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Immunology and Infection

प्रसार कैंडिडिआसिस के लिए गैलेरिया mellonella Waxworm संक्रमण मॉडल

Published: November 17, 2018 doi: 10.3791/58914
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Microbiology, The Ohio State University, 2Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University

Summary

गैलेरिया mellonella का प्रसार कैंडिडिआसिस के लिए एक invertebrate मॉडल के रूप में कार्य करता है । यहां, हम विस्तार संक्रमण प्रोटोकॉल और मॉडल के प्रभाव के लिए डेटा का समर्थन प्रदान करते हैं ।

Abstract

Candida प्रजातियों आम कवक commensals है मनुष्यों की त्वचा बस्तियां, श्लैष्मिक सतहों, और जठरांत्र संबंधी मार्ग । कुछ शर्तों के तहत, Candida उनके प्राकृतिक श्लैष्मिक संक्रमण दुर्बल में जिसके परिणामस्वरूप niches विकसित कर सकते है और साथ ही जीवन की धमकी प्रणालीगत संक्रमण है, जो उनके संबद्ध उच्च मृत्यु दर के कारण जांच का एक प्रमुख ध्यान केंद्रित कर रहे हैं । प्रसार संक्रमण के पशु मॉडल रोग प्रगति का अध्ययन और Candida pathogenicity की विशेषताओं विदारक के लिए मौजूद हैं । इनमें से, गैलेरिया mellonella waxworm संक्रमण मॉडल प्रणालीगत डाह के उच्च प्रवाह की जांच के लिए एक लागत प्रभावी प्रयोगात्मक उपकरण प्रदान करता है । pathogenicity को समझने के लिए जी mellonella में कई अन्य बैक्टीरियल और eukaryotic संक्रामक एजेंटों का प्रभावी अध्ययन किया गया है, जिससे यह एक व्यापक रूप से स्वीकृत मॉडल प्रणाली है । फिर भी, जी mellonella संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया विधि में भिंनता phenotypic परिणामों को बदल सकते है और परिणामों की व्याख्या पेचीदा । यहां, हम waxworm मॉडल के लाभों और कमियों रूपरेखा के लिए प्रणालीगत Candida रोगजनन और विस्तार के लिए एक दृष्टिकोण reproducibility में सुधार का अध्ययन । हमारे परिणाम जी mellonella में मृत्यु दर कैनेटीक्स की सीमा पर प्रकाश डाला और चर जो इन कैनेटीक्स मिलाना कर सकते है वर्णन । अंततः, इस विधि एक नैतिक, तेजी से, और लागत प्रभावी दृष्टिकोण के रूप में खड़ा है कैंडिडिआसिस का एक मॉडल में डाह अध्ययन ।

Introduction

Candida प्रजातियों आम मानव commensals है कि गंभीर रूप से प्रतिरक्षा और dysbiotic रोगियों में अवसरवादी रोगजनकों के रूप में उभर करने में सक्षम हैं । हालांकि कई Candida प्रजातियों के रोग का कारण बन सकता है, सी albicans का सबसे प्रचलित कारण है कैंडिडिआसिस1,2। सी albicans से प्रणालीगत रोग परिणाम पहले प्रतिबंधात्मक मेजबान बाधाओं या शल्य साइटों और शरीर के अंय उल्लंघनों पर परिचय के प्रत्यक्ष प्रवेश के माध्यम से खून तक पहुंचने3। Candida प्रजातियों रोगजनक प्रक्रियाओं की एक सीमा का उपयोग करने के लिए रेशा सहित मेजबान के भीतर प्रणालीगत रोग कारण, फिल्म निर्माण, प्रतिरक्षा सेल चोरी और बच, और4सफाई लोहा । में इन विट्रो दृष्टिकोण के लिए व्यक्तिगत रोगजनक तंत्र की जांच मौजूद हैं, लेकिन पशु मॉडल के लिए सबसे अच्छा रोग के परिणाम की संपूर्णता5,6जांच विकल्प प्रदान जारी है । पिछले अनुसंधान डाह के इन विट्रो जांच में होनहार के कई उदाहरण विस्तृत है vivo7,8में पुन: पेश करने में विफल । इस प्रकार, पशु मॉडल अभी भी vivo में डाह का आकलन करने के लिए आवश्यक हैं । अधिकांश रोग मॉडल चूहों पर निर्भर के रूप में एक खाना खानेवाला9के रूप में स्वाभाविक रूप से उपनिवेश murine प्रणालियों के लिए सी albicans अक्षमता के बावजूद मानव संक्रमण के लिए एक किराए के रूप में सेवा । प्रसार कैंडिडिआसिस के Invertebrate मॉडल निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस, फल मक्खी Drosophila melanogaster, और waxworm गैलेरिया mellonella, हालांकि बुनियादी मतभेदों के बारे में चिंताओं में शामिल बुनियादी शरीर क्रिया विज्ञान में, मेजबान शरीर के तापमान, और जोखिम के मार्गों उनके व्यापक स्वीकृति10,11बाधा उत्पंन की है।

