Summary
凝膜状杆菌是一种播散念珠菌病的无脊椎动物模型。在这里, 我们详细介绍了感染协议, 并为模型的有效性提供了支持数据。
Abstract
念珠菌是人类在皮肤、粘膜表面和胃肠道中的常见真菌共生体。在某些条件下,念珠菌可以过度生长他们的自然定位, 导致衰弱的黏膜感染以及危及生命的全身感染, 这是一个主要的研究焦点, 因为他们相关的高死亡率。为研究疾病进展和剖析念珠菌致病性特征, 存在传播感染的动物模型。其中,麦地那龙菌蜡虫感染模型为高通量系统毒力调查提供了一个具有成本效益的实验工具。许多其他细菌和真核感染因子已在g. mellonella中得到有效研究, 以了解致病性, 使其成为一个被广泛接受的模型系统。然而, 用于感染g. mellonella 的方法的变化可以改变表型结果, 并使结果的解释复杂化。在这里, 我们概述了蜡虫模型的好处和缺点, 以研究系统念珠菌的发病机制, 并详细介绍了提高重现性的方法。我们的研究结果突出了g. mellonella 的死亡率动力学范围, 并描述了可以调节这些动力学的变量。最终, 这种方法是一个合乎道德的, 快速的, 具有成本效益的方法来研究在一个模型的传播念珠菌病的毒力。
Introduction
念珠菌是常见的人类共生体, 能够成为严重免疫功能低下和生物功能障碍患者的机会性病原体。虽然许多念珠菌类可以引起疾病,白色念珠菌是传播念珠菌病 1,2最普遍的原因。系统性疾病的原因是白色念珠菌通过直接渗透以前限制性的宿主屏障或在手术部位引入和其他身体接触 3.念珠菌利用一系列致病过程在宿主内引起全身性疾病, 包括丝状、生物膜形成、免疫细胞逃避和逃逸以及铁清除4。体外方法存在, 以调查个人的致病机制, 但动物模型继续提供了最好的选择, 以调查整个疾病结局 5,6。以前的研究详细介绍了许多有希望的体外研究毒力未能在体内繁殖7,8。因此, 仍然需要动物模型来评估体内的毒力.尽管白色念珠菌无法作为例长9自然地殖民小鼠系统, 但大多数疾病模型都依靠老鼠作为人类感染的代名词.无脊椎动物中的传播念珠菌模型包括线虫、果蝇果蝇和蜡虫的线虫, 尽管担心根本的区别在基本生理上, 宿主体温和暴露途径阻碍了它们的广泛接受 10,11 。
最近, g . mellonella蜡虫感染模型已被采用来模拟致病性的细菌和真菌病原体12,13,14。这种模式的优点包括, 与小鼠模型相比, 它的成本相对较低, 吞吐量增加, 易用性, 以及减少对动物慈善的伦理担忧。对于研究人员来说, 这转化为测试多个变量的能力增强、置信区间更强、实验速度更快、动物协议的旁路。在11、15例临床分离株的生物膜形成、丝状化和基因调控所需的基因受到干扰后, 美洛内拉已经成为快速评估白色念珠菌毒力的平台 ,16。最近的研究纳入了使用g. mellonella 进行抗真菌效果的研究, 以评估体内环境下药物活性和耐药性的药代动力学, 否则这些活性和耐药力具有挑战性和耗时17,18。然而, 据报道, 由于实验中的差异很大, 研究小组之间的重复也不一致, 从而产生不同的毒力表型, 这使得对白色念珠菌中白色念珠菌毒力的研究变得更加复杂老鼠和蜡虫之间 11,13,19, 20,21。在这里, 我们概述了一种g. mellonella 协议,以规范白色念珠菌感染, 提高毒力实验的重现性, 并证明与前面描述的小鼠毒力研究的一致性模型。
