Summary
Mellonella גלריה (galleria) משמש מודל הגעה עבור המופץ קנדידה. כאן, אנחנו מפרטים את הזיהום פרוטוקול ולספק נתונים התומכים לאפקטיביות של הדגם.
Abstract
המינים קנדידה commensals פטרייתי הנפוץ של בני האדם colonizing את העור משטחים הרירית, מערכת העיכול. בתנאים מסוימים, קנדידה יכולה והדבר נישות הטבעי שלהם וכתוצאה מכך מתישה זיהומים הרירית כמו טוב כמו סכנת חיים זיהומים מערכתית, המהווים מוקד מרכזי של החקירה בשל שיעורי התמותה גבוהים המשויך שלהם. מודלים חייתיים של זיהום המופץ קיימות עבור הלומדים התקדמות המחלה, לנתח את המאפיינים של קנדידה פתוגניות. אלה, המודל זיהום waxworm mellonella גלריה (galleria) מספק כלי ניסיוני חסכונית עבור תפוקה גבוהה חקירות של התקפה אלימה מערכתית. רבים אחרים בקטריאליים ו האיקריוטים מדבקים ביעילות נחקרו ב mellonella ג להבין פתוגניות, שהופך אותו מערכת מודל נפוצה ומקובלת. ובכל זאת, וריאציה של השיטה שבה נעשה שימוש כדי להדביק את mellonella ג יכול לשנות תוצאות פנוטיפי ומסבכים פרשנות של התוצאות. כאן, אנחנו חלוקה לרמות את היתרונות והחסרונות של המודל waxworm ללמוד פתוגנזה קנדידה מערכתית ואף פירוט גישה לשיפור הפארמצבטית. התוצאות שלנו להאיר את הטווח של קינטיקה התמותה ב mellonella ג , לתאר את המשתנים אשר יכול לווסת קינטיקה אלה. בסופו של דבר, שיטה זו ניצבת גישה אתית, מהירה וחסכונית ללמוד התקפה אלימה במודל של קנדידה המופץ.
Introduction
קנדידה המינים נפוצים commensals אדם המסוגלים מתעוררים כמו פתוגנים אופורטוניסטים ב immunocompromised קשות ומטופלים dysbiotic. למרות קנדידה מינים רבים יכולים לגרום למחלות, ג אלביקנס הוא הגורם הנפוץ ביותר של קנדידה המופץ1,2. מחלה מערכתית נובעת אלביקנס ג גישה לזרם הדם דרך גם חדירה ישירה של מחסומי מארח קודם לכן מגבילים או מבוא-אתרי כירורגי ולפרצות אחרות של גוף3. קנדידה מינים לנצל מגוון של תהליכים פתוגניים לגרום למחלה מערכתית בתוך המארח כולל filamentation, ביופילמים, התחמקות תא החיסון ואת הבריחה של ברזל ניקוי4. גישות במבחנה לחקור מנגנונים פתוגניים בודדים, אך מודלים חייתיים לספק את האפשרות הטובה ביותר לחקור את מכלול של המחלה התוצאה5,6. מחקרים קודמים מפורטות מקרים רבים של המבטיח במבחנה חקירות של התקפה אלימה נכשל להתרבות ויוו7,8. לפיכך, מודלים בעלי חיים נדרשים עדיין להעריך התקפה אלימה ויוו. רוב הדגמים המחלה להסתמך על עכברים לשמש פונדקאית עבור זיהומים האדם למרות חוסר אלביקנס ג ליישב באופן טבעי מערכות מאתר כמו commensal9. הגעה מודלים של קנדידה המופץ כוללים את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans, הפרי לטוס דרוזופילה melanogaster, את waxworm mellonella גלריה (galleria), למרות חששות לגבי ההבדלים הבסיסיים ב. אנדרופינים, חום הגוף המארח והנתיבים של חשיפה יש הקשו שלהם הסכמה רחבה10,11.
לאחרונה, המודל זיהום mellonella ג waxworm אומץ כדי דגם פתוגניות של מגוון רחב של חיידקים ופטריות פתוגנים12,13,14. היתרונות של מודל זה כוללים שלה בעלות נמוכה יחסית, עלתה התפוקה, להקל על השימוש, להפחית חששות אתיים לגבי בעלי חיים בחסד לעומת מודלים מאתר. לחוקרים, זה מיתרגם יכולת מוגברת כדי לבדוק מרובות משתנים מרווחי ביטחון חזקה יותר, מהירה יותר ניסויים, מעקף של פרוטוקולים בעלי חיים. Mellonella ג שימש כפלטפורמה להעריך במהירות אלביקנס ג התקפה אלימה בעקבות ההפרעות של גנים הדרושים עבור biofilm היווצרות filamentation, ג'ין רגולציה על פני מבודד קלינית11,15 ,16. מחקרים שנעשו לאחרונה שילבו החקירה של פטריות יעילות שימוש mellonella ג כדי להעריך את פרמקוקינטיקה של פעילות סמים והתנגדות תחת ויוו הגדרות, שהן מאתגרת אחרת, זמן רב 17,18. ובכל זאת, מחקרים של התקפה אלימה אלביקנס ג ב mellonella ג יש כבר מורכב על ידי רמות גבוהות הדיווחים של וריאציה בתוך ניסויים ופרוטוקולים לא עקביים בין קבוצות המחקר המייצרים פנוטיפים התקפה אלימה שונות בין עכברים, waxworms11,13,19,20,21. פה, אנו מכינים mellonella ג פרוטוקול לתקנן אלביקנס ג זיהומים, עלייה הפארמצבטית בניסויים התקפה אלימה, ומדגימים עקביות עם מחקרים שתואר לעיל של התקפה אלימה ב מאתר מודלים.