हाल ही में, जी mellonella waxworm संक्रमण मॉडल बैक्टीरियल और कवक रोगजनकों की एक विस्तृत श्रृंखला के मॉडल pathogenicity को अपनाया गया है12,13,14। इस मॉडल के लाभ में शामिल है अपनी अपेक्षाकृत कम लागत, वृद्धि का प्रवाह, उपयोग में आसानी, और कम नैतिक murine मॉडल की तुलना में पशु beneficence के बारे में चिंताओं । शोधकर्ताओं के लिए, यह कई चर, मजबूत विश्वास अंतराल, और अधिक तेजी से प्रयोग, और पशु प्रोटोकॉल का बाईपास परीक्षण करने के लिए वृद्धि की क्षमता में तब्दील हो । जी mellonella तेजी से आकलन करने के लिए एक मंच के रूप में कार्य किया है ग. albicans डाह के लिए आवश्यक जीन के निंनलिखित गड़बड़ी का गठन, रेशा, और नैदानिक भर में जीन विनियमन के अलग से11,15 ,16. हाल के अध्ययनों की जांच में शामिल किया है रोधी प्रभावकारिता का उपयोग कर mellonella दवा गतिविधि और प्रतिरोध के फार्माकोकाइनेटिक्स में vivo सेटिंग्स, जो अन्यथा चुनौतीपूर्ण और समय लेने के तहत का आकलन करने के लिए 17,18. फिर भी, जी mellonella में सी albicans डाह के अध्ययन के प्रयोगों के भीतर भिंनता के कथित रूप से उच्च स्तर और अनुसंधान समूहों है कि अलग डाह phenotypes उत्पादन के बीच असंगत प्रोटोकॉल द्वारा जटिल किया गया है चूहों और waxworms के बीच11,13,19,20,21. यहाँ, हम C. albicans संक्रमणों को मानकीकृत करने के लिए एक जी. mellonella प्रोटोकॉल की रूपरेखा, डाह प्रयोगों में reproducibility वृद्धि, और डाह में पहले से वर्णित अध्ययनों के साथ निरंतरता का प्रदर्शन murine मॉडल.

पिछले अध्ययनों से प्रदर्शित किया कि C. albicans संभोग प्रकार की तरह (MTL) 5 गुणसूत्र पर लोकस सेल पहचान और संभोग क्षमता Saccharomyces cerevisiae और अंय Ascomycete कवक22के समान नियंत्रित करता है । C. albicans के बहुमत MTL लोकस पर heterozygous हैं, MTLएक औरMTL α alleles (MTLए/α), और फलस्वरूप बाँझ15में से प्रत्येक में से एक कूटबंधन, 23 , 24. heterozygosity (LOH) या उत्परिवर्तन के नुकसान के माध्यम से MTL alleles में से एक का नुकसान homozygous MTLएक या MTL α उपभेदों है कि बाँझ ' सफेद राज्य से एक phenotypic स्विच से गुजरना कर सकते हैं करने के लिए सुराग सहवास सक्षम ' अपारदर्शी ' अवस्था२५. पिछले काम उजागर किया है कि MTL heterozygosity की हानि भी अलग तनाव पृष्ठभूमि में प्रणालीगत संक्रमण के murine मॉडल में डाह कम कर देता है26। यहां, हम विस्तार के लिए जी mellonella मॉडल एक आनुवंशिक रूप से समान प्रयोगात्मक सेट का उपयोग करने के लिए जी mellonellaमें डाह को MTL heterozygosity के योगदान को दर्शाती है । हम बताते है कि MTL विंयास प्रभावित सी albicans pathogenicity, जहां MTLα उपभेदों दोनों विषमयएक/MTL और αएक कोशिकाओं, निष्कर्षों के समान के संबंध में कम MTL थे murine संक्रमण मॉडल के भीतर26.

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Protocol

सभी तरीकों invertebrate मेजबान के उपयोग पर भरोसा वर्णित है और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) अनुमोदन की आवश्यकता नहीं है ।

1. गैलेरिया mellonella Waxworm लार्वा

  1. थोक व्यापारी और आपूर्तिकर्ताओं से आदेश लार्वा कि हार्मोन, एंटीबायोटिक दवाओं, या अंय उपचार लार्वा को लागू नहीं है और जो जहाज और जीने के नमूने देने में सक्षम हैं ।
    1. प्रयोग के दौरान एक ही सप्लायर से सभी लार्वा खरीद लें । तापमान 30 डिग्री सेल्सियस कमी लार्वा व्यवहार्यता के रूप में गर्मी के महीनों के दौरान लार्वा आदेश देते समय सावधान रहें ।
    2. उंमीद शिपिंग मार्ग और योजना शिपिंग और वितरण तदनुसार भर में तापमान की निगरानी या पर्यावरण की स्थिति के लिए अपने जोखिम को कम करने के लिए शीघ्र शिपिंग का चयन करें ।
  2. जब लार्वा पहुंचें, तो प्रत्येक कंटेनर की जांच करके व्यवहार्य सुनिश्चित करें, स्वस्थ लार्वा मौजूद हैं । स्वस्थ लार्वा पूरी तरह से बिस्तर के नीचे जलमग्न हो जाएगा, चलती है, और शरीर के साथ काले निशान या disease युक्त कुछ लार्वा के साथ एक हल्के पीले/
  3. अपने कंटेनर में लार्वा को परिवेशी तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर हवादार स्थान पर संग्रहीत करते हैं । लार्वा की आरंभिक शर्त के आधार पर इनका उपयोग दो सप्ताह तक किया जा सकता है ।

2. गैलेरिया mellonella संक्रमण के लिए कल्चरल तैयारी

नोट: उचित प्रयोगशाला पोशाक दस्ताने, लैब कोट, और सुरक्षा चश्मे सहित प्रोटोकॉल के इस हिस्से में पहना जाना चाहिए ।