先前的研究表明, 5号染色体上的白色念珠菌交配样位点 (mtl) 调节细胞身份和交配能力, 类似于酿酒酵母和其他 ascomycete 真菌 22.白色念珠菌分离株的大多数在mtl位点是杂合, 编码每个mtla 和 mtlα等位基因 (mtla/α) 的一个, 因此是无菌的15,23,24. 由于杂合性 (loh) 丢失或突变而失去其中一个mtl等位基因, 会导致纯合mtla或mtlα菌株, 这些菌株可以经历从无菌 "白色" 状态到无菌 "白色" 状态到无菌 "白色" 状态的表型开关。配合主管 "不透明" 状态25。先前的研究表明, mtl杂合性的丧失也会降低不同应变背景的小鼠全身感染模型的毒力26。在这里, 我们详细介绍 g . mellonella模型的传播念珠菌病使用基因相似的实验集, 以描绘mtl杂合性对毒性的贡献。我们表明, mtl 构型影响白色念珠菌的致病性, 其中mtlα菌株的毒性较低, 无论是mtla/α和mtla 细胞, 类似于研究结果在小鼠感染模型26。
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Protocol
所述的所有方法都依赖于无脊椎动物宿主的使用, 不需要机构动物护理和使用委员会 (iacuc) 的批准。
1.麦地那龙线虫幼虫
- 从批发商和供应商订购不向幼虫引入激素、抗生素或其他治疗方法并能够运送和运送活体标本的幼虫。
- 在实验过程中, 一定要从同一供应商处购买所有幼虫。夏季订购幼虫时要小心, 因为温度超过30°c 会降低幼虫的生存能力。
- 监控预期运输路线的温度, 并相应地规划运输和交付, 或选择快速运输, 以最大限度地减少其在环境条件下的暴露。
- 当幼虫到达时, 检查每个容器, 以确保存在存活的、健康的幼虫。健康的幼虫将完全淹没在被褥下, 移动, 并拥有一个浅黄色/褐色的颜色与几个幼虫含有黑色的痕迹或身体的变色。
- 在室温 (25°c) 的通风空间内将幼虫存放在容器中。根据幼虫的初始条件, 它们最多可以使用两周。
2.霉菌感染的培养准备
注: 在协议的这一部分, 包括手套、实验室外套和安全眼镜, 应穿上适当的实验室服装。
- 使酵母肽葡萄糖 (ypd) 液体和琼脂板。制备1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 和70% 乙醇溶液。
- 在中等速度和30°c 的旋转鼓上的标准培养管中, 在3毫升新鲜 ypd 中注入白色念珠菌株过夜。
- 在桌面离心机中将细胞向下旋转, 速度为 2, 500 x 克, 5分钟。倒掉上清液, 小心不要打扰细胞颗粒。
- 通过重复移液或涡旋, 在 1 x pbs 的5毫升中完全重新移植细胞。重复在 pbs 中的细胞离心和再悬浮两次, 以确保去除所有培养基。
- 最后清洗后, 将细胞重新悬浮在 pbs 的1毫升中, 并将其转移到微离心管中。
- 在 pbs 中进行一系列稀释, 以生成1:100、1:1000 和1:100000 稀释系列。
注: 可能需要进行替代稀释, 以达到所需的细胞计数。- 使用血细胞计, 计数细胞从 1: 100 或1:1000 稀释。最常见的是, 1:1000 稀释为白色念珠菌培养提供了适当的细胞计数。
- 使用血细胞仪的网格数学计算初始培养中细胞的总浓度, 目标是在中央5x5 网格中计算30-300 个细胞。可使用自动单元计数器作为替代方法;但是, 不鼓励使用光学密度来确定细胞计数, 因为细胞形态 (大小、形状等) 会显著影响其精度。