מחקרים קודמים הראו כי אלביקנס ג ההזדווגות, כמו סוג לוקוס (MTL) בכרומוזום 5 מסדיר תא זהות, הזדווגות כשירות הדומה האפייה ו פטריות אחרות Ascomycete22. הרוב המכריע של אלביקנס ג מבודד משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים- MTL מיקומה, קידוד אחד מכל סוג של MTL ו- MTLα אללים (MTL/α), והם סטרילי כתוצאה מכך15, 23 , 24. אובדן אחד אללים MTL דרך אובדן של heterozygosity (LOH) או מוטציה מוביל homozygous MTL או שמקודדים α MTLיכולות לעבור מתג פנוטיפי מהמדינה 'לבן' סטרילי ההזדווגות המוסמכת המדינה 'אטום'25. העבודות הקודמות הדגישה כי אובדן הטרוזיגוטיות MTL גם מקטין התקפה אלימה במודלים מאתר של זיהום סיסטמי על פני רקעים זן שונה26. כאן, אנו מפרטים לדוגמא קנדידה המופץ באמצעות ערכה ניסוי דומה גנטית כדי לתאר את התרומה הטרוזיגוטיות MTL לאלימות ולגרימת ב mellonella ג mellonella ג . אנחנו מראים MTL תצורה השפיעו אלביקנס ג פתוגניות, איפה MTLα זנים היו פחות ארסית ביחס MTL/αוהן MTL תאים, בדומה לממצאי בתוך זיהום מאתר דגם26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות מסתמכים על שימוש של המארחים הגעה, אינם דורשים טיפול בעלי חיים מוסדיים אישור ועדת להשתמש (IACUC).
1. הזחלים Waxworm גלריה (galleria) mellonella
- סדר הזחלים סיטונאים וספקים זה לא להציג את הורמונים, אנטיביוטיקה או טיפולים אחרים לזחלים, אשר מסוגלים יצורים חיים כאלה עושים משלוחים.
- הקפד לרכוש כל הזחלים מאותו הספק במהלך הקורס של ניסויים. היה זהיר בעת הזמנת הזחלים בחודשי הקיץ כפי בטמפרטורה גבוהה מ- 30 מעלות צלזיוס להקטין את הכדאיות הזחלים.
- לפקח על הטמפרטורות על פני המסלול המשלוח הצפוי, בהתאם לתוכנית משלוחים או לבחור משלוח מזורז כדי לצמצם את חשיפתם לתנאי הסביבה.
- כאשר הזחלים מגיעים, לבדוק לכל מכולה כדי להבטיח הזחלים קיימא, בריא נוכחים. הזחלים בריא לגמרי מתחת לפני המים מתחת המצעים, זז, ושולט על הגיוון אור צהוב/טאן עם הזחלים כמה כתמים שחורים או כתמי לאורך הגוף הכוללת.
- לאחסן הזחלים שלהם מיכל בחלל מאוורר בטמפרטורת החדר (25 ° C). תלוי במצבו הראשוני של הזחלים, הם עשויים לשמש עד שבועיים.
2. תרבות לקראת זיהום Galleria mellonella
הערה: מעבדת נכונה הלבוש לענידה לאורך כל חלק זה של הפרוטוקול כולל כפפות, חלוק המעבדה של בטיחות משקפיים.
- להפוך שמרים peptone דקסטרוז פלטות אגר של נוזלים (YPD). להכין 1-פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) ו- 70% אתנול פתרונות.
- גדלים זנים אלביקנס ג כדי להיות מוזרק ללון ב- 3 מ"ל של טרי YPD צינורות תרבות רגיל על תוף מסתובב במהירות בינונית ו 30 ° C.
- ספין תאים למטה-2,500 g x עבור 5 דקות ומפרידה שולחן. יוצקים את תגובת שיקוע, נזהר שלא להפריע בגדר התא.