  1. यीस्ट peptone डेक्सट्रोज (YPD) लिक्विड और आगर प्लेट्स बना लें. 1x फास्फेट तैयार खारा (पंजाब) और ७०% इथेनॉल समाधान ।
  2. बढ़ती सी. albicans उपभेदों मध्यम गति और 30 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन ड्रम पर मानक संस्कृति ट्यूबों में ताजा YPD के 3 मिलीलीटर में रात भर इंजेक्ट किया जा करने के लिए ।
  3. स्पिन कोशिकाओं को २,५०० x g में 5 मिनट के लिए एक तालिका के ऊपर के केंद्रापसारक में । supernatant बंद डालो, सेल गोली परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है ।
    1. दोहराया pipetting या भंवर द्वारा 1x पंजाबियों के 5 मिलीलीटर में पूरी तरह से कोशिकाओं को पुनः निलंबित । एक बार फिर से सभी संस्कृति मीडिया को हटाने सुनिश्चित करने के लिए पंजाब में और अधिक से अधिक कोशिकाओं के केंद्रापसारक और resuspension दोहराएँ ।
  4. एक अंतिम धोने के बाद, पंजाब के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित और एक microcentrifuge ट्यूब के लिए उन्हें हस्तांतरण ।
  5. एक 1:100, 1:1000, और 1:100000 कमजोर पड़ने श्रृंखला उत्पंन करने के लिए पंजाब में धारावाहिक कमजोर पड़ने का एक सेट आचरण ।
    नोट: वैकल्पिक कमजोर पड़ने के लिए वांछित सेल गिनती तक पहुंचने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
    1. एक hemocytometer का प्रयोग, या तो 1:100 या 1:1000 कमजोर पड़ने से कोशिकाओं की गणना । सबसे अधिक बार, 1:1000 कमजोर पड़ने सी albicans संस्कृतियों के लिए उपयुक्त कोशिका गिनती प्रदान करता है ।
    2. hemocytometer के ग्रिड गणित का उपयोग कर प्रारंभिक संस्कृति के भीतर कोशिकाओं की कुल एकाग्रता की गणना, केंद्रीय 5x5 ग्रिड में गिना जा करने के लिए 30-300 कोशिकाओं के बीच के लिए लक्ष्य. एक स्वचालित सेल काउंटर एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, सेल गिनती निर्धारित करने के लिए ऑप्टिकल घनत्व का उपयोग सेल आकृति विज्ञान (आकार, आकार, आदि) के रूप में हतोत्साहित काफी इसकी सटीकता को प्रभावित कर सकता है ।
  6. मापा कोशिका गिनती का उपयोग करना, एक microcentrifuge ट्यूब में 2.5 x107 कोशिकाओं की एक नई कमजोर पड़ने/ इस कमजोर पड़ने से सी. albicansके साथ जी mellonella के प्रत्येक टीका के लिए आधार के रूप में कार्य करेंगे. प्रत्येक इंजेक्शन २५०,००० सी. albicans कोशिकाओं की एक संक्रामक खुराक के लिए इस इनोक्युलम के 10 µ एल की आवश्यकता होगी ।
  7. प्रत्येक संस्कृति संक्रमण में इस्तेमाल किया जा करने के लिए YPD आगर पर १०० कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFUs) के लिए 1:100000 कमजोर पड़ने की सही मात्रा चढ़ाना द्वारा संक्रामक खुराक की सटीकता की पुष्टि करें ।
  8. मशीन 30 डिग्री सेल्सियस पर ४८ घंटे (एच) के लिए कदम २.७ से प्लेट गणना और प्लेट प्रति कालोनियों की संख्या गिनती । ८० और १२० कालोनियों के बीच इनोक्युलम में सटीकता के लिए एक स्वीकार्य सीमा का गठन किया ।

3. Candida संस्कृतियों के साथ गैलेरिया mellonella लार्वा का संक्रमण

नोट: उचित प्रयोगशाला पोशाक दस्ताने, लैब कोट, और सुरक्षा चश्मे सहित प्रोटोकॉल के इस हिस्से में पहना जाना चाहिए ।