- 利用测量的细胞计数, 在微离心管中, 在 1xpbs 中对 2.5 x10 7 细胞进行新的稀释。这种稀释将作为每一次用白色念珠菌接种 g. mellonella的基础。每次注射都需要10μl 的接种, 其传染性剂量为 250, 000毫升白色念珠菌细胞。
- 通过在 ypd 琼脂上为100个菌落形成单元 (cfu) 为每个用于感染的培养物, 为100个菌落形成单元 (cfu) 进行正确的1:100000 稀释, 以确认感染剂量的准确性。
- 在30°c 下将2.7 步的细胞计数板孵化 48小时 (h), 并计算每个板的菌落数。80到120个菌落构成了一个可接受的范围为准确性在接种。
3.麦地那龙菌幼虫感染念珠菌培养
注: 在协议的这一部分, 包括手套、实验室外套和安全眼镜, 应穿上适当的实验室服装。
- 在两个独立的微离心管中加入1毫升的100% 乙醇和1毫升的 1x pbs。乙醇和 pbs 将用于清洗注射针之间的感染。
- 在一个空的 100 x 15 毫米无菌培养皿中铺开少量的蜡虫床上用品, 这将容纳每个独立菌株接种后的幼虫。在培养皿表面添加床层限制了死的 g . mellonella幼虫的粘附性。
- 通过三次取出和清除70% 乙醇的 10μl, 然后用1μl 的 1x pbs 进行三次洗涤, 对 26 g、10μl 注射器进行消毒。涡旋接种白色念珠菌的接种稀释, 并采取10μl 的培养。确保注射器内没有气泡, 因为空气注入会导致死亡, 并使下游分析复杂化。
- 打开一个装有g. mellonella 幼虫的容器, 用手指小心地翻转床上用品, 以揭开幼虫的面纱。选择通过主动运动、浅黄色的颜色和幼虫体内缺乏黑色色素沉着来确定的健康良好的幼虫。这些幼虫在整个实验集中的大小应该是相似的。
- 拿起一个幼虫, 轻轻地把它夹在食指和拇指之间, 就像拿着一支铅笔一样。把幼虫卷到背上, 这样腿就朝上了。在手指和拇指之间保持身体的全长, 使幼虫无法卷曲或远离注射。
注: 如果需要, 使用100% 乙醇浸泡的棉签对注射部位进行消毒。 - 旋转注射器, 使针头的斜面朝上, 并慢慢地将针尖插入, 包括斜面的长度进入与最后面的左腿交界处的身体。确保针头穿透身体, 而不是简单地将幼虫的身体向内推。不要在穿透身体时使用武力, 因为针头可能会迅速穿透幼虫。轻轻抬起针头将确认适当的渗透。注射完整的10μl 念珠菌接种, 并提取针头。
- 对每个幼虫重复步骤 3.3-3.5。为了防止细胞沉淀, 每三次注射后,就会对念珠菌培养物进行免疫接种。作为对照, 注入一组1μl 为 1x pbs 的g. mellonella.
- 在接种后的每 100 x 15 毫米培养皿中, 共容纳10个从相同念珠菌培养物中注射的幼虫。在37°c 下将幼虫孵化 8天, 每24小时检查一次幼虫, 以监测死亡情况。
- 评估死亡率最初通过变暗的色素沉着, 黑色斑块或身体的形成, 以及缺乏运动。为了确认死亡率, 用推子轻轻地将垂死的幼虫滚到它们的背上, 用推子轻轻戳幼虫的下侧。由于缺乏可见的身体或腿部运动而观察到的不反应是在死亡和幼虫从培养皿中取出时得分。
- 记录一段时间内幼虫死亡率。开始木偶进入飞蛾的幼虫可以被纳入分析, 但如果开始腐烂, 应该被摘除。由于幼虫与虫的毒力差异尚不清楚, 从终点分析可以对幼体进行审查。
- 使用 mantel-cox 统计测试评估统计意义。
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Representative Results