- Resuspend התאים באופן מלא ב- 5 מ של PBS 1 x על-ידי pipetting חוזרות או vortexing. חזור על צנטריפוגה ו resuspension של תאים ב- PBS עוד פעמיים, כדי להבטיח הסרה של כל תרבות המדיה.
- לאחר שטיפה סופית, resuspend תאים 1 מ"ל של PBS ומעבירים אותם אל צינור microcentrifuge.
- לנהל קבוצה של דילולים סדרתי ב- PBS לייצר בטחונות, 1:1, 000, וסדרות דילול כוללות.
הערה: דילולים אלטרנטיבית עשוי להיות צורך להגיע ספירת הרצוי.- שימוש של hemocytometer, לספור תאים של בטחונות או דילול 1:1,000. לרוב, דילול 1:1,000 מספק שהתא המתאים נחשב אלביקנס ג תרבויות.
- חישוב ריכוז מוחלט של תאים בתוך התרבות הראשונית באמצעות המתמטיקה רשת של hemocytometer, מכוון בין 30-300 תאים להיספר ברשת 5 x 5 מרכזי. מונה הניתן תא אוטומטיות עשוי לשמש כחלופה; עם זאת, השימוש צפיפות אופטית כדי לקבוע תא ספירת אינה מומלצת, כמו מורפולוגיה תאים (גודל, צורה, וכו ') יכולים להשפיע באופן משמעותי על רמת הדיוק שלה.
- שימוש הסעיפים תא נמדד, גורם לדילול חדש 2.5x107 תאים למ"ל ב- PBS x 1 צינור microcentrifuge. דילול זה ישמש כבסיס עבור כל חיסון של mellonella ג עם ג אלביקנס. כל זריקה ידרוש 10 µL של inoculum זה עבור מנה זיהומיות של 250,000 אלביקנס ג תאים.
- לאשר דיוק המינון זיהומיות על ידי ציפוי הנפח הנכון של דילול כוללות עבור 100 יחידות ויוצרים מושבה (CFUs) על אגר YPD עבור כל תרבות שיש להשתמש בה זיהום.
- תקופת דגירה תא לוחות ספירת מהשלב 2.7 של 48 שעות (h) ב 30 מעלות צלזיוס, לספור את מספר מושבות לכל צלחת. בין 80 ל-120 מושבות מהווה טווח מקובל על רמת הדיוק inoculum.
3. זיהום של הזחלים Galleria mellonella עם תרבויות קנדידה
הערה: מעבדת נכונה הלבוש לענידה לאורך כל חלק זה של הפרוטוקול כולל כפפות, חלוק המעבדה של בטיחות משקפיים.
- להוסיף 1 מ"ל אתנול 100% ו- 1 מ"ל של 1 x PBS שני צינורות microcentrifuge נפרדים. אתנול וביו -PBS ישמש כדי לשטוף את המחט הזרקת בין זיהומים.
- מורחים כמות קטנה של waxworm מצעים בשנת ריקה, פטרי סטריליות 100 x 15 מ מ, שיכיל את הזחלים בעקבות חיסון עבור כל זן עצמאי. תוספת של המצעים מגביל את דבקותה של המלח mellonella ג הזחלים השטח פטרי.
- לחטא G 26, מזרק µL 10 על-ידי לקיחת expunging µL 10 של אתנול 70% שלוש פעמים ואחריו שלושה שוטף עם µL 10 ל- 1 x PBS. מערבולת דילול חיסון אלביקנס ג ו תופסות 10 µL של התרבות. ודא כי ישנם אין בועות אוויר בתוך המזרק הזרקת אוויר מקדמת את המוות, תגרום לסיבוך בניתוח במורד הזרם.
- פתח, מיכל הזחלים mellonella ג , בזהירות להתהפך מצעים עם אצבע לחשוף את הזחלים. בחר הזחלים שהם במצב בריאותי טוב כפי שזוהו פעיל תנועה, צבע צהוב/טאן אור ועל חוסר פיגמנטציה שחורה בגוף הזחלים. לרוות כאלה צריך להיות גודל דומה על פני המלא ניסיוני מוגדר.
- לאסוף את הזחלים יחיד והחזק אותו בעדינות בין אינדקס/האצבע והאגודל דומה מחזיק בעיפרון. לגלגל את הזחלים על גבו אז הרגליים פונות מעלה. החזק באורך מלא של הגוף בין האצבעות והאגודל כך הזחלים אינו מסוגל קורל או. לעזוב הזריקה.
הערה: אם רצונך בכך, לעקר את האתר של הזרקת באמצעות מקלון צמר גפן ספוג אתנול 100%. - לסובב את המזרק כך השיקוע של המחט פונה למעלה ולהוסיף לאט לאט את קצה המחט כולל את האורך של השיקוע לתוך הגוף בצומת עם רגל שמאל rearmost. ודא המחט חודר לתוך הגוף לא פשוט לוחצים על הגוף של פנימה הזחלים. ואל תשתמש בכוח לחדור לגוף כמו המחט עלולה לחדור לגמרי הזחלים במהירות. מרימים בעדינות עם המחט יאשר חדירה המתאים. להזריק את inoculum קנדידה µL מלא 10 ולחלץ את המחט.