  1. दो अलग microcentrifuge ट्यूबों के लिए १००% इथेनॉल और 1x पंजाब के 1 मिलीलीटर की 1 मिलीलीटर जोड़ें । इथेनॉल और पंजाबियों को संक्रमण के बीच इंजेक्शन सुई धोने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
  2. एक खाली, १०० x 15 मिमी बाँझ पेट्री पकवान, जो प्रत्येक स्वतंत्र तनाव के लिए टीका निम्नलिखित लार्वा घर में waxworm बिस्तर की एक छोटी राशि फैल गया । बिस्तर पेट्री डिश सतह के लिए मृत जी mellonella लार्वा का पालन सीमा के अलावा ।
  3. एक 26 जी, 10 µ l सिरिंज को लेने और ७०% इथेनॉल तीन बार के 10 µ एल के साथ तीन बहाकर द्वारा पीछा किया expunging के १० µ एल एक साथ निष्फल पंजाबियों । भंवर सी albicans के टीका कमजोर पड़ने और संस्कृति के 10 µ एल ले लो । सुनिश्चित करें कि हवा के इंजेक्शन के रूप में सिरिंज के भीतर कोई हवा बुलबुले मौत को बढ़ावा देता है और बहाव विश्लेषण जटिल होगा ।
  4. एक कंटेनर जी mellonella लार्वा पकड़े और ध्यान से एक उंगली के साथ पर बिस्तर बंद करने के लिए लार्वा को उजागर । लार्वा का चयन करें जो अच्छे स्वास्थ्य के रूप में सक्रिय आंदोलन, एक हल्के पीले रंग/, और लार्वा शरीर पर काले रंजकता की कमी की पहचान की है । ये लार्वा पूर्ण प्रायोगिक सेट के पार समान आकार के होने चाहिए ।
  5. एक ही लार्वा उठाओ और एक पेंसिल पकड़ के समान सूचकांक/मध्यम उंगली और अंगूठे के बीच धीरे से पकड़ । लार्वा को अपनी पीठ पर रोल कर लें जिससे पैर ऊपर की दिशा में हों । उंगलियों और अंगूठे के बीच शरीर की पूरी लंबाई को दबाए रखें ताकि लार्वा कर्ल करने या इंजेक्शन से दूर खींचने में असमर्थ हो ।
    नोट: यदि वांछित, एक कपास १००% इथेनॉल में भिगो झाड़ू का उपयोग इंजेक्शन की साइट निष्फल ।
  6. सुई के बेवल चेहरे ऊपर और धीरे rearmost बाएँ पैर के साथ जंक्शन पर शरीर में बेवल की लंबाई सहित सुई टिप डालने के लिए तो सिरिंज घुमाएँ. सुनिश्चित करें कि सुई शरीर में प्रवेश करती है और बस लार्वा की आवक शरीर को नहीं धकेलती है । शरीर घुसना में बल प्रयोग नहीं के रूप में सुई पूरी तरह से लार्वा के माध्यम से जल्दी से पियर्स हो सकता है । धीरे सुई उचित प्रवेश की पुष्टि करेगा के साथ उठाने । पूर्ण 10 µ एल Candida इनोक्युलम इंजेक्षन और सुई निकालने ।
  7. प्रत्येक लार्वा के लिए चरण 3.3-3.5 दोहराएं । को रोकने के सेल बसने, भंवर टीका के लिए Candida संस्कृतियों हर तीसरे इंजेक्शन के बाद । एक नियंत्रण के रूप में, 1x पंजाब के 10 µ एल के साथ जी mellonella का एक सेट इंजेक्षन ।
  8. सह घर 10 लार्वा प्रत्येक १०० x 15 मिमी पेट्री डिश में एक ही Candida संस्कृति से टीका निंनलिखित इंजेक्शन । आठ दिनों के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर लार्वा की जांच, मौत पर नजर रखने के लिए हर 24 ज लार्वा की जाँच ।
    1. अंधेरे रंजकता, काले धब्बे या निकायों के गठन, और आंदोलन की कमी से शुरू में मृत्यु दर का आकलन करें । मृत्यु की पुष्टि करने के लिए, धीरे से अपनी पीठ पर मरणासन्न लार्वा रोल करने के लिए चिमटी का उपयोग करें और प्रकाश चिमटी के साथ लार्वा के नीचे प्रहार । प्रकट शरीर या पैर आंदोलन की कमी से मनाया के रूप में गैर जवाबदेही मौत के रूप में बनाए रखा है और लार्वा पेट्री डिश से हटा दिया जाता है ।
  9. रिकॉर्ड लार्वा मृत्युदर समय पाठ्यक्रम पर । पतंगों में pupate शुरू होने वाले लार्वा को विश्लेषण में शामिल किया जा सकता है, लेकिन अगर वे गलते शुरू कर दें तो उन्हें हटा दिया जाना चाहिए । Pupating लार्वा अंत बिंदु विश्लेषण से सेंसर किया जा सकता है क्योंकि लार्वा और pupa के बीच डाह अंतर अस्पष्ट है ।
  10. सांख्यिकीय Mantel-कॉक्स सांख्यिकीय परीक्षण का उपयोग कर महत्व का आकलन करें ।

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Representative Results

यहां, हम जी mellonella waxworms के उपयोग के लिए एक reproducible विधि प्रदर्शन C. albicansका उपयोग कर संक्रमण के एक प्रसार किया कैंडिडिआसिस मॉडल की जांच । संक्रमण के लिए लार्वा का उपयुक्त भंडारण, रखरखाव और चयन, जी mellonella मृत्यु दर (चित्रा 1ए) में reproducibility बीमा करने का महत्वपूर्ण घटक है । स्वस्थ लार्वा कि सक्रिय हैं, एक हल्के पीले रंग की है और शरीर पर काले धब्बे की कमी इस प्रणाली के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए और आम तौर पर संक्रमण के लिए दो सप्ताह के बाद आने के लिए व्यवहार्य हैं । जी mellonella फिजियोलॉजी के किसी भी संभावित पाया प्रभाव को कम करने के लिए, लार्वा समान आकार और वजन का चयन किया गया । लार्वा शरीर की एक ही संरचनात्मक स्थल पर एक अच्छी तरह से मिश्रित इनोक्युलम और सुसंगत इंजेक्शन भी प्रयोगों के बीच reproducibility को बढ़ावा देने में महत्वपूर्ण चर के रूप में खड़े हो जाओ । छवियां प्रयोग की अवधि के माध्यम से संक्रमित लार्वा के रखरखाव का प्रदर्शन (चित्रा 1बी) ।

डाह पर लार्वा उंर के प्रभाव का आकलन करने के लिए, अलग पंजाब नियंत्रण संक्रमण या तो शूंय या दस दिनों के बाद पहुंचने के बाद लार्वा के साथ प्रदर्शन किया गया । जी mellonella ृ के कैनेटीक्स में कोई महत्वपूर्ण अंतर इन समूहों (चित्रा २ए) के बीच मौजूद था. बीमारी की विशेषता लक्षण दोनों समूहों है कि संक्रमण के शिकार से लार्वा में उठी; मूल रूप से पीले/लार्वा का रंग फीका पड़ गया और गतिशीलता के कुल नुकसान से पहले काले धब्बे के लिए रास्ता दे दिया और, अंततः, मौत (चित्रा 2बी) । albicans के साथ संक्रमण disease और रुग्णता की इस प्रक्रिया को गति लेकिन काफी मौत के लिए अग्रणी phenotypic मार्करों के झरना को बदल नहीं है संक्रमित लार्वा या पंजाब इंजेक्शन लार्वा (चित्रा 2सी) की तुलना में ।