在这里, 我们演示了一种可重复的方法, 用于使用g. mellonella蜡虫, 以调查传播念珠菌感染模型使用白色念珠菌。适当储存、维护和选择用于感染的幼虫是确保g. mellonella 死亡率重现性的关键组成部分 (图 1a)。健康的幼虫是活跃的, 有浅黄色/颜色, 身体上没有黑色斑块应用于这个系统, 通常是可行的感染后, 抵达后两周。为了最大限度地减少g. mellonella生理的任何潜在混淆影响, 选择了大小和重量相似的幼虫。在幼虫身体的同一解剖部位进行混合良好的接种和一致的注射也是促进实验重复性的重要变量。图片展示了通过实验时间对受感染幼虫的维持 (图 1b)。
为了评估幼虫年龄对毒力的影响, 在到达后的零天或十天内分别进行了 pbs 控制感染。两组间在 g. mellonella死亡动力学上无显著性差异 (图 2a)。两组均有明显的疾病迹象, 均因感染而死亡;幼虫最初的黄褐色着色变色, 在完全丧失动力和最终死亡之前, 让位于黑色斑块 (图 2b)。与未感染的幼虫或注射 pbs 幼虫相比, 白色念珠菌感染加速了这一变色和发病过程, 但并没有显著改变导致死亡的表型标记级联 (图 2c)。
感染剂量也对g. mellonella感染的死亡率动力学有显著影响。为了评估白色念珠菌接种大小的影响, 我们以三种不同的剂量感染了四种不同的临床分离株 (12c、p60002、p75010 和 sc5314:表1)。感染 sc5314 的幼虫在所有剂量下都显示出死亡率, 这与该分离物的致病性相对于实验中使用的大多数其他动物的致病性增加是一致的 (图 2d)。更多的幼虫死于 1.0 x10 5 sc5314 或12c 细胞的感染, 而 1.0 x 104个细胞。1.0x106个细胞的最高剂量被证明是过度致命的, 幼虫在感染所有菌株后死亡, 包括毒性较小的分离株 p60002 和12c。注射 p75010 和 SC5314 的幼虫在24小时内死亡, 这表明更适度的感染剂量是适当的, 以确定毒力的差异。因此, 所有后续实验都使用了 2.5 x105 的传染性剂量。
为了证明小鼠和全身性疾病的g. mellonella模型的毒力相似, 我们检测了 sc5314 衍生的白色念珠菌菌株的毒力, 编码杂合 (-derived 或纯合 (a)α--) mtl位点。与注射 pbs 的动物相比, 从 sc5314 或其原养衍生物 bwp17 遗传背景中感染mtl杂合子的 g. mellonella 可产生较高的死亡率。四分之三的对照幼虫存活到第8天, 而在感染 (dpi) 后3天内注射的所有白色念珠菌动物中, 有一半以上的幼虫丢失, 在 8 dpi 时进一步增加 (图 3a, 3b)。bwp17 感染在该模型中抑制白色念珠菌的死亡率 (27% 的存活率, 而 sc5314 mtl 杂合子在 8 dpi 时的存活率为 4%;图 3c, 3d)。与 mtl 杂合亲本菌株相比, 感染mtlα菌株的 g. mellonella 幼虫存活时间明显更长 (对数等级试验, sc5314; p=0.0006, bwp17; poce0.0002)。有趣的是, mtla/-c 白色念珠菌细胞的毒力在 sc5314 和 bwp17 背景下都与 mtl 杂合相匹配。因此, mtl 构型确实对mtlα的白色念珠菌毒力有影响, 与mtla/α或mtla/细胞相比, 这种菌株的杀灭率降低.