- חזור על צעד 3.3-3.5 כל הזחלים. כדי למנוע תא להתיישב, מערבולת קנדידה תרבויות עבור חיסון אחרי כל זריקה שלישית. כפקד, להחדיר ערכה של mellonella ג µL 10 ל- 1 X PBS.
- 10 בית משותף הזחלים מוזרק מן התרבות קנדידה זהה בכל צלחת פטרי 100 x 15 מ"מ בעקבות חיסון. דגירה הזחלים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שמונה ימים, בדיקת הזחלים כל 24 שעות כדי לעקוב אחר המוות.
- להעריך את התמותה בתחילה על ידי פיגמנטציה החשוך, היווצרות של כתמים שחורים או גופים, וחוסר תנועה. כדי לאשר התמותה, השתמש פינצטה כדי לגלגל בעדינות אדעך הזחלים על הגב שלהם ולעקור בקלילות התחתון של הזחלים עם הפינצטה. אי-היענות כפי שנצפה על ידי חוסר תנועה הגוף או רגל גלוי סאמפלרים כמוות, הזחלים יוסרו הפטרי.
- לתעד את הזחלים התמותה במרוצת הזמן. הזחלים להתחיל pupate לתוך עש ניתן לכלול הניתוח אך יש להסיר אם הם מתחילים הנשירה. יכול להיות צנזורה הזחלים מאבריה מניתוח נקודת הקצה כמו ההבדלים התקפה אלימה בין הזחלים גולם אינם ברורים.
- להעריך מובהקות סטטיסטית באמצעות מבחן סטטיסטי האח-קוקס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
. הנה, נדגים שיטה ישימה עבור השימוש mellonella ג waxworms לחקור מודל קנדידה המופץ של זיהום באמצעות אלביקנס ג. האחסון המתאים, תחזוקה מבחר של הזחלים זיהום הינם המכריעים של מבטח הפארמצבטית בתמותה mellonella ג (איור 1א'). הזחלים בריא הפעילים, יש צבע צהוב/טן קל, חוסר שחור כתמים על הגוף אמור לשמש עבור מערכת אלה הם בדרך כלל קיימא עבור זיהום עד שבועיים לאחר ההגעה. כדי למזער את ההשפעות שעשויות להיות מבלבלים לפיזיולוגיה mellonella ג , נבחרו הזחלים של גודל ומשקל דומה. Inoculum מעורבים היטב עם הזרקת עקבי באותו אתר אנטומי בגוף הזחלים גם לעמוד כמשתנים חשוב בקידום הפארמצבטית בין ניסויים. תמונות ראווה תחזוקה של הזחלים נגוע דרך המשך של ניסויים (איור 1B).
כדי להעריך את ההשפעה של הזחלים גיל על התקפה אלימה, נפרד PBS בקרת זיהומים בוצעו עם הזחלים או אפס או עשרה ימים לאחר שהגיע. אין הבדל משמעותי ב קינטיקה המוות mellonella ג היה קיים בין קבוצות אלה (איור 2א). הסימנים האופייניים למחלה התעוררו הזחלים של שתי הקבוצות זה נכנע בפני הזיהום; מוספים במקור צהוב/טאן הזחלים הפך דהוי ונתן דרך כתמים שחורים מופיעים לפני אובדן מוחלט של תנועתיות, בסופו של דבר, מוות (איור 2B). זיהום עם אלביקנס ג מאיץ את תהליך זה של שינוי צבע, התחלואה אך אינה משנה באופן משמעותי את המפל של סמני פנוטיפי המובילה למוות לעומת הזחלים נגוע או PBS מוזרק הזחלים (איור 2C).
המינון זיהומיות משפיע משמעותי גם התמותה קינטיקה של זיהומים mellonella ג . כדי להעריך את ההשפעות של גודל inoculum אלביקנס ג , אנחנו נדבקנו mellonella ג עם ארבעה מבודד קליניים שונים (ג 12, P60002, P75010, SC5314: טבלה 1) במינונים שונים שלוש. הזחלים נגוע SC5314 מוצגים התמותה במינונים כל, בקנה אחד עם פתוגניות מוגברת של זה לנתק את יחסי רוב אחרים בשימוש בתוך הניסוי (איור 2D). הזחלים יותר נכנעה זיהום עם 1.0 x 105 SC5314 או 12 C תאים לעומת 1.0 x 104 תאים. המינון הגבוה של 1.0 x 106 תאים הוכיחה בצורה מוגזמת קטלני עם הזחלים גוסס לאחר ההדבקה של כל זני כולל את מבודד פחות ארסית, P60002 ו- 12 ג הזחלים מוזרק עם P75010 ו- SC5314 נכנעה הזיהום בתוך 24 שעות ביממה, מציע שמנה זיהומיות מתון יותר הוא המתאים לקביעת הבדלים התקפה אלימה. כתוצאה מכך, מנה זיהומית של 2.5x105 נעשה שימוש עבור כל הניסויים הבאים.
להפגין דמיון התקפה אלימה בין מאתר mellonella ג מודלים של מחלה מערכתית, אנחנו לבדיקה התקפה אלימה של זנים נגזר SC5314 אלביקנס ג קידוד או משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים (/αאו homozygous (/-או Α /-) MTL לוקוסים. זיהום של mellonella ג עם MTL heterozygotes את SC5314 או prototrophic נגזרות BWP17 וישום הפיק שיעור גבוה של תמותה לעומת חיות המוזרק PBS. שלושה רבעים של הזחלים שליטה שרד יום 8 לעומת הפסד של מעל חצי של כל בעלי החיים אלביקנס ג מוזרק בתוך 3 ימים פוסט זיהום (dpi), כי גדל עוד יותר ב 8 dpi (איור 3א, 3B). זיהום עם BWP17 לחה אלביקנס ג lethality במודל זה (הישרדות 27% לעומת 4% הישרדות SC5314 MTL heterozygotes ב 8 dpi; איור 3 C, 3D). הזחלים mellonella ג נגוע MTLα /-זנים שרד זמן רב יותר באופן משמעותי לעומת זנים הורים משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים MTL (בדיקת יומן-דרגה, SC5314; p = 0.0006, BWP17; p = 0.0002). מעניין, התקפה אלימה של MTLאלביקנס/ג תאיםמתאימים המקביל משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים MTL ברקעים הן SC5314 והן BWP17. לפיכך, תצורת MTL יש השפעה על התקפה אלימה אלביקנס ג עם MTLα /-זנים הצגת הרג ירידה לעומת MTL/αאו MTL/ תאים.
איור 1 . מבט כולל על הליך זיהום. (א) תרשים זרימה מדגיש הרכיבים המרכזיים של ההליך זיהום כולל הזמנת ואחסון של הזחלים, זיהום תרבות הכנה הזרקה. (B) להחליפן בתמונות הצג תנאי אחסון בריא, הכנה של זיהום בחלל, הזרקה, הזחלים התחזוקה בעקבות זיהום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . ההשפעות של נוהלי זיהום mellonella ג . (א) PBS פקדים נדבקו מייד עם ההגעה (PBS-D0, כחול) או אחרי 10 ימים (PBS-D10, אדום). (B) להחליפן בתמונות לסמן את הזחלים דהוי ומוות. (ג) סדרת תמונות של זיהום צלחות פירוט השפעות הזרקת עם PBS (באמצע) או עם SC5314 (נמוך יותר) בהשוואה להזחלים נגוע (למעלה) בימים 1, 3, 5 ו- 7 לאחר ההזרקה. (ד) מינון אפקטים מוצגים בתוך אוסף של מבודד קליניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . MTLאלל מקדמת את הריגת אלביקנס ג mellonella ג. לוקוס MTL משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים(/α), homozygous (/- וα /-) SC5314 () ו- BWP17 (ג) נגזרים מותוות עבור הזחלים התמותה במשך שמונה ימים. מרווחי הביטחון מותוות עבור כל SC5314 (B) , BWP17 (ד) נגזרות להתאמץ כדי לסמן עקביות קינטיקה של הזחלים התמותה לאורך ניסויים. הממוצע (קו רציף) מותווים עם סטיות תקן (מילא את החלל) עבור שלושה משכפל הביולוגי של 10 הזחלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| זן הקנדידה | זן הורים | גן # מושגים בסיסיים | MTL | הפניה |
| MAY1 | SC5314 | בידוד קליניים קנדידה אלביקנס | / α | וו et al. 2007 |
| MAY6 | P60002 | בידוד קליניים קנדידה אלביקנס | / | וו et al. 2007 |
| MAY11 | P75010 | בידוד קליניים קנדידה אלביקנס | / α | וו et al. 2007 |
| MAY15 | 12C | בידוד קליניים קנדידה אלביקנס | / | וו et al. 2007 |
| MAY61 | SC5314 | MTLa:: SAT1 | Α /- | מחקר זה |
| MAY71 | SC5314 | MTLα:: SAT1S tac1::TAC1-GFP-HYGR | /- | מחקר זה |
| MAY313 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-arg4-ura3-בסון sir2::his1/sir2::dpl200... | / α | מחקר זה |
| MAY314 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-בסון sir2::HIS1/sir2::dpl200... | Α /- | מחקר זה |
| MAY315 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-בסון sir2::HIS1/sir2::dpl200... | /- | מחקר זה |
טבלה 1- אלביקנס ג sרכבות השתמשו במחקר זה.