संक्रामक खुराक भी जी mellonella संक्रमण की मृत्यु दर कैनेटीक्स काफी प्रभाव डालता है । C. albicans इनोक्युलम आकार के प्रभावों का आकलन करने के लिए, हम संक्रमित G. mellonella के साथ चार विभिन्न नैदानिक अलग-अलग (12C, P60002, P75010, और SC5314: तालिका 1) तीन अलग खुराकों पर. लार्वा SC5314 से संक्रमित सभी खुराकों में मृत्यु दर, इस प्रयोग के भीतर इस्तेमाल किया दूसरों को अलग करने की वृद्धि हुई pathogenicity के साथ संगत (चित्रा 2डी) । अधिक लार्वा १.० x 104 कोशिकाओं की तुलना में १.० x 105 SC5314 या 12C कोशिकाओं के साथ संक्रमण के शिकार हुए । १.० x 106 कोशिकाओं की सबसे अधिक खुराक कम विषमय अलग, P60002 और 12C सहित सभी उपभेदों के संक्रमण के बाद मरने वाले लार्वा के साथ जरूरत से ज्यादा घातक साबित हुआ । लार्वा P75010 और SC5314 के साथ इंजेक्शन 24 घंटे के भीतर संक्रमण का शिकार, एक और अधिक उदारवादी संक्रामक खुराक का सुझाव डाह में मतभेद निर्धारित करने के लिए उपयुक्त है । नतीजतन, 2.5 x105 की एक संक्रामक खुराक के बाद सभी प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

प्रणालीगत रोग के murine और जी mellonella मॉडल के बीच डाह में समानता प्रदर्शित करने के लिए, हम SC5314 के डाह परख-व्युत्पंन सी. albicans उपभेदों या तो heterozygous (ए/α या homozygous (एक/ α/-) MTL loci. या तो SC5314 या उसके prototrophic व्युत्पंन BWP17 आनुवंशिक पृष्ठभूमि से MTL heterozygotes के साथ जी mellonella के संक्रमण पंजाब के इंजेक्शन पशुओं की तुलना में मृत्यु दर की उच्च दरों का उत्पादन किया । तीन दिन के लिए नियंत्रण लार्वा के सभी सी के आधे से अधिक के नुकसान की तुलना में बच albicans इंजेक्शन 3 दिनों के बाद संक्रमण (डीपीआई) है कि आगे 8 डीपीआई (चित्रा 3ए, 4 बी) में वृद्धि हुई । BWP17 के साथ संक्रमण इस मॉडल में भीगा ग. albicans घातकता (27% जीवित रहने की तुलना में 4% अस्तित्व SC5314 MTL heterozygotes में 8 डीपीआई पर; चित्रा 3 सी, 3 डी) । G. mellonella लार्वा संक्रमित MTLα/-उपभेदों MTL heterozygous माता पिता के उपभेदों की तुलना में काफी अब बच (प्रवेश रैंक टेस्ट, SC5314; पी = 0.0006, BWP17; पी = 0.0002) । मजे की बात है, डाह के MTLए/-सी. albicans कोशिकाओं ने heterozygous और SC5314 दोनों पृष्ठभूमियों में अपनी MTL BWP17 समकक्षी का मिलान किया. इस प्रकार, MTL विंयास MTLα के साथ C. albicans डाह पर एक प्रभाव है/-या तो MTLए/α या MTL/-कोशिकाओं की तुलना में कमी की हत्या प्रदर्शित उपभेदों ।

Figure 1
चित्रा 1 . संक्रमण प्रक्रिया का अवलोकन. (क) एक फ़्लोचार्ट संक्रमण प्रक्रिया के प्रमुख तत्वों पर प्रकाश डाला गया आदेश और लार्वा के भंडारण, संक्रमण संस्कृति की तैयारी, और इंजेक्शन सहित । (ख) प्रतिनिधि छवियां स्वस्थ भंडारण की स्थिति, संक्रमण अंतरिक्ष, इंजेक्शन की तैयारी, और लार्वा रखरखाव निंनलिखित संक्रमण दिखा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . जी mellonella संक्रमण प्रक्रियाओं के प्रभाव । (एक) पंजाबियों नियंत्रण आगमन पर तुरंत या तो संक्रमित थे (पंजाबियों-D0, नीला) या 10 दिनों के बाद (पंजाबियों-D10, लाल) । (ख) प्रतिनिधि छवियां लार्वा disease और मृत्यु पर प्रकाश डालती हैं । (ग) संक्रमण प्लेटों की एक छवि श्रृंखला में पंजाब के साथ इंजेक्शन के प्रभाव (मध्य) या SC5314 (लोअर) के साथ संक्रमित लार्वा (ऊपर) के दिनों में 1, 3, 5, और 7 निम्नलिखित इंजेक्शन की तुलना में । (घ) खुराक प्रभाव नैदानिक अलग से एक संग्रह में दिखाया गया है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . MTLएक एलील को बढावा देता ग. albicans की हत् जी mellonella। MTL लोकस heterozygous (a/α) और homozygous (a/और α/-) SC5314 (क) और BWP17 (ग) डेरिवेटिव आठ दिन से अधिक के लार्वा मृत्युदर के लिए साजिश रची जाती है । विश्वास अंतराल प्रत्येक SC5314 (ख) और BWP17 (घ) के लिए व्युत्पंन तनाव के प्रयोगों के पार लार्वा मृत्यु दर के कैनेटीक्स में निरंतरता को उजागर करने के लिए साजिश रची है । औसत (ठोस लाइन) मानक विचलन के साथ प्लॉट किया गया है (अंतरिक्ष में भरा) के लिए तीन जैविक प्रतिकृति 10 लार्वा प्रत्येक के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Candida तनाव माता पिता का तनाव जीनोटाइप Mtl संदर्भ
MAY1 SC5314 Candida albicans नैदानिक अलग अ α/ वू एट अल. २००७
MAY6 P60002 Candida albicans नैदानिक अलग क/ वू एट अल. २००७
MAY11 P75010 Candida albicans नैदानिक अलग अ α/ वू एट अल. २००७
MAY15 12C Candida albicans नैदानिक अलग क/ वू एट अल. २००७
MAY61 SC5314 MTLa:: SAT1 α/ इस अध्ययन
MAY71 SC5314 MTLα:: SAT1S tac1:: tac1-GFP-HYGR क/ इस अध्ययन
MAY313 BWP17 ura3Δ:: λimm434/ura3Δ:: λimm434 his1:: hisG/his1:: hisG arg4:: hisG/arg4:: रु-arg4-ura3-बीएन sir2:: his1/sir2::d pl200 अ α/ इस अध्ययन
MAY314 BWP17 ura3Δ:: λimm434/ura3Δ:: λimm434 his1:: hisG/his1:: hisG arg4:: hisG/arg4:: रु-arg4-URA3-बीएन sir2:: his1/sir2::d pl200 α/ इस अध्ययन
MAY315 BWP17 ura3Δ:: λimm434/ura3Δ:: λimm434 his1:: hisG/his1:: hisG arg4:: hisG/arg4:: रु-arg4-URA3-बीएन sir2:: his1/sir2::d pl200 क/ इस अध्ययन

तालिका 1. इस अध्ययन में प्रयुक्त होने वाली albicans एसट्रेनें ।

चर घटक सुझाए गए नियंत्रण संदर्भ
लार्वा इंजेक्शन के समय आयु वर्म आगमन और टीका के बीच समय को छोटा करें इस अध्ययन
इंजेक्शन के समय लार्वा आकार कीड़े का चयन करते समय निरंतरता सुनिश्चित Fuchs एट अल. २०१०
इंजेक्शन के समय लार्वा स्वास्थ्य आदेश कीड़े मध्यम तापमान के दौरान, आगमन पर तुरंत उपयोग इस अध्ययन
सी. albicans के साथ संक्रामक खुराक एक संक्रामक एकाग्रता है जो परिणामों की व्यापक रेंज प्रस्तुत का चयन करें इस अध्ययन
लार्वा इंजेक्शन का जवाब कोई इंजेक्शन के साथ कीड़े के साथ पंजाब के इंजेक्शन नियंत्रण आचरण Hirakawa एट अल. २०१५

तालिका 2. जी mellonella संक्रमण के संबंध में विचार ।

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Discussion

जी. के. mellonella waxworm मॉडल सी. albicans डाह के द्रुत और reproducible विश्लेषण के लिए एक प्रभावी औजार के रूप में खड़ा है. इस विस्तृत प्रोटोकॉल लार्वा के एक बैच भर में एक ही साइट के लिए एक परिभाषित संक्रामक खुराक के अनुरूप वितरण पर निर्भर करता है । संक्रामक खुराक जी mellonella मृत्यु पर एक गहरा प्रभाव है, जबकि उनके प्रारंभिक आगमन और दस दिनों के बाद रसीद समान परिणाम उत्पादित के बीच लार्वा का उपयोग करें । C. albicansMTLके नुकसान चूहों में पिछले प्रयोगों के साथ संगत कम डाह मेंएक एलील परिणाम हालांकि MTLα एलील के विघटन लार्वा मौत को बदल नहीं किया.

जी mellonella संक्रमण के परिणाम काफी प्रयोगात्मक डिजाइन द्वारा प्रभावित किया जा सकता है । संक्रमण के हड्डीवाला मॉडल के विपरीत, इंजेक्शन साइट में छोटे भिन्नता, इनोक्युलम मात्रा, और इनोक्युलम आकार डेटा की व्याख्याओं प्रभाव हो सकता है. C. albicans कोशिकाओं की बढ़ती संख्या के साथ संक्रमण संक्रमित लार्वा की अधिक से अधिक तेजी से रुग्णता के लिए नेतृत्व किया । एक निश्चित बिंदु पर, बहुत सी albicans इंजेक्शन भारी मेजबान सुरक्षा के लिए मेजबान की तेजी से मौत, संभावित विषाक्त सदमे के माध्यम से अग्रणी में सक्षम प्रतीत होता है । हालांकि, SC5314 लगातार सभी खुराक पर सबसे विषमय तनाव था, 12C द्वारा पीछा किया, और फिर अंय उपभेदों । इस प्रकार, संक्रमण मानकों संक्रमण के निरपेक्ष कैनेटीक्स पर एक गहरा प्रभाव है, लेकिन अभी भी रिश्तेदार डाह का अनुमान प्रदान कर सकते हैं । इन प्रयोगों के भीतर पहले काम और अच्छी तरह से Candida कोशिकाओं को धोने के महत्व का प्रदर्शन किया । अवशिष्ट YPD इंजेक्शन बोल्स में शामिल लार्वा अस्तित्व (डेटा नहीं दिखाया गया है) काफी कम हो जाती है ।

कृमि स्वास्थ्य एक महत्वपूर्ण चर जब जी mellonella प्रयोगों का आयोजन है । गर्मी के बीच में मानक शिपिंग का उपयोग कर परिवहन किया लार्वा अक्सर समय से पहले आयु वर्ग या बल दिया, काले धब्बे के साथ कवर, कमी व्यवहार्यता के साथ । रुग्णता पर लार्वा आकार के लिए कोई महत्वपूर्ण भूमिका पहले ही नहीं देखी गई है यद्यपि यहाँ वर्णित प्रयोगों को मोटे तौर पर समतुल्य द्रव्यमान के लार्वा की परख पर केंद्रित किया गया है । स्वस्थ लार्वा और पंजाबियों नियंत्रण लार्वा हमेशा संक्रमण समूहों के साथ चलाया जाना चाहिए जैविक प्रतिकृति अलग दिनों पर प्रदर्शन के बीच लार्वा व्यवहार्यता में किसी भी परिवर्तन के लिए खाते । छ. mellonella संक्रमित दस दिनों के पहुंचने के बाद तुरंत प्राप्त होने पर संक्रमित लार्वा के कैनेटीक्स से मिलान किया जाता है । इस प्रकार, लार्वा का एक शिपमेंट पर्याप्त सामग्री और पूर्ण प्रयोगों को करने के लिए समय प्रदान कर सकते हैं । इन प्रयोगों डाह में मतभेद निर्धारित करने के लिए तनाव प्रति 30 पशुओं पर भरोसा है, जो काफी अधिक जानवरों आमतौर पर murine मॉडल में उपयोग की तुलना में, मनाया परिणाम11,27 के मजबूत विश्वास में जिसके परिणामस्वरूप , 28. यह मॉडल भी नैतिक चिंताओं को कम, समय, और लागत संक्रमण के हड्डीवाला मॉडल की तुलना में । इस प्रकार, मोम लार्वा का उपयोग अन्य प्रणालियों में संभव है की तुलना में प्रणालीगत डाह पर छोटे प्रभाव की पहचान की सुविधा हो सकती है ।