图 1.感染程序概述。(a)流程图突出了感染程序的关键要素, 包括幼虫的订购和储存、感染培养制剂和注射。(b)具有代表性的图像显示健康的储存条件、感染空间的准备、注射和感染后的幼虫维持。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2.g. mellonella感染程序的影响。(a) pbs 对照在抵达后立即感染 (pbs-d0, 蓝色) 或10天后 (pbs-d10, 红色)。(b)有代表性的图像突出了幼虫变色和死亡。(c)与注射后第1天、第3天、第5天和第7天的未感染幼虫 (顶部) 相比, 一系列感染板详细介绍了 pbs (中) 或 sc5314 (下) 注射的效果。(d)剂量效应显示在一系列临床分离物中。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3.mtl等位基因促进白色念珠菌的杀灭. mtl位点杂合 (a/α) 和纯合 (a/和α--) sc5314 ( a) 和 bwp17 (c)衍生物被绘制为幼虫死亡超过八天。绘制了每个 sc5314 (b)和 bwp17 (d)导数菌株的置信区间, 以突出实验中幼虫死亡率动力学的一致性。平均 (实线) 用标准偏差 (在空间中填充) 绘制, 用于三个生物复制, 每个幼虫10个。请点击这里查看此图的较大版本.
| 念珠菌株 | 父母压力 | 基因 | Mtl | 参考 |
| may1 | sc5314 | 白色念珠菌临床分离 | 阿卡 | wu 等人, 2007年 |
| may6 | p60002 | 白色念珠菌临床分离 | 阿阿 | wu 等人, 2007年 |
| may11 | p75010 | 白色念珠菌临床分离 | 阿卡 | wu 等人, 2007年 |
| may15 | 12c | 白色念珠菌临床分离 | 阿阿 | wu 等人, 2007年 |
| may61 | sc5314 | mtla:: sat1 | α-- | 这项研究 |
| may71 | sc5314 | mtlα::sat1s a: tac1-gfp-hygr | 阿伊- | 这项研究 |
| may313 | bwp17 | ura3: | 阿卡 | 这项研究 |
| may314 | bwp17 | ura3: | α-- | 这项研究 |
| may315 | bwp17 | ura3: | 阿伊- | 这项研究 |
表 1.白色念珠菌的列车在这项研究中使用.
| 可变元件 | 建议的控制 | 参考 |
| 注射时幼虫年龄 | 最大限度地缩短蠕虫到达和接种之间的时间 | 这项研究 |
| 注射时幼虫大小 | 在选择蠕虫时确保一致性 | fuchs 等人, 2010年 |
| 注射时幼虫健康 | 在中等温度下订购蠕虫, 抵达后立即使用 | 这项研究 |
| 传染性剂量与白色念珠菌 | 选择具有最广泛结果的传染性浓度 | 这项研究 |
| 幼虫对注射的反应 | 在没有注射的情况下与蠕虫一起进行 pbs 注射控制 | hirakawa 等人2015年 |
表2。关于 g. mellonella 感染的注意事项.
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Discussion
g. mellonella蜡虫模型是快速、可重复分析白色念珠菌毒力的有效工具。这一详细的协议依赖于在一批幼虫中一致地将确定的传染性剂量传递给同一地点。传染性剂量对 g. mellonella 的死亡率有深远的影响, 而从最初到达到收到后10天使用幼虫产生了类似的结果。失去c. albicansmtl 导致毒力下降, 与以前的实验一致的小鼠, 尽管中断 mtlα等位基因并不能改变幼虫的死亡。
g . mellonella感染的结果可能会受到实验设计的显著影响。与脊椎动物感染模型相比, 注射部位、接种体积和接种量的微小变化可能会影响对数据的解释。随着白色念珠菌细胞数量的增加, 感染幼虫的发病率越来越高, 而且更快。在某一点上, 注射太多的白色念珠菌似乎能够压倒宿主防御, 导致宿主迅速死亡, 有可能通过毒性休克。然而, sc5314 一直是最致命的菌株在所有剂量, 其次是 12c, 然后其他菌株。因此, 感染参数对感染的绝对动力学有深远的影响, 但仍可提供相对毒力的估计。以前在这些实验中的工作进一步证明了彻底清洗念珠菌细胞的重要性。注射丸中残留的 ypd 显著降低幼虫存活率 (数据未显示)。
