מ- 50% כי הבדיקה-nanomaterial מעכב זיהוי אנדוטוקסין ו, לכן, במבחן התוצאה מעריך זיהום אנדוטוקסין ואמצעים אינו חוקי. ספייק שחזור מעל 200% עולה כי הבדיקה-חומר משפר את התוצאה assay או מכיל רמה גבוהה מדי של אנדוטוקסין משחיתה. במקרה של שיפור, התוצאה וזמינותו היא גם לא מדויק. דוגמאות של הפרעות כאלה כמה דרכים להתגבר עליהם כבר מתואר12,מוקדמת יותר15.

בעת ביצוע עכירות, מבחני הדפסות כסף, מומלץ להשתמש פיפטה משחזר להוספת הכימית לל כל הדגימות. הזמן מבצע מכשיר ממוצע הוא 7200 שניות. עם זאת, התגובה יכולה להיות מהר יותר או לאט יותר עם מסוימים הרבה lysate. המקרים, כאשר התגובה איטית, אחד ייתכן שיהיה עליך לשנות את הגדרות המכשיר כדי 9600s או יותר. שינוי זה יאפשר את כיל הנמוך ביותר לפתח.

PEGylated liposomal דוקסורוביצין היא ניסוח המכיל מרכיב התרופות פעיל (API)-ריכוז של 2 מ"ג/מ"ל. הוא משמש במרפאה מינון של 50 מ ג/מ2. כדי להמיר מינון זה טווח מ"ג/ק"ג, זה מחולק על-ידי גורם 3727. המינון של דוקסורוביצין PEGylated liposomal ב מ"ג/ק"ג, לכן היא 1.35. כדי לחשב EL, 5 (את סף pyrogen המינון של האיחוד האירופי/kg) מחולק ב- 1.35 (המינון של ודוקסיל ב מ"ג/ק"ג) ולקבל האיחוד האירופי/mg 3.74. מספר זה אומר כי PEGylated liposomal דוקסורוביצין במינון של 1.35 מ"ג/ק"ג יכול בבטחה להינתן לשעה אחת אם אנדוטוקסין בניסוח לא תחרוג 3.7 האיחוד האירופי/mg, איפה מ ג מתייחס ה-API.

בשלב הבא, להשתמש במידע זה כדי לחשב את MVD עבור מבחני לל. הרגישות (למבדה) של עכירות, הדפסות כסף, מבחני ג'ל-קריש שהוצגו במחקר זה הוא 0.001, 0.001 ו- 0.03 נקודות של האיחוד האירופי/mL, בהתאמה. לכן, MVD היא 7,407 עכירות, מבחני הדפסות כסף ((5 האיחוד האירופי/ק"ג x 2 mg/mL)/0.001 של האיחוד האירופי/mL), ו- 247 עבור וזמינותו ג'ל-קריש ((5 האיחוד האירופי/ק"ג x 2 mg/mL)/0.03 של האיחוד האירופי/mL).

דוקסורוביצין יש קשת רחבה ספיגת החופפים עם אורך גל וזמינותו של LAL הדפסות כסף28,29. יתר על כן, רוב ליפוזום ניסוחים הם עכורים, מופיעים חלבי. עכירות הגלום זו הסיבה נפוץ מאוד לולא התערבותו של ליפוזומים עם עכירות וזמינותו. במקרה של PEGylated liposomal דוקסורוביצין, ההפרעות עקב עכירות הוכרע על ידי דילול חמש כפי שמעידים הערכים שחזור ספייק בין 50 ל- 200% (טבלה 1). אולם, בבית דוקסורוביצין דילול באותו הריכוז היה עדיין גבוה מספיק כדי להפריע LAL הדפסות כסף (טבלה 1). שני דילולים עוקבות (50 ו- 500) עזר להתגבר PEGylated liposomal דוקסורוביצין הפרעה LAL הדפסות כסף. כיוון וזמינותו ג'ל-קריש דם הוא עצמאי של עכירות וצבע הדוגמה, הרמה של אנדוטוקסין בניסוח נמצא בטווח ג'ל-קריש דם, PEGylated liposomal דוקסורוביצין לא התערבו עם ג'ל-קריש וזמינותו דילולים נבדק בכלל. במחקר זה המקרה, דילולים מספר של דוקסורוביצין PEGylated liposomal שימשו מבחני אלה. דילולים 5, 50 ו 500 עכירות, הדפסות כסף, כמו גם 50, 100 ו- 200 עבור וזמינותו ג'ל-קריש נבחרו כי הם בתוך MVD. MVD של וזמינותו ג'ל-קריש דם הוא נמוך מזה של עכירות, LALs הדפסות כסף כי הרגישות של assay הזה גם הוא נמוך. אם ניסוח הפריע LAL-דילול 500 עכירות, מבחני הדפסות כסף, היתה אפשרות לבצע את האנליזה דילולים גבוה יותר (למשל, 5,000 6,000, 7,000 או 7,407). מאחר שרמת אנדוטוקסין לקבלו דילול 50 ב וזמינותו ג'ל-קריש היה מתחת למסילה, הניתוח של ניסוח זה-דילולים נמוכים יותר לא בוצעה. עם זאת, במקרים אחרים, הבדיקה יכול להיות נמשך-דילולים 20, 10, 5 או 2 כדי לזהות הנמוך לא להתערב דילול ולהבין האם רמת אנדוטוקסין בניסוח מתחת למסילה.

