Summary
Galleria mellonella يخدم كنموذج اللافقاريات لداء المبيضات نشرها. هنا، نحن بالتفصيل العدوى البروتوكول وتقديم البيانات الداعمة لفعالية هذا النموذج.
Abstract
أنواع المبيضات هي commensals الفطرية المشتركة للبشر استعمار الجلد والأسطح المخاطية، والجهاز الهضمي. تحت ظروف معينة، يمكن أن كسا المبيضات منافذها الطبيعية أدى المنهكة التهابات الأغشية المخاطية الانتانات الجهازية جيدا كما تهدد الحياة، ومحور رئيسي للتحقيق بسبب معدلات وفيات عالية المرتبطة بها. وتوجد نماذج حيوانية لنشر العدوى لدراسة تطور المرض وتشريح خصائص المبيضات الإمراضية. هذه، يوفر النموذج العدوى واكسوورم Galleria mellonella أداة تجريبية فعالة من حيث التكلفة للتحقيق الفائق من ضراوة الجهازية. كثيرة أخرى البكتيرية وحقيقية النواة العوامل المعدية تم فعالاً درسوا في ميلونيلا G. فهم الإمراضية، مما يجعل من نظام نموذج مقبول على نطاق واسع. حتى الآن، يمكن أن يغير النتائج المظهرية الاختلاف في الأسلوب المتبع لتصيب G. mellonella وتعقيد تفسير النتائج. هنا، فإننا مخطط مزايا وعيوب نموذج واكسوورم الدراسة النظامية المبيضات المرضية واتباع نهج لتحسين إمكانية تكرار نتائج بالتفصيل. تمييز نطاق حركية الوفيات في ميلونيلا G. نتائجنا وتصف المتغيرات التي يمكن أن تعدل هذه الحركية. في نهاية المطاف، يقف هذا الأسلوب كنهج الأخلاقية وسريعة وفعالة من حيث التكلفة لدراسة ضراوة في نموذج لداء المبيضات نشرها.
Introduction
أنواع المبيضات هي كومينسالس البشرية المشتركة التي قادرة على الظهور كمسببات الأمراض الانتهازية في خيم والمرضى ديسبيوتيك. على الرغم من أن العديد من أنواع المبيضات يمكن أن يسبب المرض، المبيضة السبب الأكثر شيوعاً لداء المبيضات نشرها1،2. الأمراض الجهازية النتائج من المبيضة الوصول إلى مجرى الدم عن طريق أما الاختراق المباشر من الحواجز المضيفة سابقا تقييداً أو مقدمة في مواقع العمليات الجراحية وانتهاكات أخرى ل الجسم3. أنواع المبيضات الاستفادة من مجموعة من العمليات المسببة للأمراض أن تسبب الأمراض الجهازية داخل البلد المضيف بما في ذلك فيلامينتيشن وتشكيل بيوفيلم والتهرب من الخلايا المناعية والهروب والحديد الكسح4. في المختبر النهج الموجودة للتحقيق في الآليات المسببة للأمراض الفردية، ولكن النماذج الحيوانية تواصل تقديم أفضل خيار للتحقيق بأكملها المرض نتيجة5،6. بحوث سابقة مفصلة حالات كثيرة واعدة في المختبر التحقيقات من ضراوة الفشل في إعادة إنتاج في فيفو7،8. وهكذا، نماذج حيوانية لا يزال يتعين تقييم فوعة المجراة في. معظم الأمراض نماذج تعتمد على الفئران لتكون بمثابة بديل للإصابات البشرية على الرغم من عجز المبيضة بطبيعة الحال استعمار أنظمة مورين ك commensal9. نماذج اللافقاريات لداء المبيضات نشرها تشمل ديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس، الثمرة ذبابة melanogaster المورفولوجية، وواكسورم Galleria mellonella، على الرغم من المخاوف حول الخلافات الأساسية في الفسيولوجيا الأساسية، أعاقت درجات حرارة الجسم المضيف، وطرق التعرض على قبول واسع10،11.
وفي الآونة الأخيرة، اتخذ نموذج العدوى واكسورم ميلونيلا G. لنموذج القدرة الإمراضية لمجموعة واسعة من مسببات الأمراض البكتيرية والفطرية12،،من1314. مزايا هذا النموذج تشمل تكلفة منخفضة نسبيا، وزيادة الإنتاجية، وسهولة الاستخدام، وتقليل الشواغل الأخلاقية فيما يتعلق بالحيوانات اللبنة مقارنة بنماذج مورين. للباحثين، وهذا يترجم إلى زيادة القدرة على اختبار متعددة المتغيرات وفواصل الثقة أقوى والتجريب أكثر سرعة وتجاوز بروتوكولات الحيوان. زاي-ميلونيلا كانت بمثابة منصة لتقييم سرعة الفوعة المبيضة بعد اضطراب الجينات المطلوبة لتنظيم بيوفيلم تشكيل، وفيلامينتيشن، والجينات عبر يعزل السريرية11،15 ،16. أدرجت الدراسات الأخيرة تحقيق الفعالية المضادة للفطور استخدام mellonella زاي- تقييم الدوائية لنشاط المخدرات والمقاومة تحت في فيفو الإعدادات، وهي تتحدى خلاف ذلك ومضيعة للوقت 17،18. حتى الآن، قد تعقدت دراسات ضراوة المبيضة في ميلونيلا زاي- يقال أن ارتفاع مستويات التباين داخل التجارب وبروتوكولات غير متناسقة بين المجموعات البحثية التي تنتج تباين فوعة تعمل بين الفئران وواكسورمس11،،من1319،،من2021. هنا، فإننا مخطط بروتوكول ميلونيلا G. لتوحيد المبيضة العدوى، زيادة إمكانية تكرار نتائج التجارب الفوعة، وإثبات الاتساق مع دراسات تم وصفه مسبقاً من ضراوة في الفئران نماذج.