蠕虫健康是进行g. mellonella实验时的一个重要变量。在盛夏使用标准运输的幼虫往往过早老化或有压力, 覆盖着黑色的斑块, 生存能力下降。此前没有观察到幼虫大小对发病率的重要影响, 尽管这里描述的实验重点是检测质量大致相当的幼虫。健康幼虫和 pbs 控制幼虫应始终与感染群体一起运行, 以解释在不同日期进行的生物复制之间幼虫活力的任何变化。g. mellonella 在到达十天后感染, 与收到后立即感染的幼虫的动力学相匹配。因此, 单批幼虫可以提供足够的材料和时间来进行全面实验。这些实验依靠每株30只动物来确定毒力的差异, 这种毒力明显高于通常在小鼠模型中使用的动物, 从而增强了对观察结果11、27 的信心,28. 与脊椎动物感染模式相比, 这种模式还减少了伦理问题、时间和费用。因此, 使用蜡幼虫可能有助于识别比其他系统可能对全身毒力的影响更小的影响。
对g. mellonella系统存在内在的警告, 限制了其在宿主-病原体相互作用研究中的作用。首先, g. mellonella 缺乏适应性免疫系统, 不能用于研究抗原性或免疫记忆, 因为在更高的真核生物29。幼虫的身体是由一个充满血淋巴的连续腔组成, 它的功能是循环营养物质、信号分子、免疫细胞和抗菌肽。这些免疫细胞, 血细胞, 行为类似于中性粒细胞, 因此可以吞噬, 产生氧化爆发, 并通过细胞外病原体识别受体激活后分泌溶解酶30。然而, 这个功能是弦系统内先天免疫细胞过程的一个子集, 可能不能充分反映所有白细胞的活动。另一个主要的警告是缺乏一个基因组组装 g . mellonella,虽然基因组最近被测序31。因此, 该物种内基因型多样性的程度尚不清楚, 大多数供应商可能在整个实验中运送可能影响死亡率的基因异质种群。此外, 分子技术不存在的有机体和复杂的任何尝试解剖宿主对发病机制的贡献。然而, 在实验、摊贩、时间和实验室感染白色念珠菌后, 一致的毒力结果支持它们在致病性的基本问题上的效用。
mtl的丧失降低了白色念珠菌相对于mtl杂合子和mtlα纯合子背景的毒力。这一趋势与以前使用小鼠模型的系统性毒力26所做的工作是一致的。与小鼠模型相比, mtlα的丢失并没有改变相对于mtla/α亲本菌株的毒力。这些结果之间的差异尚不清楚, 但可能包括无脊椎动物中缺失的适应性免疫成分。或者, 与mtl杂合相关的毒力增加可能只能归因于 sc5314 中的mtlα等位基因, 从而增加了跨多个应变背景进行评估的需要。因此, 我们建议两个mtl等位基因之间的毒力的差异作用。
总体而言, g. mellonella模型是评估全身念珠菌病的快速和可重复的模型。其他的毒力读数可以用这个模型检测, 包括真菌流行电镀幼虫均质的菌落形成单位 (cfu)11或生物发光, 这也提供真菌定位32。在未来, 该模型可以扩大到评估其他念珠菌物种的毒力特征, 如耐药能力升高在新出现的念珠菌物种33。继续开发工具, 以可视化 g. mellonella 内的淋巴细胞与感染念珠菌, 自交系蜡虫, 以减少感染结果的变异性, 并可视化感染过程通过记者念珠菌线34将进一步完善这种模型的疾病, 并允许更深入的研究体内宿主-病原体相互作用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者希望感谢帕米拉·华盛顿和利亚·安德森在获得用于本研究的大肠杆菌方面的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Snackworms.com | Buy twice as many worms as expected to use | |
| 10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe | Hamilton | 80000 | |
| Petri dish, 100X15 mm, 500 pack | Fisher | FB0875712 | |
| Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack | VWR | 87003-294 | |
| Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL | VWR | 97062-818 | |
| Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL | Millipore Sigma | EM-EX0276-1S | |
| autoclaved ddH2O |
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