חשוב לציין כי עבור וזמינותו ג'ל-קריש זה חיוני כדי לבטל את פונקציית זרימת המים באמבט מים משך זמן זה וזמינותו או להשתמש באמבט מים ללא אפשרות כזאת כיוון זרימת המים פוגעת קריש הדם עשוי להשפיע על הדיוק של הג el-קריש LAL וזמינותו. . זה לא תמיד אפשרי להתגבר על הפרעה nanoparticle LAL מבחני על ידי הגדלת דילולים את הדגימה אסטרטגיות וגישות כמה להתגברות על סוגים שונים של הפרעות ודוגמאות של חלקיקים נפוץ המייצגים בעיה עבור מבחני LAL כבר נדון על-ידי קבוצות אחרות ואנחנו במקום12,13,14 ,15,30,31. ניתוח הנתונים שהוצגו בכתב יד זה מבוסס על ניסוח מודל. החוויה עם אחרים nanoformulations עשוי להיות שונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחקר נתמך על ידי כספים פדרליים של המכון הלאומי לסרטן, מכוני הבריאות הלאומיים, תחת חוזה HHSN261200800001E. התוכן של פרסום זה אינן משקפות בהכרח את ההשקפות או מדיניות של מחלקת הבריאות ושירותי האנוש של, ולא הזכיר של שמות מסחריים, מוצרים מסחריים, או ארגונים מעיד על ממשלת ארה ב.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Turbidity LAL Assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL Reagent Associates of Cape Cod T0051 This reagent can be used with turbidity assay only
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Chromogenic LAL Assay
Pyrochrome LAL Reagent Associates of Cape Cod CG1500-5 This reagent is specific to the Chromogenic Assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod EC010 This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Gel-Clot LAL Assay
LAL Reagent Associates of Cape Cod G5003 This reagent is specific to the gel-clot assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm Associates of Cape Cod TS050 These tubes are for use with the gel-clot assay
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Water bath, 37 C any brand Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36, (7), 454-461 (2016).
  2. Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview. Journal of Endotoxin Research. 11, (6), 333-339 (2005).
  3. Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS. Microbes and Infection. 4, (9), 903-914 (2002).
  4. US Pharmacopeia. Bacterial Endotoxins Test. (2011).
  5. FDA, U. Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. (2012).
  6. FDA, U. Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. (2015).
  7. Fennrich, S., et al. More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives. Alternatives to Laboratory Animals. 44, (3), 239-253 (2016).
  8. Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection. Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).
  9. Solano, G., Gomez, A., Leon, G. Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL). Toxicon. 13-18 (2015).
  10. Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples. International Food Research Journal. 19, (2), 423-425 (2012).
  11. Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test. Analytical Biochemistry. 409, (1), 46-53 (2011).
  12. Dobrovolskaia, M. A. Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy. Journal of Controlled Release. 220, (Pt B), 571-583 (2015).
  13. Dobrovolskaia, M. A., et al. Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations. Nanomedicine (London). 5, (4), 555-562 (2010).
  14. Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation. Nanomedicine (London). 9, (12), 1847-1856 (2014).
  15. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations. Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).
  16. Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System. Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).
  17. Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).
  18. Uhlig, S., et al. Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).
  19. Smulders, S., et al. Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods. Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).
  20. NCL. NCL assay cascade. Available from: https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols (2015).
  21. Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. Evaluation of nanoparticle immunotoxicity. Nature Nanotechnology. 4, (7), 411-414 (2009).
  22. Borton, L. K., Coleman, K. P. Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test. Altex. (2018).
  23. Stoppelkamp, S., et al. Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT). Drug Testing and Analysis. 9, (2), 260-273 (2017).
  24. Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines. Altex. 33, (1), 47-53 (2016).
  25. Barenholz, Y. Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. Journal of Controlled Release. 160, (2), 117-134 (2012).
  26. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays. Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).
  27. FDA, U. Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. (2005).
  28. Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking. Molecular Pharmaceutics. 7, (6), 1959-1973 (2010).
  29. Dabbagh, A., et al. Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition. International Journal of Hyperthermia. 31, (8), 920-929 (2015).
  30. Li, Y., et al. Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles. Nanotoxicology. 9, (4), 462-473 (2015).
  31. Li, Y., et al. Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation. Nanotoxicology. 11, (9-10), 1157-1175 (2017).
זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).More

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter