Summary
Galleria mellonella serve come un modello di invertebrati marini per candidosi diffusa. Qui, abbiamo dettaglio l'infezione protocollo e fornire dati di supporto per l'efficacia del modello.
Abstract
Specie di candida sono comuni fungine commensals degli esseri umani colonizzando superfici mucose, pelle e tratto gastrointestinale. In determinate condizioni, la Candida può Erbaiuto loro nicchie naturali conseguente debilitante infezioni delle mucose come bene come pericolose infezioni sistemiche, che sono degli obiettivi principali di indagine a causa di loro associati alti tassi di mortalità. Modelli animali di infezione diffusa esistano per studiare la progressione della malattia e le caratteristiche di patogenicità di Candida di dissezione. Di questi, il modello di infezione waxworm Galleria mellonella fornisce un conveniente strumento sperimentale per le indagini di alto-rendimento di virulenza sistemica. Molti altri agenti infettivi batterici ed eucariotici sono state studiate in modo efficace in g. mellonella capire patogenicità, che lo rende un sistema di modello ampiamente accettato. Eppure, variazione nel metodo utilizzato per infettare g. mellonella può alterare i risultati fenotipici e complicare l'interpretazione dei risultati. Qui, descriviamo i vantaggi e svantaggi del modello waxworm per studiare la patogenesi di Candida sistemica e un approccio per migliorare la riproducibilità di dettaglio. I nostri risultati selezionare l'intervallo di cinetica di mortalità in g. mellonella e descrivono le variabili che possono modulare questi cinetica. In definitiva, questo metodo si pone come un approccio etico, rapido e conveniente per lo studio di virulenza in un modello della candidosi diffusa.
Introduction
Specie di candida sono comuni commensals umano che sono in grado di emergendo come patogeni opportunisti in severamente immunocompromised e dysbiotic pazienti. Sebbene molte specie di Candida possono causare malattia, c. albicans è la causa più prevalente di candidosi diffusa1,2. Malattia sistemica deriva da c. albicans l'accesso nella circolazione sanguigna tramite entrambi penetrazione diretta delle barriere restrittive precedentemente ospite o introduzione presso siti chirurgici e altre violazioni del corpo3. Candida specie utilizzano una gamma di processi patogeni per causare la malattia sistematica all'interno dell'ospite tra cui filamentazione, formazione di biofilm, l'evasione delle cellule immuni e fuga e ferro lo scavenging4. Esistono in vitro approcci per studiare i meccanismi patogeni individuali, ma modelli animali continuano a fornire la migliore opzione per indagare l'interezza di malattia risultato5,6. La ricerca precedente ha dettagliato molte istanze della promettente indagini in vitro della virulenza non riuscendo a riprodurre in vivo7,8. Così, modelli animali sono ancora necessari per valutare la virulenza in vivo. Maggior parte dei modelli di malattia si basano sui topi per servire come un surrogato per le infezioni umane nonostante albicans del c. impossibilità di colonizzare naturalmente sistemi murini come un commensale9. Invertebrati marini modelli della candidosi diffusa includono il nematode Caenorhabditis elegans, il frutto per volare Drosophila melanogastere la waxworm Galleria mellonella, anche se le preoccupazioni circa le differenze fondamentali in fisiologia di base, le temperature del corpo ospite e vie di esposizione hanno ostacolato la loro vasta accettazione10,11.
Più recentemente, è stato adottato il modello di infezione di waxworm g. mellonella alla patogenicità di modello di una vasta gamma di patogeni batterici e fungini12,13,14. Vantaggi di questo modello includono la relativamente basso costo, una maggiore produttività, facilitano d'uso e ridotto preoccupazioni etiche per quanto riguarda animali beneficenza rispetto ai modelli murini. Per i ricercatori, questo si traduce in una maggiore possibilità di testare più variabili, gli intervalli di confidenza più forti, più rapida sperimentazione e bypass dei protocolli degli animali. G. mellonella ha servito come una piattaforma per valutare rapidamente la virulenza di albicans del c. dopo perturbazione dei geni richiesti per regolamento di formazione, FILAMENTAZIONE e gene di biofilm in isolati clinici11,15 ,16. Studi recenti hanno incorporato indagine dell'efficacia antifungina tramite mellonella g. per valutare la farmacocinetica di attività della droga e resistenza sotto impostazioni di in vivo , che sono altrimenti impegnativo e richiede tempo 17,18. Ancora, gli studi della virulenza dei albicans del c. di g. mellonella hanno stati complicati da riferito alti livelli di variazione all'interno di esperimenti e protocolli incoerenti tra gruppi di ricerca che producono differenti fenotipi di virulenza tra topi e waxworms11,13,19,20,21. Qui, descriviamo un protocollo mellonella g. per standardizzare i albicans del c. infezioni, aumento riproducibilità in esperimenti di virulenza e dimostrare la coerenza con gli studi precedentemente descritti della virulenza di murino modelli.
Gli studi precedenti hanno dimostrato che la c. albicans accoppiamento tipo-come (MTL) locus sul cromosoma 5 regola della microcella e accoppiamento competenza simile a Saccharomyces cerevisiae e altri di funghi ascomiceti22. La maggior parte degli isolati di c. albicans è eterozigotica del locus MTL , codifica uno di ciascuno degli MTLun e MTLα alleli (MTLun/α) e è di conseguenza sterile15, 23 , 24. perdita di uno degli alleli MTL attraverso la perdita di eterozigosi (LOH) o mutazione conduce ad omozigotica MTLun o ceppi α MTLche possono subire un interruttore fenotipico dello stato sterile 'bianco' per la accoppiamento di stato competente 'opaque'25. Il lavoro precedente ha evidenziato che la perdita di eterozigosi MTL riduce anche virulenza in modelli murini di infezione sistemica per il ceppo diverso sfondi26. Qui, abbiamo dettaglio il modello di g. mellonella per candidosi diffusa utilizzando un set sperimentale geneticamente simile per rappresentare il contributo di eterozigosi MTL alla virulenza in g. mellonella. Mostriamo che configurazione MTL influenzato albicans del c. patogenicità, dove MTLα ceppi erano meno virulenti rispetto al MTLun/α sia MTLun celle, simile ai risultati all'interno di infezione murina modello26.
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Protocol
Tutti i metodi descritti si basano sull'impiego di invertebrati marini padroni di casa e non richiedono l'approvazione istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC).
1. galleria mellonella Waxworm larve
- Larve di ordine da grossisti e fornitori che non introducono ormoni, antibiotici o altri trattamenti per le larve e che sono in grado di spedire e consegnare esemplari vivi.
- Essere sicuri di acquistare tutte le larve dallo stesso fornitore nel corso della sperimentazione. Prestare attenzione quando si ordinano le larve durante i mesi estivi, come temperature superiori ai 30 ° C diminuiscono la vitalità di larve.
- Monitoraggio delle temperature in tutto il percorso di spedizione prevista e pianificare la spedizione e la consegna di conseguenza o scegliere spedizione celere per minimizzare la loro esposizione alle condizioni ambientali.
- Quando le larve arrivano, check ogni contenitore per assicurare le larve vitali, sane sono presenti. Larve sane saranno completamente sommersa sotto la biancheria da letto, in movimento e possiedono una leggera colorazione giallo/tan con poche larve contenenti segni neri o macchie lungo il corpo.
- Memorizzare le larve nel loro contenitore in uno spazio ventilato a temperatura ambiente (25 ° C). A seconda della condizione iniziale delle larve, possono essere utilizzati fino a due settimane.
2. cultura preparazione per Galleria mellonella infezione
Nota: Un abbigliamento adeguato laboratorio deve essere indossato in tutta questa parte del protocollo tra cui guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza.
- Fare destrosio di lievito peptone (YPD) liquido e agar tavole. Preparare 1 x tamponato fosfato salino (PBS) e soluzioni di etanolo 70%.
- Crescere di ceppi di C. albicans deve essere iniettato durante la notte in 3 mL di YPD fresco in provette di coltura standard su un tamburo rotante a velocità medie e 30 ° C.
- Selezione celle verso il basso a 2.500 x g per 5 min in una centrifuga da tavolo. Versare il sovranatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet cellulare.
- Risospendere le cellule completamente in 5 mL di PBS 1X ripetute pipettando o Vortex. Ripetere la centrifugazione e risospensione delle cellule in PBS altre due volte per garantire la rimozione di tutti i terreni di coltura.