أظهرت الدراسات السابقة أن ينظم المبيضة التزاوج مثل نوع (MTL) موقعا على الكروموسوم 5 هوية الخلية والتزاوج اختصاص مماثلة إلى Saccharomyces cerevisiae وغيرها الفطريات أسكوميسيتي22. أن غالبية عزل المبيضة متخالف في محور MTL ، ترميز واحد من كل من MTL و MTLα الآليلات (MTL/α)، و عقيمة وبالتالي15، 23 , 24-فقدان واحد من الآليلات MTL من خلال فقدان هيتيروزيجوسيتي (لوه) أو طفرة يؤدي إلى متماثل MTL أو سلالات α MTLالتي يمكن أن تخضع لتبديل المظهرية من الدولة 'أبيض' عقيمة التزاوج المختصة في الدولة 'معتمة'25. وقد أبرزت أعمال سابقة أن فقدان هيتيروزيجوسيتي MTL يقلل أيضا من ضراوة في نماذج موريني العدوى الجهازية عبر سلالة مختلفة الخلفيات26. هنا، نحن التفصيل نموذج ميلونيلا G. داء المبيضات نشرها باستخدام مجموعة تجريبية مماثلة وراثيا لتصور مساهمة هيتيروزيجوسيتي MTL بضراوة في ميلونيلا غ. نظهر أن التكوين MTL تتأثر القدرة الإمراضية المبيضة ، حيث كانت MTLα سلالات أقل ضراوة فيما يتعلق MTL/α و MTL الخلايا، مماثلة للنتائج التي توصل إليها ضمن نموذج العدوى موريني26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تعتمد على استخدام تستضيف اللافقاريات جميع الأساليب المذكورة ولا تتطلب موافقة "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك).
1-"اليرقات واكسورم" galleria mellonella
- ترتيب اليرقات من تجار الجملة والموردين أن عدم الأخذ بالهرمونات أو المضادات الحيوية، أو العلاجات الأخرى لليرقات، والتي هي قادرة على شحن وتسليم العينات الحية.
- تأكد من شراء جميع اليرقات من نفس المورد خلال فترة التجريب. كن حذراً عندما يأمر اليرقات خلال أشهر الصيف كما تنخفض درجات حرارة تزيد عن 30 درجة مئوية بقاء اليرقات.
- رصد درجات الحرارة عبر مسار الشحن المتوقعة ووفقا لخطة الشحن والتسليم أو اختر الشحن المعجل للحد من تعرضها للظروف البيئية.
- عند وصول اليرقات، فحص كل حاوية لضمان توجد يرقات سليمة وصحية. سوف تكون مغمورة تماما أسفل الفراش، تتحرك، اليرقات صحية وامتلاكها تلون الأصفر/تان خفيفة مع بعض اليرقات التي تحتوي على علامات سوداء أو تغيير الألوان على طول الجسم.
- تخزين اليرقات في الحاوية في مساحة التهوية في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). اعتماداً على الشرط الأولى لليرقات، قد استخدموا لمدة تصل إلى أسبوعين.
2-الثقافة الإعداد للإصابة Galleria mellonella
ملاحظة: يجب أن تلبس الزي مختبر السليم في جميع أنحاء هذا الجزء من البروتوكول بما في ذلك القفازات ومعطف مختبر، وسلامة النظارات.
- جعل الخميرة ببتون سكر العنب لوحات السائل واجار (YPD). إعداد 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وحلول الإيثانول 70%.
- زراعة سلالات البيض جيم بالحقن بين عشية وضحاها في 3 مل YPD جديدة في أنابيب الثقافة القياسية على طبل الدورية في السرعة المتوسطة و 30 درجة مئوية.
- تدور الخلايا إلى الأسفل في 2,500 س ز لمدة 5 دقائق في أجهزة الطرد مركزي منضدية. من أجل إيقاف المادة طافية، مع الحرص على عدم تعكير بيليه الخلية.
- ريسوسبيند الخلايا تماما في 5 مل من برنامج تلفزيوني 1 x بيبيتينج أو فورتيكسينج المتكررة. كرر بالطرد المركزي واستثارة الخلايا في برنامج تلفزيوني أكثر مرتين لضمان إزالة كافة وسائط الثقافة.
- بعد أن يغسل نهائي، ريسوسبيند الخلايا في 1 مل من برنامج تلفزيوني وتحويلها إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي.
- إجراء مجموعة من تخفيف المسلسل في برنامج تلفزيوني لتوليد 1: 100، 1:1، 000، وسلسلة تمييع 1: 100.000.
ملاحظة: قد يكون تخفيف البديلة اللازمة للوصول إلى حساب الخلايا المطلوب.- استخدام هيموسيتوميتير، عد الخلايا من 1: 100 أو إضعاف 1:1,000. في معظم الأحيان، يوفر تمييع 1:1,000 حساب الخلية المناسبة للثقافات المبيضة .
- حساب التركيز الكلي للخلايا داخل الثقافة الأولية باستخدام الرياضيات الشبكة من هيموسيتوميتير، تهدف إلى تحقيق بين 30-300 الخلايا حسابها في وسط الشبكة 5 × 5. عداد الآلي خلية يمكن أن تستخدم كبديل لذلك؛ ومع ذلك، استخدام الكثافة البصرية لتحديد عدد خلايا تم تخيف كخلية مورفولوجيا (الحجم، الشكل، إلخ) يمكن أن تؤثر تأثيراً كبيرا على دقتها.
- باستخدام عدد خلايا المقاسة، جعل إضعاف جديدة 2.5x107 خلايا/مل في برنامج تلفزيوني x 1 في أنبوب ميكروسينتريفوجي. تمييع هذا سيكون بمثابة الأساس لكل تلقيح ميلونيلا G. مع المبيضة. وسيتطلب كل حقن 10 ميليلتر من هذه العدوى لجرعة 250,000 المبيضة الخلايا معدية.
- تأكيد دقة الجرعة المعدية بطلاء وحدة التخزين الصحيحة لتمييع 1: 100.000 100 مستعمرة تشكيل وحدات (كفوس) في أجار YPD لكل ثقافة لاستخدامها في حالات العدوى.
- احتضان الخلية عدد لوحات من الخطوة 2.7 لمدة 48 ساعة (ح) عند 30 درجة مئوية وحساب عدد المستعمرات للوحة الواحدة. بين 80 و 120 المستعمرات يشكل نطاق مقبول للدقة في العدوى.
3-الإصابة بيرقات Galleria mellonella مع الثقافات المبيضات
ملاحظة: يجب أن تلبس الزي مختبر السليم في جميع أنحاء هذا الجزء من البروتوكول بما في ذلك القفازات ومعطف مختبر، وسلامة النظارات.
- إضافة 1 مل من الإيثانول 100% و 1 مل من 1 x برنامج تلفزيوني لأنابيب ميكروسينتريفوجي منفصلة اثنين. سيتم استخدام الإيثانول وبرنامج تلفزيوني لغسل إبرة حقن بين الإصابات.
- انتشار كمية صغيرة من الأسرة واكسورم في فارغة، طبق بتري معقمة 100 × 15 ملم، الذي سيضم اليرقات بعد التطعيم لكل سلالة مستقلة. بالإضافة للفراش يحد التزام قتلى ميلونيلا G. اليرقات على سطح طبق بيتري.
- تعقيم ز 26، 10 ميليلتر حقنه بتناول ومحو 10 ميليلتر من الإيثانول 70% تليها ثلاث مرات يغسل الثلاثة مع 10 ميليلتر من 1 x PBS. دوامة تمييع التطعيم المبيضة ويستغرق 10 ميليلتر للثقافة. التأكد من أن هناك لا فقاعات الهواء داخل محقن حقن الهواء يشجع الموت وستؤدي إلى تعقيد التحليل المتلقين للمعلومات.
- فتح حاوية عقد اليرقات ميلونيلا G. وعناية اقلب الفراش بأصبع للكشف عن يرقانات. حدد اليرقات وفي صحة جيدة كما حددتها حركة نشطة ولون ضوء الأصفر/تان، ونقص تصبغ أسود على جسم اليرقات. هذه اليرقات يجب من حجم مماثل عبر كامل التجريبية تعيين.
- تلتقط يرقات واحدة والاحتفاظ بها بلطف بين الإبهام والإصبع الأوسط مؤشر مماثل لعقد قلم رصاص. لفة اليرقات على ظهرها حتى الساقين هي مواجهة. عقد كامل طول الجسم بين الأصابع والإبهام حيث يكون غير قادر على الضفيرة أو سحب بعيداً عن الحقن اليرقات.
ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، تعقيم موقع الحقن باستخدام مسحه القطن غارقة في الإيثانول 100%. - استدارة المحاقن حيث يواجه شطبه الإبرة وإدراج تلميح إبرة بما في ذلك طول المجسم مشطوف الحواف في الجسم عند التقاطع مع الساق اليسرى الجالسين ببطء. التأكد من أن الإبرة تخترق الجسم، ولا يدفع ببساطة جسم الداخل اليرقات. لا تستخدم القوة في اختراق الجسم كما الإبرة قد بيرس تماما عن طريق اليرقات بسرعة. وسيؤكد رفع بلطف مع الإبرة الاختراق مناسبة. حقن العدوى المبيضات ميليلتر الكامل 10 واستخراج الإبرة.
- كرر الخطوة 3، 3 إلى 3.5 لكل اليرقات. للحيلولة دون تسوية، دوامة المبيضات خلية الثقافات للتطعيم بعد كل حقن الثالثة. كعنصر تحكم، حقن مجموعة من ميلونيلا زاي- 10 ميليلتر من 1 X PBS.
- 10 البيت المشارك اليرقات حقن من نفس الثقافة المبيضات في كل طبق بيتري 100 × 15 ملم بعد التطعيم. احتضان اليرقات في 37 درجة مئوية لمدة ثمانية أيام، فحص يرقات كل 24 ساعة لرصد الموت.
- تقييم معدل الوفيات في البداية التي تصبغ مظلمة، وتشكيل هيئات، أو بقع سوداء، وانعدام الحركة. للتأكد من معدل الوفيات، استخدام الملقط للفة بلطف اليرقات المحتضرة على ظهورهم وكزه خفيفة الجانب السفلي اليرقات مع الملقط. هو سجل عدم الاستجابة كما لوحظ عدم وجود حركة الجسم أو الساق تظهر كالموت وتتم إزالة اليرقات من طبق بيتري.
- تسجيل وفيات اليرقات على مدى الزمن. اليرقات التي تبدأ في بوبات إلى العث يمكن تضمينها في التحليل ولكن ينبغي إزالتها إذا أنها تبدأ بتساقط. يمكن للرقابة اليرقات بوباتينج من نقطة نهاية تحليل الاختلافات ضراوة بين اليرقات وعذراء غير واضحة.
- تقييم الأهمية الإحصائية باستخدام اختبار الإحصائية رف-كوكس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا، علينا أن نظهر أسلوب استنساخه لاستخدام ميلونيلا G. واكسورمس للتحقيق في نموذج نشر داء المبيضات العدوى استخدام المبيضة. التخزين المناسبة، والصيانة، واختيار يرقات للعدوى عنصر حاسم في تأمين إمكانية تكرار نتائج في وفيات G. ميلونيلا (الشكل 1أ). صحية اليرقات النشطة، لون ضوء الأصفر/تان، والافتقار إلى أسود بقع على الجسم ينبغي أن تستخدم لهذا النظام، وهي عادة صالحاً للإصابة تصل إلى أسبوعين عقب وصولهم. للتقليل من أي آثار الخلط المحتمل لفسيولوجيا G. ميلونيلا ، اختير اليرقات متشابهة الحجم والوزن. العدوى المختلطة جيدا وحقن يتفق في نفس الموقع التشريحية للجسم اليرقات أيضا الوقوف كمتغيرات هامة في تعزيز إمكانية تكرار نتائج بين التجارب. صور عرض صيانة يرقات المصابة من خلال فترة التجريب (الشكل 1ب).
لتقييم أثر سن اليرقات في الفوعة، أجريت التهابات مراقبة برنامج تلفزيوني منفصلة مع اليرقات أما صفر أو عشرة أيام بعد وصوله إلى. لا يوجد فرق كبير في حركية الموت ميلونيلا G. موجودة بين هذه المجموعات (الشكل 2أ). العلامات المميزة للمرض تنشأ في اليرقات من كلا الفريقين أن يستسلم للعدوى؛ أصبح مشوه التلون الأصفر/تان أصلاً من اليرقات وأفسحت المجال أمام بقع سوداء قبل الخسارة الكلية للحركة، وفي نهاية المطاف، الموت (الشكل 2ب). عدوى المبيضة يسرع عملية تلون والاعتلال ولكن لم يغير كثيرا من سلسلة العلامات المظهرية مما أدى إلى وفاة مقارنة بيرقات مصابة أو برنامج تلفزيوني تحقن اليرقات (الشكل 2-ج).
أيضا إلى حد كبير آثار الجرعة المعدية حركية وفيات الإصابات G. ميلونيلا . لتقييم آثار حجم العدوى المبيضة ، نحن المصابين ميلونيلا G. أربعة يعزل سريرية مختلفة (ج 12، P60002، P75010، و SC5314: الجدول 1) في ثلاث جرعات مختلفة. عرض اليرقات المصابة مع SC5314 وفيات في كل جرعة، تمشيا مع زيادة القدرة الإمراضية لعزل هذا بالنسبة لمعظم البلدان الأخرى المستخدمة في هذه التجربة (الشكل 2د). اليرقات أكثر متأثرين بالإصابة مع 1.0 × 105 خلية SC5314 أو ج 12 مقابل 1.0 × 104 خلايا. ثبت جرعة أعلى من 1.0 × 106 خلايا مفرطة مميتة مع اليرقات الموت بعد الإصابة بسلالات كافة بما في ذلك عزل أقل ضراوة، و P60002، وجيم 12 يرقات حقن ب P75010 و SC5314 متأثراً بالإصابة خلال 24 ساعة، مما يوحي جرعة معدية أكثر اعتدالا المناسب لتحديد الاختلافات في الفوعة. ونتيجة لذلك، استخدمت جرعة معدية 2.5x105 لجميع التجارب اللاحقة.
إلى إظهار التشابه في ضراوة بين الفئران ونماذج ميلونيلا زاي- الأمراض الجهازية، نحن جزيئي الفوعة سلالات المستمدة من SC5314 المبيضة ترميز أما متخالف (/α أو متماثل (/--أو Α/--) MTL المكاني. عدوى ميلونيلا G. heterozygotes MTL من SC5314 أو بروتوتروفيك مشتقات BWP17 الوراثية خلفيتها إنتاج معدلات عالية من الوفيات مقارنة ببرنامج تلفزيوني حقن الحيوانات. نجا ثلاثة أرباع اليرقات عنصر التحكم إلى يوم 8 مقابل خسارة ما يزيد على نصف جميع المبيضة حقن الحيوانات في غضون 3 أيام بعد العدوى (dpi) التي زادت على 8 نقطة في البوصة (الشكل 3أ، 3). قلل الفتك المبيضة في هذا النموذج بالعدوى مع BWP17 (بقاء نسبة 27 في المائة بالمقارنة مع بقاء نسبة 4 في المائة في SC5314 heterozygotes MTL في 8 نقطة في البوصة؛ الشكل 3 ج، 3D). ميلونيلا G. اليرقات المصابة مع MTLα/-سلالات نجا أطول بشكل ملحوظ مقارنة بالسلالات الأبوية متخالف MTL (رتبة سجل الاختبار, SC5314; p = 0.0006، BWP17؛ p = 0.0002). من المثير للاهتمام، يقابل فوعة MTLالخلاياالبيض جيم نظيرتها متخالف MTL في الخلفيات SC5314 و BWP17 على السواء. وهكذا، تكوين MTL لها تأثير على ضراوة المبيضة مع MTLα/-سلالات عرض القتل انخفض بالمقارنة مع MTL/α أو MTL/خلايا.
الشكل 1 . نظرة عامة حول الإجراء العدوى. (أ) مخطط انسيابي يسلط الضوء على العناصر الأساسية للإجراء العدوى بما في ذلك ترتيب وتخزين اليرقات وإعداد الثقافة العدوى، والحقن. (ب) صور الممثل تظهر ظروف التخزين السليم، إعداد الإصابة بالفضاء، والحقن، واليرقات الصيانة بعد الإصابة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . آثار إجراءات العدوى G. ميلونيلا . (أ) عناصر برنامج تلفزيوني أصيبوا فور وصولهم (برنامج تلفزيوني-D0، الأزرق) أو بعد 10 أيام (برنامج تلفزيوني-D10، الأحمر). (ب) إبراز الصور التمثيلية تلون اليرقات والموت. (ج) صورة سلسلة من لوحات العدوى بالتفصيل آثار الحقن مع برنامج تلفزيوني (الأوسط) أو مع SC5314 (السفلي) مقارنة بيرقات مصابة (أعلى) في أيام 1 و 3, 5 و 7 بعد الحقن. (د) آثار الجرعة تظهر ضمن مجموعة من المستخلصات السريرية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . MTLاليل يشجع قتل المبيضة ميلونيلا G.. MTL موضع متخالف (/α) ومتماثل (/-و α/-) SC5314 المشتقات (ج) (أ) و BWP17 المرسومة لوفيات اليرقات على مدى ثمانية أيام. فواصل الثقة المرسومة لكل SC5314 (ب) و BWP17 (د) السلالة مشتقة لتسليط الضوء على الاتساق في حركية وفيات اليرقات عبر التجارب. يتم رسم المتوسط (خط متصل) مع الانحرافات المعيارية (شغل في الفضاء) ل replicates البيولوجية ثلاثة من كل 10 يرقات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| سلالة المبيضات | السلالة الأبوية | النمط الوراثي | MTL | مرجع |
| MAY1 | SC5314 | عزل المبيضات البيض السريرية | /α | وو et al. 2007 |
| MAY6 | P60002 | عزل المبيضات البيض السريرية | (أ) | وو et al. 2007 |
| MAY11 | P75010 | عزل المبيضات البيض السريرية | /α | وو et al. 2007 |
| MAY15 | ج 12 | عزل المبيضات البيض السريرية | (أ) | وو et al. 2007 |
| MAY61 | SC5314 | متلا:: SAT1 | Α/- | هذه الدراسة |
| MAY71 | SC5314 | MTLα:: SAT1S tac1::TAC1-التجارة والنقل-هيجر | /- | هذه الدراسة |
| MAY313 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-arg4-ura3-BN sir2::his1/sir2::dpl200 | /α | هذه الدراسة |
| MAY314 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-BN sir2::HIS1/sir2::dpl200 | Α/- | هذه الدراسة |
| MAY315 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-BN sir2::HIS1/sir2::dpl200 | /- | هذه الدراسة |
الجدول 1- S المبيضةالقطارات المستخدمة في هذه الدراسة.
| العنصر المتغير | التحكم المقترحة | مرجع |
| عمر اليرقات في الوقت لحقن | التقليل من الوقت بين وصول الدودة والتطعيم | هذه الدراسة |
| حجم اليرقات في الوقت لحقن | كفالة الاتساق عند اختيار الديدان | فوكس وآخرون 2010 |
| الصحة اليرقات في الوقت لحقن | الديدان خلال درجات الحرارة المعتدلة، واستخدامها على الفور لدى وصوله | هذه الدراسة |
| الجرعة المعدية مع المبيضة | حدد بتركيز معدية الذي يمثل أوسع مجموعة من النتائج | هذه الدراسة |
| اليرقات واستجابة لحقن | إجراء برنامج تلفزيوني حقن الضوابط جنبا إلى جنب مع الديدان مع لا حقن | هيراكاوا et al. عام 2015 |
الجدول 2. الاعتبارات فيما يتعلق ميلونيلا G. العدوى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نموذج واكسورم ميلونيلا G. تقف كأداة فعالة لتحليل سريع واستنساخه من ضراوة المبيضة . هذا البروتوكول مفصلاً يعتمد على التسليم متسقة من جرعة المعدية المحددة إلى نفس الموقع عبر دفعة يرقات. الجرعة المعدية تأثيراً عميقا على وفيات ميلونيلا G. بينما استخدام اليرقات بين وصولهم الأولى وعشرة أيام بعد استلام نتائج مماثلة. خسارة البيكانسمتل جيم-اليل ينتج انخفاض ضراوة متسقة مع التجارب السابقة في الفئران على الرغم من أن تعطيل اليل α MTLلم يغير موت اليرقات.
نتيجة العدوى ميلونيلا G. يمكن أن تتأثر إلى حد كبير بالتصميم التجريبي. وعلى النقيض من الفقاريات نماذج من العدوى، قد تؤثر على تباين صغيرة في موقع الحقن وحجم العدوى، والعدوى حجم تفسيرات للبيانات. التهابات مع إعداد متزايدة من الخلايا المبيضة أدت إلى اعتلال أكبر وأسرع من اليرقات المصابة. عند نقطة معينة، يظهر الحقن كثيرة جداً المبيضة قادرة على الساحقة دفاعات المضيف مما يؤدي إلى الموت السريع للبلد المضيف، ويحتمل أن تكون من خلال صدمة سامة. ومع ذلك، كان SC5314 استمرار سلالة الأكثر ضراوة في كل جرعة، تليها ج 12، ومن ثم سلالات أخرى. وهكذا، معلمات العدوى لها تأثير عميق على حركية مطلقة من الالتهابات لكن قد لا يزال تقديم تقديرات لضراوة النسبي. كذلك أظهر العمل السابقة في إطار هذه التجارب أهمية دقة غسل الخلايا المبيضات . YPD المتبقية المدرجة في بلعه الحقن إلى حد كبير يقلل من بقاء اليرقات (البيانات لا تظهر).
دودة الصحة متغير حرجة عند إجراء تجارب G. ميلونيلا . يرقات نقلها باستخدام الشحن القياسية في منتصف فصل الصيف كثيرا ما تصل إلى الذين تتراوح أعمارهم بين قبل الأوان أو أكد، مغطاة ببقع سوداء، مع استمرارية انخفاض. وقد لوحظ أي دور كبير لحجم اليرقات في المراضة سابقا على الرغم من أن التجارب الموضحة هنا ركزت على المعايرة اليرقانات الشامل يعادل تقريبا. يجب دائماً تشغيل اليرقات صحية وبرنامج تلفزيوني مراقبة اليرقات جنبا إلى جنب مع مجموعات العدوى حساب بأي تغييرات في بقاء اليرقات بين replicates البيولوجية التي يؤديها في أيام منفصلة. ميلونيلا G. إصابة عشرة أيام بعد وصوله إلى مطابقة الحركية اليرقات المصابة فورا عند الاستلام. وهكذا، يمكن أن توفر شحنة واحدة من اليرقات كافية من المواد والوقت للقيام بتجارب كاملة. هذه التجارب تعتمد عليها الحيوانات 30 كل سلالة لتحديد الاختلافات في الفوعة، وهو أكثر بكثير من الحيوانات مما يستخدم عادة في نماذج مورين، أسفر عن الثقة أقوى من نتائج الملاحظة11،27 , 28-هذا النموذج أيضا تخفيض الشواغل الأخلاقية والوقت والتكاليف مقارنة بنماذج الفقارية للإصابة. وهكذا، استخدام يرقات الشمع قد يسهل تحديد الآثار أصغر بضراوة النظامية مما هو ممكن في نظم أخرى.
المحاذير الكامنة للنظام ميلونيلا G. موجودة التي تحد من فائدتها في دراسة التفاعلات بين المضيف الممرض. أولاً، ميلونيلا زاي- تفتقر إلى نظام المناعة تكيفية ولا يمكن استخدامه للتحقيق في أنتيجينيسيتي أو الذاكرة المناعية كما هو الحال في أعلى حقيقيات النوى29. جسم اليرقات يتألف من تجويف مستمرة واحدة مليئة hemolymph، التي تعمل على توزيع المواد الغذائية، مما يشير إلى الجزيئات والخلايا المناعية الببتيدات المضادة للميكروبات. هذه الخلايا المناعية، هيموسيتيس، تتصرف بشكل مشابه إلى العَدلات ويمكن ذلك البلعمه وتوليد مؤكسد رشقات نارية وإفراز إنزيمات الحال بعد التنشيط من خلال الاعتراف بالممرض خارج الخلية مستقبلات30. حتى الآن، هذه الوظيفة هي مجموعة فرعية عمليات الخلايا المناعية الفطرية داخل نظم حبليات التي قد لا تعكس تماما جميع الأنشطة الكريات البيض. التحذير رئيسي آخر هو عدم جمعية الجينوم ل mellonella زاي- على الرغم من أن الجينوم تسلسل مؤخرا31. ونتيجة لذلك، لا يعرف مدى أوضح التنوع داخل الأنواع ويرجح معظم الموردين السفينة السكان وراثيا غير المتجانسة التي يمكن أن تؤثر على معدل الوفيات عبر التجارب. وعلاوة على ذلك، التقنيات الجزيئية لا توجد للكائن الحي وتعقيد أي محاولات لتشريح المضيفة مساهمات المرضية. حتى الآن، الفوعة تتسق النتائج عقب عدوى المبيضة عبر التجارب، البائعين، والوقت، ومختبرات تدعم فائدتها في المسائل الأساسية المتعلقة بالقدرة الإمراضية.
تخفيض الخسارة MTL ضراوة المبيضة بالنسبة MTL heterozygotes والخلفيات homozygote α MTL. وهذا الاتجاه ينسجم مع السابقة العمل المنجز باستخدام نماذج الماوس من ضراوة الجهازية26. على النقيض من نماذج مورين، لم يغير فقدان MTLα ضراوة بالنسبة MTL/α الأبوية سلالة. التناقض بين هذه النتائج غير واضحة ولكن قد تشمل عناصر مناعة التكيفية التي في عداد المفقودين في الكائنات اللافقارية. وبدلاً من ذلك، قد تكون زيادة ضراوة المرتبطة هيتيروزيجوسيتي MTL تعزى فقط إلى اليل α MTLفي SC5314، بوتينتياتينج الحاجة إلى تقييم عبر خلفيات متعددة والسلالة. ولذلك، فإننا نقترح بدور تفاضلية لضراوة بين الآليلات MTL اثنين.
إجمالاً، الطراز ميلونيلا زاي- بمثابة نموذج السريع واستنساخه لتقييم داء المبيضات النظامية. يمكن جزيئي قراءات أخرى من ضراوة مع هذا الطراز بما في ذلك انتشار الفطريات بطلاء اليرقات هوموجيناتي لتشكيل وحدات (كفوس)11 أو الإضاءة الحيوية، الذي يوفر أيضا التعريب الفطرية32مستعمرة. في المستقبل، ويمكن توسيع هذا النموذج لتقييم الخصائص الفوعة الأنواع المبيضات الأخرى مثل مقاومة المخدرات مرتفعة في الناشئة حديثا أوريس المبيضات الأنواع33. التطوير المستمر لأدوات لتصور اللمفاويات داخل ميلونيلا زاي- التفاعل مع إصابة المبيضات، الأنساب واكسورم الفطرية للحد من التقلب في نتائج العدوى، والتصور لعملية المعدية عن طريق المراسل المبيضات خطوط34 سوف صقل هذا النموذج من المرض وتسمح التحقيقات أعمق في فيفو التفاعلات الممرض المضيف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب تود أن تقر مساعدة واشنطن باميلا وأندرسون ليا في الحصول على Galleria mellonella لاستخدامها في هذه الدراسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Snackworms.com | Buy twice as many worms as expected to use | |
| 10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe | Hamilton | 80000 | |
| Petri dish, 100X15 mm, 500 pack | Fisher | FB0875712 | |
| Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack | VWR | 87003-294 | |
| Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL | VWR | 97062-818 | |
| Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL | Millipore Sigma | EM-EX0276-1S | |
| autoclaved ddH2O |
References
- Kauffman, C. A., et al. Prospective multicenter surveillance study of funguria in hospitalized patients. The National Institute for Allergy and Infectious Diseases (NIAID) Mycoses Study Group. Clinical Infectious Diseases. 30 (1), 14-18 (2000).
- Horn, D. L., et al. Epidemiology and outcomes of candidemia in 2019 patients: data from the prospective antifungal therapy alliance registry. Clinical Infectious Diseases. 48 (12), 1695-1703 (2009).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clinical Microbiology Reviews. 20 (1), 133-163 (2007).
- Sardi, J. C., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 1 10-24 (2013).
- Segal, E., Frenkel, M. Experimental in Vivo Models of Candidiasis. J Fungi (Basel). 4 (1), (2018).
- Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L. Animal models for candidiasis. Current Protocols in Immunology. 105, 11-17 (2014).
- Heymann, P., et al. The siderophore iron transporter of Candida albicans (Sit1p/Arn1p) mediates uptake of ferrichrome-type siderophores and is required for epithelial invasion. Infection and Immunity. 70 (9), 5246-5255 (2002).
- Priest, S. J., Lorenz, M. C. Characterization of Virulence-Related Phenotypes in Candida Species of the CUG Clade. Eukaryotic Cell. 14 (9), 931-940 (2015).
- Savage, D. C., Dubos, R. J. Localization of indigenous yeast in the murine stomach. J Bacteriol. 94 (6), 1811-1816 (1967).
- Ewbank, J. J., Zugasti, O. C. elegans: model host and tool for antimicrobial drug discovery. Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 300-304 (2011).
- Amorim-Vaz, S., Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. Examining the virulence of Candida albicans transcription factor mutants using Galleria mellonella and mouse infection models. Frontiers in Microbiology. 6, 367 (2015).
- Harding, C. R., Schroeder, G. N., Collins, J. W., Frankel, G. Use of Galleria mellonella as a model organism to study Legionella pneumophila infection. Journal of Visualized Experiments. (81), e50964 (2013).
- Jacobsen, I. D. Galleria mellonella as a model host to study virulence of Candida. Virulence. 5 (2), 237-239 (2014).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
- Hirakawa, M. P., et al. Genetic and phenotypic intra-species variation in Candida albicans. Genome Research. 25 (3), 413-425 (2015).
- Dunn, M. J., Kinney, G. M., Washington, P. M., Berman, J., Anderson, M. Z. Functional diversification accompanies gene family expansion of MED2 homologs in Candida albicans. PLoS Genetics. 14 (4), 1007326 (2018).
- Astvad, K. M. T., Meletiadis, J., Whalley, S., Arendrup, M. C. Fluconazole Pharmacokinetics in Galleria mellonella Larvae and Performance Evaluation of a Bioassay Compared to Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry for Hemolymph Specimens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).
- Mesa-Arango, A. C., et al. The non-mammalian host Galleria mellonella can be used to study the virulence of the fungal pathogen Candida tropicalis and the efficacy of antifungal drugs during infection by this pathogenic yeast. Med Mycol. 51 (5), 461-472 (2013).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Fuchs, B. B., O'Brien, E., Khoury, J. B., Mylonakis, E. Methods for using Galleria mellonella as a model host to study fungal pathogenesis. Virulence. 1 (6), 475-482 (2010).
- Kavanagh, K., Fallon, J. P. Galleria mellonella larvae as models for studying fungal virulence. Fungal Biology Reviews. 24 (1-2), 79-83 (2010).
- Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285 (5431), 1271-1275 (1999).
- Legrand, M., et al. Homozygosity at the MTL locus in clinical strains of Candida albicans: karyotypic rearrangements and tetraploid formation. Molecular Microbiology. 52 (5), 1451-1462 (2004).
- Lockhart, S. R., et al. In Candida albicans, white-opaque switchers are homozygous for mating type. Genetics. 162 (2), 737-745 (2002).
- Miller, M. G., Johnson, A. D. White-opaque switching in Candida albicans is controlled by mating-type locus homeodomain proteins and allows efficient mating. Cell. 110 (3), 293-302 (2002).
- Wu, W., Lockhart, S. R., Pujol, C., Srikantha, T., Soll, D. R. Heterozygosity of genes on the sex chromosome regulates Candida albicans virulence. Molecular Microbiology. 64 (6), 1587-1604 (2007).
- Herrero, A. B., et al. KRE5 gene null mutant strains of Candida albicans are avirulent and have altered cell wall composition and hypha formation properties. Eukaryotic Cell. 3 (6), 1423-1432 (2004).
- Hall, R. A., et al. The Mnn2 mannosyltransferase family modulates mannoprotein fibril length, immune recognition and virulence of Candida albicans. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003276 (2013).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Journal of Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
- Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infection and Immunity. 73 (7), 4161-4170 (2005).
- Lange, A., et al. Genome Sequence of Galleria mellonella (Greater Wax Moth). Genome Announcements. 6 (2), (2018).
- Krappmann, S. Lightning up the worm: How to probe fungal virulence in an alternative mini-host by bioluminescence. Virulence. 6 (8), 727-729 (2015).
- Chowdhary, A., Voss, A., Meis, J. F. Multidrug-resistant Candida auris: 'new kid on the block' in hospital-associated infections. Journal of Hospital Infection. 94 (3), 209-212 (2016).
- Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. Adaptation of a Gaussia princeps Luciferase reporter system in Candida albicans for in vivo detection in the Galleria mellonella infection model. Virulence. 6 (7), 684-693 (2015).