| רכיב משתנה | שליטה המוצע | הפניה |
| הזחלים בגיל בזמן ההזרקה | לצמצם את זמן ההגעה תולעת בין חיסון | מחקר זה |
| הזחלים מגודלה בזמן ההזרקה | להבטיח עקביות בעת בחירת תולעים | פוקס ואח 2010 |
| בריאותם של הזחלים בזמן ההזרקה | סדר תולעים במהלך הטמפרטורה מתונה, להשתמש מיד עם ההגעה | מחקר זה |
| מינון זיהומיות עם אלביקנס ג | בחר של ריכוז זיהומיות המציג מגוון רחב של תוצאות | מחקר זה |
| הזחלים בתגובה להזרקת | התנהלות PBS פקדים הזרקת לצד תולעים עם הזרקה לא | Hirakawa et al. 2015 |
בטבלה 2. שיקולים לגבי mellonella ג זיהום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המודל waxworm mellonella ג עומד ככלי יעיל עבור ניתוח לשחזור וברכבות של התקפה אלימה אלביקנס ג . פרוטוקול מפורט זה נשענת על משלוח עקבי של מנה זיהומיות מוגדר לאותו אתר ברחבי אוסף של הזחלים. מינון זיהומיות יש השפעה עמוקה על התמותה mellonella ג ואילו השימוש הזחלים שלהם ההגעה הראשונית בין 10 ימים בעקבות קבלת הפיק תוצאות דומות. אובדן של albicansMTL ג אלל תוצאות התקפה אלימה ירידה עקבית עם הקודם ניסויים בעכברים למרות שיבוש אלל α MTLלא תשנה את הזחלים מוות.
התוצאה של זיהומים mellonella ג יכול להיות השפיעו באופן משמעותי על ידי עיצוב ניסיוני. בניגוד מודלים חוליות של זיהום, וריאציה קטן ההזרקה, inoculum נפח וגודל inoculum עשוי להשפיע פרשנויות של הנתונים. זיהומים עם מספר גדל והולך של תאים אלביקנס ג הובילה תחלואה רבה יותר ומהירה יותר של הזחלים נגועים. בשלב מסוים, הזרקת מדי אלביקנס ג מופיע מסוגל מוחץ מארח את ההגנות המובילה למוות מהיר של המחשב המארח, שעשוי להיות דרך הלם רעילים. אולם, SC5314 היה עקבי המתח קטלני ביותר במינונים כל, ואחריו 12C, ולאחר מכן זנים אחרים. לפיכך, זיהום פרמטרים יש השפעה עמוקה על קינטיקה מוחלטת של זיהומים אבל עדיין יכול לספק הערכות של התקפה אלימה היחסי. עבודה מוקדמת במסגרת ניסויים אלה הפגינו עוד יותר את חשיבות לשטוף ביסודיות תאי קנדידה . YPD שיורית כלולים באופן משמעותי בולוס הזרקת מקטין הזחלים הישרדות (נתונים לא מוצג).
תולעת בריאות הוא משתנה קריטי כאשר ניסויים mellonella ג . הזחלים מועבר באמצעות משלוח רגיל באמצע הקיץ לעתים קרובות מגיעים בטרם עת בגיל או לחוץ, מכוסה כתמים שחורים, עם ירידה הכדאיות. אין תפקיד משמעותיות עבור הזחלים גודל על תחלואה נצפתה בעבר למרות הניסויים המתוארים כאן התמקד assaying הזחלים של מסה שווה בערך. הזחלים בריא וזחלים שליטה PBS צריכה תמיד לפעול לצד קבוצות זיהום לקחת בחשבון שינויים בהזחלים הכדאיות בין הביולוגי משכפל המבוצעת בימים נפרדים. Mellonella ג נגוע עשרה ימים לאחר המגיעים התאימה את קינטיקה של הזחלים נגוע מיד עם קבלת. לפיכך, משלוח בודד של הזחלים יכול לספק מספיק חומר וזמן ביצוע ניסויים מלאה. ניסויים אלה לסמוך על בעלי חיים 30 לכל זן כדי לקבוע הבדלים התקפה אלימה, אשר חיות יותר באופן משמעותי מאשר בדרך כלל מנוצל במודלים מאתר, וכתוצאה מכך ביטחון חזקה יותר של תוצאות התצפיות11,27 , 28. מודל זה מופחת גם חששות אתיים, זמן ועלויות לעומת מודלים חוליות של זיהום. לפיכך, השימוש של שעווה הזחלים עשויה להקל זיהוי של השפעות קטנות יותר על התקפה אלימה מערכתית מזו המתאפשרת במערכות אחרות.