जी mellonella प्रणाली के लिए अंतर्निहित निरंतर मौजूद है कि मेजबान के अध्ययन में अपनी उपयोगिता-रोगज़नक़ बातचीत सीमा । सबसे पहले, जी mellonella एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी है और antigenicity या प्रतिरक्षा स्मृति उच्च eukaryotes29में के रूप में जांच करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता । लार्वा का शरीर hemolymph से भरा एक निरंतर गुहा से बना है, जो पोषक तत्वों को प्रसारित करने के लिए कार्य करते हैं, अणु, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स का संकेत करते हैं । इन प्रतिरक्षा कोशिकाओं, hemocytes, न्यूट्रोफिल करने के लिए इसी तरह व्यवहार करते हैं और इसलिए phagocytose कर सकते हैं, ऑक्सीडेटिव फटने उत्पन्न, और lytic रोगजनक मान्यता रिसेप्टर्स30के माध्यम से सक्रियण के बाद extracellular एंजाइमों स्रावित. फिर भी, इस समारोह chordate प्रणालियों है कि पूरी तरह से सभी ल्युकोसैट गतिविधियों को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है भीतर सहज प्रतिरक्षा कोशिका प्रक्रियाओं का एक सबसेट है । एक अंय प्रमुख चेतावनी जी mellonella के लिए एक जीनोम विधानसभा की कमी है, हालांकि जीनोम हाल ही में31अनुक्रम था । नतीजतन, प्रजातियों के भीतर genotypic विविधता की हद तक अज्ञात और सबसे आपूर्तिकर्ताओं की संभावना आनुवंशिक रूप से विषम आबादी जहाज है कि प्रयोगों में मृत्यु दर को प्रभावित कर सकता है । इसके अलावा, आणविक तकनीक जीव के लिए मौजूद नहीं है और किसी भी रोगजनन के लिए मेजबान योगदान काटना प्रयास जटिल है । अभी तक, सुसंगत डाह प्रयोगों, विक्रेताओं, समय भर में सी albicans के साथ संक्रमण के बाद परिणाम, और प्रयोगशालाओं pathogenicity के मौलिक सवालों में उनकी उपयोगिता का समर्थन करता है ।

MTL heterozygotes और MTLα homozygote पृष्ठभूमियों के सापेक्ष सी. albicans के MTLएक घटे डाह का नुकसान. यह प्रवृत्ति पहले काम के साथ संगत है प्रणालीगत डाह26के माउस मॉडल का उपयोग कर प्रदर्शन किया । murine मॉडल के विपरीत, MTLα के नुकसान MTLएक/α माता पिता के लिए रिश्तेदार डाह बदल नहीं किया । इन परिणामों के बीच विसंगति स्पष्ट नहीं है लेकिन अनुकूली उन्मुक्ति के घटक है कि invertebrate जीवों में याद कर रहे है शामिल हो सकते हैं । वैकल्पिक रूप से, MTL heterozygosity के साथ जुड़े बढ़ी हुई डाह केवल α में MTLएलील SC5314 के लिए कारण हो सकता है, potentiating कई तनाव पृष्ठभूमि में मूल्यांकन के लिए की जरूरत है । इसलिए, हम दो MTL alleles के बीच डाह के लिए एक अंतर भूमिका का सुझाव देते हैं ।

कुल मिलाकर, जी mellonella मॉडल प्रणालीगत कैंडिडिआसिस का आकलन करने के लिए एक तेजी से और reproducible मॉडल के रूप में कार्य करता है । डाह के अंय readouts के लिए लार्वा homogenate चढ़ाना द्वारा कवक व्यापकता सहित इस मॉडल के साथ परख की जा सकती है कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFUs)11 या bioluminescence, जो भी कवक स्थानीयकरण३२प्रदान करता है । भविष्य में, इस मॉडल को इस तरह के नए आपात Candida auris प्रजातियों३३में ऊंचा दवा प्रतिरोध के रूप में अंय Candida प्रजातियों के डाह विशेषताओं का आकलन विस्तार किया जा सकता है । जी mellonella के भीतर लिम्फोसाइट कल्पना करने के लिए उपकरणों के निरंतर विकास Candidaसंक्रमित के साथ बातचीत, waxworm वंश संक्रमण परिणामों में परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, और के माध्यम से संक्रामक प्रक्रिया के दृश्य रिपोर्टर Candida३४ लाइंस और रोग के इस मॉडल को परिष्कृत और vivo मेजबान में की गहरी जांच-रोगज़नक़ बातचीत की अनुमति होगी ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक इस अध्ययन में उपयोग के लिए गैलेरिया mellonella प्राप्त करने में पामेला वाशिंगटन और लिआ एंडरसन की सहायता स्वीकार करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Galleria mellonella Snackworms.com Buy twice as many worms as expected to use
10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe Hamilton 80000
Petri dish, 100X15 mm, 500 pack Fisher FB0875712
Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack VWR 87003-294
Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL VWR 97062-818
Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL Millipore Sigma EM-EX0276-1S
autoclaved ddH2O