- Dopo un lavaggio finale, risospendere le cellule in 1 mL di PBS e trasferirli in una provetta da microcentrifuga.
- Condurre una serie di diluizioni in PBS per generare un 1: 100, 1:1, 000 e serie di diluizioni 1: 100.000.
Nota: Diluizioni alternativi potrebbero essere necessari raggiungere i conteggi delle cellule desiderata.- Utilizzando un emocitometro, contare le celle da 1: 100 o la diluizione di 1:1,000. Più spesso, la diluizione di 1:1,000 fornisce che la cella appropriata conta per c. albicans culture.
- Calcolare la concentrazione totale di cellule all'interno della cultura iniziale utilizzando la matematica di griglia dell'emocitometro, puntando tra 30-300 celle da contare nella centrale griglia 5 x 5. Un contatore di cellule automatizzato può essere utilizzato come alternativa; Tuttavia, uso di densità ottica per determinare la conta delle cellule è sconsigliato come morfologia delle cellule (dimensione, forma, ecc.) possa influire significativamente l'esattezza.
- Utilizzando i conteggi delle cellule misurata, fare una nuova diluizione di 2.5x107 cellule/mL in 1X PBS in una microcentrifuga. Questa diluizione servirà come base per ogni inoculazione di mellonella g. con c. albicans. Ogni iniezione richiederà 10 µ l di questo inoculo per una dose infettiva di 250.000 cellule di c. albicans .
- Verificare l'accuratezza della dose infettiva di placcatura il corretto volume della diluizione 1: 100 000 per 100 unità formanti colonie (CFU) su agar YPD per ogni cultura essere utilizzato in infezione.
- Incubare le piastre conte cellulari dal passaggio 2.7 per 48 ore (h) a 30 ° C e contare il numero di colonie per piastra. Tra 80 e 120 colonie costituisce un intervallo accettabile per accuratezza nell'inoculo.
3. infezione delle larve di Galleria mellonella con culture di Candida
Nota: Un abbigliamento adeguato laboratorio deve essere indossato in tutta questa parte del protocollo tra cui guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza.
- Aggiungere 1 mL di etanolo al 100% e 1 mL di 1X PBS a due separati per microcentrifuga. L'etanolo e PBS serviranno per lavare l'ago per iniezione tra le infezioni.
- Stendere una piccola quantità di biancheria da letto di waxworm in un vuoto, sterile di Petri 100 x 15 mm, che ospiterà le larve dopo inoculazione per ogni sforzo indipendente. Aggiunta di biancheria da letto limita l'aderenza dei morti mellonella g. larve sulla superficie della piastra di Petri.
- Sterilizzare un 26 G, 10 siringa µ l prendendo e espungere 10 µ l di etanolo al 70% tre volte seguita da tre lavaggi con 10 µ l di 1X PBS. Vortice la diluizione di inoculazione di albicans del c. e occupano 10 µ l di cultura. Assicurarsi che non siano senza bolle d'aria all'interno della siringa, come iniezione di aria promuove la morte e complicherà analisi a valle.
- Aprire un container contenente le larve mellonella g. e attentamente capovolgere biancheria da letto con un dito per scoprire le larve. Selezionare le larve che sono in buona salute, come identificato dal movimento attivo, una luce di colore giallo/tan e una mancanza di pigmentazione nera sul corpo di larve. Queste larve devono essere di dimensioni simili tutta la sperimentale impostate.
- Pick up un singolo larve e tenerlo delicatamente tra il pollice e indice e medio simile a che tiene una matita. Rotolare le larve sul lato posteriore in modo che le gambe sono rivolto verso l'alto. Tenere l'intera lunghezza del corpo tra le dita e il pollice in modo che le larve è in grado di arricciatura o tirare lontano l'iniezione.
Nota: Se lo si desidera, sterilizzare il sito di iniezione con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 100%. - Ruotare la siringa in modo smusso dell'ago rivolto verso l'alto e inserire lentamente la punta dell'ago, compresa la lunghezza della smussatura nel corpo allo svincolo con la gamba sinistra più arretrata. Assicurarsi che l'ago penetra il corpo e non semplicemente spingere il corpo dello dentro le larve. Non forzare mai a penetrare il corpo come l'ago può perforare completamente attraverso le larve rapidamente. Si sollevano delicatamente con l'ago confermerà la penetrazione adeguata. Iniettare l'inoculo di Candida completa 10 µ l ed estrarre l'ago.
- Ripetere il passaggio 3,3-3,5 per ogni larve. Per evitare la sedimentazione, vortice la Candida cella culture per inoculazione dopo ogni terza iniezione. Come un controllo, è possibile iniettare un insieme di g. mellonella con 10 µ l di 1X PBS.
- Co-house 10 larve iniettate dalla stessa coltura Candida in ogni capsula di Petri 100 x 15 mm dopo l'inoculazione. Incubare le larve a 37 ° C per otto giorni, il controllo di larve ogni 24 h per monitorare la morte.
- Valutare la mortalità inizialmente da pigmentazione buia, la formazione di macchie nere o corpi e la mancanza di movimento. Per confermare la mortalità, è necessario utilizzare una pinzetta a rotolare delicatamente moribonde larve sulla loro schiena e poke leggermente inferiore di larve con le pinzette. Non-responsività come osservato da una mancanza di movimento visibile del corpo o della gamba è segnato come la morte e le larve vengono rimossi da di Petri.
- Mortalità di larve di registrare nel corso del tempo. Le larve che iniziano a pupate in falene possono essere inclusi nell'analisi ma dovrebbero essere rimosso se cominciano a muta. Pupating larve possono essere censurate dal punto finale analisi come le differenze di virulenza tra larve e pupa sono poco chiare.
- Valutare la significatività statistica utilizzando test statistico Mantel-Cox.
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Representative Results
Qui, dimostriamo un metodo riproducibile per l'uso di waxworms g. mellonella per studiare un modello di candidosi diffusa di infezione usando c. albicans. Il deposito appropriato, la manutenzione e la selezione delle larve per infezione sono una componente fondamentale di assicurare la riproducibilità della mortalità mellonella g. (Figura 1A). Larve sane che sono attive, hanno una luce di colore giallo/tan, e patch di mancanza nero sul corpo deve essere utilizzata per questo sistema e sono in genere praticabile per l'infezione fino a due settimane dopo l'arrivo. Per ridurre al minimo eventuali effetti potenzialmente di confusione di mellonella g. fisiologia, le larve sono state selezionate di analoghe dimensioni e peso. Un inoculo ben miscelato e iniezione costante presso la stessa sede anatomica del corpo larve anche stare come variabili importanti nella promozione di riproducibilità fra gli esperimenti. Immagini vetrina manutenzione delle larve infettate attraverso la durata della sperimentazione (Figura 1B).
Per valutare l'impatto dell'età di larve sulla virulenza, separata PBS controllo infezioni sono state eseguite con larve zero o dieci giorni dopo il suo arrivo. Nessuna differenza significativa nella cinetica della morte di g. mellonella esisteva tra questi gruppi (Figura 2A). Segni caratteristici della malattia ha presentato in larve da entrambi i gruppi che hanno soccombuto all'infezione; la colorazione di originariamente giallo/tan delle larve è diventato scolorita e ha dato modo di macchie nere prima della totale perdita di motilità e, alla fine, la morte (Figura 2B). L'infezione con c. albicans accelera questo processo di decolorazione e morbosità ma non altera significativamente la cascata di marcatori fenotipici che conducono alla morte rispetto alle larve non infette o larve di PBS iniettato (Figura 2C).
La dose infettiva influisce anche notevolmente cinetica di mortalità di g. mellonella infezioni. Per valutare gli effetti delle dimensioni di inoculo di albicans del c. , siamo infettati mellonella g. con quattro diversi isolati clinici (12 C, P60002, P75010 e SC5314: tabella 1) a tre diverse dosi. Le larve infettate con SC5314 visualizzato mortalità a tutte le dosi, coerente con una maggiore patogenicità di questo isolato rispetto a molti altri utenti utilizzato all'interno dell'esperimento (Figura 2D). Altre larve ha soccombuto all'infezione con 1.0 x 105 SC5314 o C 12 celle rispetto a 1,0 x 104 celle. La dose massima di 1.0 x 106 celle si dimostrò eccessivamente letale con larve muoiono a seguito di infezione di tutti i ceppi tra cui gli isolati meno virulenti, P60002 e 12 ° C. Le larve iniettate con P75010 e SC5314 ha soccombuto all'infezione entro 24 h, suggerendo che una dose infettiva più moderata è opportuno determinare le differenze nella virulenza. Di conseguenza, una dose infettiva di 2.5x105 è stata utilizzata per tutti i successivi esperimenti.
Per dimostrare la somiglianza nella virulenza tra murino e mellonella g. modelli di malattia sistemica, abbiamo analizzato la virulenza dei ceppi di derivati SC5314 albicans del c. codifica sia eterozigote (un/α o omozigoti (un/- o Α /-) MTL loci. Infezione di g. mellonella con MTL heterozygotes da suo background genetico di BWP17 derivati prototrophic o il SC5314 prodotto alti tassi di mortalità rispetto agli animali di PBS-iniettato. Tre quarti delle larve controllo sopravvissuti fino al giorno 8 rispetto alla perdita di oltre la metà di tutti gli animali di c. albicans iniettato entro 3 giorni post infezione (dpi) che ulteriormente aumentata ogni dpi 8 (Figura 3A, 3B). Infezione con BWP17 inumidito letalità di albicans del c. in questo modello (sopravvivenza del 27% rispetto al 4% sopravvivenza in SC5314 MTL heterozygotes alle 8 dpi; Figura 3 C, 3D). Mellonella g. larve infettate da MTLα /-ceppi sopravvissuti significativamente più lungo rispetto ai ceppi parentali eterozigoti MTL (test log-rank, SC5314; p = 0,0006, BWP17; p = 0,0002). È interessante notare che, virulenza di MTL/-C. albicans celluleabbinati sua controparte eterozigoti MTL in sfondi SC5314 sia BWP17. Così, MTL configurazione hanno un'influenza sulla virulenza di albicans del c. con MTLα /-ceppi visualizzazione uccisione in diminuzione rispetto al MTLun/α o da MTLun/-cellule.
Figura 1 . Panoramica della procedura di infezione. (A) un diagramma di flusso mette in evidenza gli elementi chiave della procedura di infezione, tra cui l'ordinazione e lo stoccaggio di larve, infezione cultura preparazione e iniezione. (B) rappresentante immagini mostrano le condizioni di conservazione sano, preparazione della manutenzione di spazio, iniezione e larve di infezione dopo l'infezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Gli effetti delle procedure di mellonella g. infezione. (A) PBS controlli sono stati infettati o immediatamente all'arrivo (PBS-D0, blu) o dopo 10 giorni (PBS-D10, rosso). (B) immagini rappresentative evidenziano morte e larve scolorimento. (C) una serie di immagini delle piastre di infezione in dettaglio gli effetti dell'iniezione con PBS (medio) o con SC5314 (inferiore) rispetto alle larve non infette (in alto) nei giorni 1, 3, 5 e 7 dopo l'iniezione. (D) effetti di dosaggio sono illustrati all'interno di una collezione di isolati clinici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Il MTLun allele promuove uccisione di albicans del c. di g. mellonella. MTL locus eterozigote (un/α) e omozigote (un/- e α /-) SC5314 (A) e BWP17 (C) derivati vengono tracciati per la mortalità di larve oltre otto giorni. Gli intervalli di confidenza vengono tracciati per ogni SC5314 ceppo derivato (B) e BWP17 (D) per evidenziare la coerenza nella cinetica della mortalità di larve attraverso esperimenti. La media (linea continua) è rappresentato graficamente con deviazioni standard (riempite nello spazio) per tre replicati biologici di 10 larve ogni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Candida di ceppo | Ceppo parentale | Genotipo | MTL | Riferimento |
| MAY1 | SC5314 | Candida albicans isolato clinico | a/α | Wu et al. 2007 |
| MAY6 | P60002 | Candida albicans isolato clinico | un/a | Wu et al. 2007 |
| MAG11 | P75010 | Candida albicans isolato clinico | a/α | Wu et al. 2007 |
| 15 MAGGIO | 12C | Candida albicans isolato clinico | un/a | Wu et al. 2007 |
| MAY61 | SC5314 | MTLa:: SAT1 | Α /- | Questo studio |
| MAY71 | SC5314 | MTLα:: SAT1S tac1::TAC1-GFP-HYGR | un /- | Questo studio |
| MAY313 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-arg4-ura3-BN sir2::his1/sir2::dpl200 | a/α | Questo studio |
| MAY314 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-BN sir2::HIS1/sir2::dpl200 | Α /- | Questo studio |
| MAY315 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-BN sir2::HIS1/sir2::dpl200 | un /- | Questo studio |
Tabella 1. Albicans del c. streni utilizzati in questo studio.
| Componente variabile | Controllo suggerito | Riferimento |
| Età di larve al momento dell'iniezione | Ridurre al minimo il tempo tra l'arrivo di verme e inoculazione | Questo studio |
| Dimensione di larve in fase di iniezione | Garantire la coerenza quando si seleziona worm | Fuchs et al. 2010 |
| Salute di larve in fase di iniezione | Vermi durante la temperatura moderata, usare immediatamente all'arrivo | Questo studio |
| Dose infettante con c. albicans | Selezionare una concentrazione infettiva che presenta la più ampia gamma di risultati | Questo studio |
| Risposta di larve all'iniezione | Effettuare controlli di iniezione di PBS a fianco di vermi con nessuna iniezione | Hirakawa et al 2015 |
Tabella 2. Considerazioni per quanto riguarda mellonella g. infezione.
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Discussion
Il modello di waxworm g. mellonella si pone come strumento efficace per l'analisi rapida e riproducibile di virulenza di albicans del c. . Questo protocollo dettagliato si basa sulla distribuzione uniforme di una dose infettiva definita allo stesso sito attraverso un batch delle larve. Dose infettiva ha un profondo impatto sulla mortalità mellonella g. considerando che l'uso di larve tra loro arrivo iniziale e dieci giorni dal ricevimento prodotto risultati simili. Perdita dell'allele c. albicansMTLun provoca diminuzione virulenza coerenza con precedenti esperimenti in topi sebbene perturbazione dell'allele α MTLnon ha alterato la morte di larve.
Il risultato di g. mellonella infezioni può essere significativamente influenzato dal disegno sperimentale. Contrariamente ai modelli vertebrati dell'infezione, piccola variazione nel sito di iniezione, volume di inoculo e nella dimensione dell'inoculo può avere un impatto interpretazioni dei dati. Infezioni con un numero crescente di cellule di albicans del c. ha portate alla morbilità maggiore e più rapida delle larve infette. A un certo punto, iniettando troppi albicans del c. appare in grado di sopraffare le difese ospite che conducono alla morte rapida dell'host, potenzialmente attraverso shock tossico. Tuttavia, SC5314 è stato costantemente il ceppo più virulento a tutte le dosi, seguito da C 12 e poi gli altri ceppi. Così, parametri di infezione hanno un profondo impatto sulla cinetica assoluta delle infezioni ma possono ancora fornire stime della relativa virulenza. Lavoro precedente all'interno di questi esperimenti ha dimostrato ulteriormente l'importanza di lavare accuratamente le cellule di Candida . YPD residuo incluso nel bolo iniezione significativamente fa diminuire la sopravvivenza larve (dati non mostrati).
Salute di vite senza fine è una variabile critica quando conducendo esperimenti mellonella g. . Le larve trasportate tramite spedizione standard in piena estate spesso arrivano prematuramente invecchiato o stressati, ricoperto di macchie nere, con l'attuabilità in diminuzione. Nessun ruolo significativo per la dimensione di larve sulla morbosità precedentemente è stato osservato anche se gli esperimenti descritti qui incentrato su analizzante larve di massa più o meno equivalente. Larve sane e PBS controllo larve devono sempre essere eseguite insieme a gruppi di infezione per contabilizzare eventuali modifiche nell'attuabilità di larve tra repliche biologiche eseguite in giorni separati. G. mellonella infettati dieci giorni dopo arriva abbinato la cinetica delle larve infettati immediatamente al ricevimento. Così, una singola spedizione di larve può fornire sufficiente materiale e tempo per eseguire esperimenti completo. Questi esperimenti fatta valere 30 animali per ceppo per determinare le differenze nella virulenza, che è significativamente più animali che in genere utilizzati in modelli murini, con conseguente più forte fiducia dei risultati osservati11,27 , 28. questo modello ridotto anche preoccupazioni di ordine etico, tempi e costi rispetto ai modelli vertebrati dell'infezione. Così, l'uso di larve di cera può facilitare l'identificazione degli effetti minori sulla virulenza sistemica rispetto a quanto possibile in altri sistemi.
Avvertenze inerenti al sistema g. mellonella esistano che limitano la sua utilità nello studio di interazioni ospite-patogeno. In primo luogo, g. mellonella manca un sistema immunitario adattativo e non può essere utilizzato per indagare l'antigenicità o memoria immunologica come in più alti eucarioti29. Il corpo delle larve è composto da una singola cavità continua piena di emolinfa, che funzionano per far circolare le sostanze nutrienti, molecole, cellule immunitarie e peptidi antimicrobici di segnalazione. Queste cellule immuni, emociti, comportarsi in modo simile ai neutrofili e pertanto possono fagocitare, generare burst ossidativo e secernere enzimi litici dopo l'attivazione attraverso agente patogeno extracellulare riconoscimento recettori30. Eppure, questa funzione è un sottoinsieme di processi delle cellule immuni innate nell'ambito dei sistemi dei Cordati che potrebbero non riflettere pienamente tutte le attività del leucocita. Un altro avvertimento importante è la mancanza di un assembly di genoma per mellonella g. sebbene il genoma è stato recentemente sequenziato31. Di conseguenza, nella misura della diversità genotipica all'interno della specie è sconosciuta e probabilmente maggior parte dei fornitori nave popolazioni geneticamente eterogenee che possono influire sulla mortalità attraverso esperimenti. Inoltre, le tecniche molecolari non esistono per l'organismo e complicare qualsiasi tentativo di sezionare i contributi di host alla patogenesi. Ancora, risultati coerenti virulenza dopo l'infezione con c. albicans attraverso esperimenti, fornitori, tempo e labs supporta loro utilità in questioni fondamentali della patogenicità.
Perdita di MTLuna ridotta virulenza dei albicans del c. relativo MTL eterozigoti e MTLα omozigote sfondi. Questa tendenza è coerenza con il precedente lavoro svolto utilizzando modelli murini di virulenza sistemica26. A differenza di modelli murini, perdita di MTLα non ha alterato la virulenza rispetto il MTLun/α ceppo parentale. La discrepanza tra questi risultati è chiara ma può includere componenti dell'immunità adattativa che mancano negli organismi invertebrati marini. In alternativa, una maggiore virulenza associata MTL eterozigosi può essere attribuibile solo per l'allele α MTLin SC5314, che rafforza la necessità di valutazione attraverso sfondi multipli del ceppo. Di conseguenza, suggeriamo un ruolo differenziale per la virulenza tra i due alleli MTL .
Nel complesso, il modello di g. mellonella serve come un modello rapido e riproducibile per valutare la candidosi sistemica. Altre letture di virulenza possono essere analizzate con questo modello tra cui prevalenza fungina di omogenato di larve per unità (CFUs)11 o bioluminescenza, che fornisce anche la localizzazione fungine32di formazione di colonie di placcatura. In futuro, questo modello può essere espanso per valutare le caratteristiche di virulenza di altre specie di Candida come elevati farmacoresistenza in appena emergente auris Candida specie33. Costante sviluppo di strumenti per visualizzare dei linfociti all'interno di g. mellonella interagendo con infettare Candida, lignaggi inbred waxworm per ridurre la variabilità in esiti di infezioni e la visualizzazione di processo infettivo via reporter Candida linee34 ulteriormente perfezionare questo modello della malattia e consentire più profonde indagini in vivo di interazioni ospite-patogeno.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desidera ringraziare l'assistenza di Pamela Washington e Leah Anderson nell'ottenere Galleria mellonella per uso in questo studio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Snackworms.com | Buy twice as many worms as expected to use | |
| 10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe | Hamilton | 80000 | |
| Petri dish, 100X15 mm, 500 pack | Fisher | FB0875712 | |
| Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack | VWR | 87003-294 | |
| Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL | VWR | 97062-818 | |
| Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL | Millipore Sigma | EM-EX0276-1S | |
| autoclaved ddH2O |
References
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