אזהרות הגלום במערכת mellonella ג קיימות להגביל את השירות שלה ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי. תחילה, mellonella ג חוסר מערכת חיסונית אדפטיבית, אינה יכולה לשמש כדי לחקור antigenicity או זיכרון אימונולוגי כמו פרוקריוטים גבוה29. הגוף של הזחלים מורכב חור רציף יחיד מלא hemolymph, אשר מתפקדים לזרום חומרים מזינים, איתות מולקולות תאים חיסוניים, פפטידים מיקרוביאלית. אלו תאים חיסוניים, hemocytes, מתנהגים בדומה נויטרופילים יכול לפיכך phagocytose, ליצור התפרצויות חמצוני ו מפרישים אנזימים lytic בעקבות הפעלה באמצעות קולטנים זיהוי הפתוגן חוץ-תאית30. ובכל זאת, פעולה זו היא תת-קבוצה של מולדת תא החיסון תהליכים בתוך מערכות מיתרניים כי לא תשקף באופן מלא כל הפעילויות ליקוציט. הקונה מרכזי נוסף הוא העדר קיומה של אסיפה הגנום עבור mellonella ג למרות הגנום היה לאחרונה ברצף31. כתוצאה מכך, מידת הגיוון genotypic בתוך המין אינו ידוע, סביר רוב הספקים הספינה אוכלוסיות הטרוגניות גנטית שעשויים להשפיע על תמותה לאורך ניסויים. יתר על כן, טכניקות מולקולריות לא קיימים עבור האורגניזם ומסבכים ניסיונות לנתח תרומות מארח פתוגנזה. ובכל זאת, תוצאות עקביות התקפה אלימה בעקבות זיהום עם אלביקנס ג לאורך ניסויים, ספקים, זמן, מעבדות תומך השירות שלהם בשאלות היסוד של פתוגניות.
אובדן של MTL הקטינה התקפה אלימה של אלביקנס ג ביחס MTL heterozygotes ורקעים homozygote MTLα. מגמה זו עולה בקנה אחד עם עבודה מוקדמת המתבצעת באמצעות העכבר מודלים של התקפה אלימה מערכתית26. בניגוד מאתר מודלים, אובדן של MTLα משנה התקפה אלימה ביחס MTL/α הורים זן. הפער בין תוצאות אלו אינה ברורה, אך עשויים לכלול רכיבים של חסינות מסתגלת חסרים באורגניזמים הגעה. לחלופין, התקפה אלימה מוגברת המשויך MTL heterozygosity ניתן לייחס רק אלל α MTLב- SC5314, potentiating את הצורך הערכה על פני רקעים הזנים מרובים. לכן, אנו מציעים תפקיד דיפרנציאלי עבור התקפה אלימה בין שני אללים MTL .
בסך הכל, המודל mellonella ג משמש כמודל לשחזור וברכבות להערכת קנדידה מערכתית. שאר המפרט של התקפה אלימה ניתן לבדיקה עם מודל זה כולל שכיחות פטרייתי על ידי ציפוי הזחלים homogenate המושבה יוצרי יחידות (CFUs)11 או ביולומינסנציה, המספק גם לוקליזציה פטרייתי32. בעתיד, מודל זה ניתן להרחיב כדי להעריך את מאפייני התקפה אלימה של מינים אחרים קנדידה כגון עמידות לתרופות מוגברות ב מתהווים לאחרונה קנדידה auris מינים33. המשך הפיתוח של כלים כדי להמחיש לימפוציט בתוך mellonella ג אינטראקציה עם זיהום קנדידה, waxworm המפגרים שושלות כדי להפחית את השתנות זיהומים תוצאות, ויזואליזציה של תהליך זיהומיות ויה כתב קנדידה קווים34 עוד יותר למקד את מודל זה של המחלה ולאפשר חקירות עמוק יותר של in vivo פתוגן-פונדקאי אינטראקציות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצה להכיר בסיוע ווושינגטון פמלה אנדרסון לאה בהשגת Galleria mellonella לשימוש במחקר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Snackworms.com | Buy twice as many worms as expected to use | |
| 10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe | Hamilton | 80000 | |
| Petri dish, 100X15 mm, 500 pack | Fisher | FB0875712 | |
| Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack | VWR | 87003-294 | |
| Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL | VWR | 97062-818 | |
| Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL | Millipore Sigma | EM-EX0276-1S | |
| autoclaved ddH2O |
References
- Kauffman, C. A., et al. Prospective multicenter surveillance study of funguria in hospitalized patients. The National Institute for Allergy and Infectious Diseases (NIAID) Mycoses Study Group. Clinical Infectious Diseases. 30 (1), 14-18 (2000).
- Horn, D. L., et al. Epidemiology and outcomes of candidemia in 2019 patients: data from the prospective antifungal therapy alliance registry. Clinical Infectious Diseases. 48 (12), 1695-1703 (2009).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clinical Microbiology Reviews. 20 (1), 133-163 (2007).
- Sardi, J. C., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 1 10-24 (2013).