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References

  1. Kauffman, C. A., et al. Prospective multicenter surveillance study of funguria in hospitalized patients. The National Institute for Allergy and Infectious Diseases (NIAID) Mycoses Study Group. Clinical Infectious Diseases. 30 (1), 14-18 (2000).
  2. Horn, D. L., et al. Epidemiology and outcomes of candidemia in 2019 patients: data from the prospective antifungal therapy alliance registry. Clinical Infectious Diseases. 48 (12), 1695-1703 (2009).
  3. Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clinical Microbiology Reviews. 20 (1), 133-163 (2007).
  4. Sardi, J. C., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 1 10-24 (2013).
  5. Segal, E., Frenkel, M. Experimental in Vivo Models of Candidiasis. J Fungi (Basel). 4 (1), (2018).
  6. Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L. Animal models for candidiasis. Current Protocols in Immunology. 105, 11-17 (2014).
  7. Heymann, P., et al. The siderophore iron transporter of Candida albicans (Sit1p/Arn1p) mediates uptake of ferrichrome-type siderophores and is required for epithelial invasion. Infection and Immunity. 70 (9), 5246-5255 (2002).
  8. Priest, S. J., Lorenz, M. C. Characterization of Virulence-Related Phenotypes in Candida Species of the CUG Clade. Eukaryotic Cell. 14 (9), 931-940 (2015).
  9. Savage, D. C., Dubos, R. J. Localization of indigenous yeast in the murine stomach. J Bacteriol. 94 (6), 1811-1816 (1967).
  10. Ewbank, J. J., Zugasti, O. C. elegans: model host and tool for antimicrobial drug discovery. Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 300-304 (2011).
  11. Amorim-Vaz, S., Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. Examining the virulence of Candida albicans transcription factor mutants using Galleria mellonella and mouse infection models. Frontiers in Microbiology. 6, 367 (2015).
  12. Harding, C. R., Schroeder, G. N., Collins, J. W., Frankel, G. Use of Galleria mellonella as a model organism to study Legionella pneumophila infection. Journal of Visualized Experiments. (81), e50964 (2013).
  13. Jacobsen, I. D. Galleria mellonella as a model host to study virulence of Candida. Virulence. 5 (2), 237-239 (2014).
  14. Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
  15. Hirakawa, M. P., et al. Genetic and phenotypic intra-species variation in Candida albicans. Genome Research. 25 (3), 413-425 (2015).
  16. Dunn, M. J., Kinney, G. M., Washington, P. M., Berman, J., Anderson, M. Z. Functional diversification accompanies gene family expansion of MED2 homologs in Candida albicans. PLoS Genetics. 14 (4), 1007326 (2018).
  17. Astvad, K. M. T., Meletiadis, J., Whalley, S., Arendrup, M. C. Fluconazole Pharmacokinetics in Galleria mellonella Larvae and Performance Evaluation of a Bioassay Compared to Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry for Hemolymph Specimens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).
  18. Mesa-Arango, A. C., et al. The non-mammalian host Galleria mellonella can be used to study the virulence of the fungal pathogen Candida tropicalis and the efficacy of antifungal drugs during infection by this pathogenic yeast. Med Mycol. 51 (5), 461-472 (2013).
  19. Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
  20. Fuchs, B. B., O'Brien, E., Khoury, J. B., Mylonakis, E. Methods for using Galleria mellonella as a model host to study fungal pathogenesis. Virulence. 1 (6), 475-482 (2010).
  21. Kavanagh, K., Fallon, J. P. Galleria mellonella larvae as models for studying fungal virulence. Fungal Biology Reviews. 24 (1-2), 79-83 (2010).
  22. Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285 (5431), 1271-1275 (1999).
  23. Legrand, M., et al. Homozygosity at the MTL locus in clinical strains of Candida albicans: karyotypic rearrangements and tetraploid formation. Molecular Microbiology. 52 (5), 1451-1462 (2004).
  24. Lockhart, S. R., et al. In Candida albicans, white-opaque switchers are homozygous for mating type. Genetics. 162 (2), 737-745 (2002).
  25. Miller, M. G., Johnson, A. D. White-opaque switching in Candida albicans is controlled by mating-type locus homeodomain proteins and allows efficient mating. Cell. 110 (3), 293-302 (2002).
  26. Wu, W., Lockhart, S. R., Pujol, C., Srikantha, T., Soll, D. R. Heterozygosity of genes on the sex chromosome regulates Candida albicans virulence. Molecular Microbiology. 64 (6), 1587-1604 (2007).
  27. Herrero, A. B., et al. KRE5 gene null mutant strains of Candida albicans are avirulent and have altered cell wall composition and hypha formation properties. Eukaryotic Cell. 3 (6), 1423-1432 (2004).
  28. Hall, R. A., et al. The Mnn2 mannosyltransferase family modulates mannoprotein fibril length, immune recognition and virulence of Candida albicans. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003276 (2013).
  29. Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Journal of Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
  30. Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infection and Immunity. 73 (7), 4161-4170 (2005).
  31. Lange, A., et al. Genome Sequence of Galleria mellonella (Greater Wax Moth). Genome Announcements. 6 (2), (2018).
  32. Krappmann, S. Lightning up the worm: How to probe fungal virulence in an alternative mini-host by bioluminescence. Virulence. 6 (8), 727-729 (2015).
  33. Chowdhary, A., Voss, A., Meis, J. F. Multidrug-resistant Candida auris: 'new kid on the block' in hospital-associated infections. Journal of Hospital Infection. 94 (3), 209-212 (2016).
  34. Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. Adaptation of a Gaussia princeps Luciferase reporter system in Candida albicans for in vivo detection in the Galleria mellonella infection model. Virulence. 6 (7), 684-693 (2015).

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण १४१ अंक Candida albicans गैलेरिया mellonella waxworm कैंडिडिआसिस डाह रोग मॉडल कीट मॉडल संक्रमण
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Dunn, M. J., Woodruff, A. L., Anderson, M. Z. The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis. J. Vis. Exp. (141), e58914, doi:10.3791/58914 (2018).

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