- Segal, E., Frenkel, M. Experimental in Vivo Models of Candidiasis. J Fungi (Basel). 4 (1), (2018).
- Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L. Animal models for candidiasis. Current Protocols in Immunology. 105, 11-17 (2014).
- Heymann, P., et al. The siderophore iron transporter of Candida albicans (Sit1p/Arn1p) mediates uptake of ferrichrome-type siderophores and is required for epithelial invasion. Infection and Immunity. 70 (9), 5246-5255 (2002).
- Priest, S. J., Lorenz, M. C. Characterization of Virulence-Related Phenotypes in Candida Species of the CUG Clade. Eukaryotic Cell. 14 (9), 931-940 (2015).
- Savage, D. C., Dubos, R. J. Localization of indigenous yeast in the murine stomach. J Bacteriol. 94 (6), 1811-1816 (1967).
- Ewbank, J. J., Zugasti, O. C. elegans: model host and tool for antimicrobial drug discovery. Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 300-304 (2011).
- Amorim-Vaz, S., Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. Examining the virulence of Candida albicans transcription factor mutants using Galleria mellonella and mouse infection models. Frontiers in Microbiology. 6, 367 (2015).
- Harding, C. R., Schroeder, G. N., Collins, J. W., Frankel, G. Use of Galleria mellonella as a model organism to study Legionella pneumophila infection. Journal of Visualized Experiments. (81), e50964 (2013).
- Jacobsen, I. D. Galleria mellonella as a model host to study virulence of Candida. Virulence. 5 (2), 237-239 (2014).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
- Hirakawa, M. P., et al. Genetic and phenotypic intra-species variation in Candida albicans. Genome Research. 25 (3), 413-425 (2015).
- Dunn, M. J., Kinney, G. M., Washington, P. M., Berman, J., Anderson, M. Z. Functional diversification accompanies gene family expansion of MED2 homologs in Candida albicans. PLoS Genetics. 14 (4), 1007326 (2018).
- Astvad, K. M. T., Meletiadis, J., Whalley, S., Arendrup, M. C. Fluconazole Pharmacokinetics in Galleria mellonella Larvae and Performance Evaluation of a Bioassay Compared to Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry for Hemolymph Specimens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).
- Mesa-Arango, A. C., et al. The non-mammalian host Galleria mellonella can be used to study the virulence of the fungal pathogen Candida tropicalis and the efficacy of antifungal drugs during infection by this pathogenic yeast. Med Mycol. 51 (5), 461-472 (2013).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Fuchs, B. B., O'Brien, E., Khoury, J. B., Mylonakis, E. Methods for using Galleria mellonella as a model host to study fungal pathogenesis. Virulence. 1 (6), 475-482 (2010).
- Kavanagh, K., Fallon, J. P. Galleria mellonella larvae as models for studying fungal virulence. Fungal Biology Reviews. 24 (1-2), 79-83 (2010).
- Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285 (5431), 1271-1275 (1999).
- Legrand, M., et al. Homozygosity at the MTL locus in clinical strains of Candida albicans: karyotypic rearrangements and tetraploid formation. Molecular Microbiology. 52 (5), 1451-1462 (2004).
- Lockhart, S. R., et al. In Candida albicans, white-opaque switchers are homozygous for mating type. Genetics. 162 (2), 737-745 (2002).
- Miller, M. G., Johnson, A. D. White-opaque switching in Candida albicans is controlled by mating-type locus homeodomain proteins and allows efficient mating. Cell. 110 (3), 293-302 (2002).
- Wu, W., Lockhart, S. R., Pujol, C., Srikantha, T., Soll, D. R. Heterozygosity of genes on the sex chromosome regulates Candida albicans virulence. Molecular Microbiology. 64 (6), 1587-1604 (2007).
- Herrero, A. B., et al. KRE5 gene null mutant strains of Candida albicans are avirulent and have altered cell wall composition and hypha formation properties. Eukaryotic Cell. 3 (6), 1423-1432 (2004).
- Hall, R. A., et al. The Mnn2 mannosyltransferase family modulates mannoprotein fibril length, immune recognition and virulence of Candida albicans. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003276 (2013).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Journal of Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
- Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infection and Immunity. 73 (7), 4161-4170 (2005).
- Lange, A., et al. Genome Sequence of Galleria mellonella (Greater Wax Moth). Genome Announcements. 6 (2), (2018).
- Krappmann, S. Lightning up the worm: How to probe fungal virulence in an alternative mini-host by bioluminescence. Virulence. 6 (8), 727-729 (2015).
- Chowdhary, A., Voss, A., Meis, J. F. Multidrug-resistant Candida auris: 'new kid on the block' in hospital-associated infections. Journal of Hospital Infection. 94 (3), 209-212 (2016).
- Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. Adaptation of a Gaussia princeps Luciferase reporter system in Candida albicans for in vivo detection in the Galleria mellonella infection model. Virulence. 6 (7), 684-693 (2015).
