Summary
Galleria mellonella Dissemine kandidiyazis için omurgasız bir model olarak hizmet vermektedir. Burada, enfeksiyon ayrıntılı protokol ve modelin etkinliği için destek veri sağlar.
Abstract
Candida türlerinin ortak mantar commensals deride, mukozal yüzeyler ve gastrointestinal sistem kolonize insanlar vardır. Belirli koşullar altında onların doğal niş araştırma onların ilişkili yüksek mortalite oranları nedeniyle önemli bir odak noktası olan, iyi olarak yaşamı tehdit eden sistemik enfeksiyonlar olarak mukozal hastalık zayıflatıcı kaynaklanan Candida sarmak. Hayvan modelleri Dissemine enfeksiyon hastalığı ilerleme eğitim ve Candida patojenitesi özellikleri dissekan için mevcut. Bunlar sistemik virülans yüksek üretilen iş araştırmalar için düşük maliyetli bir deneysel araç Galleria mellonella waxworm enfeksiyon modeli sağlar. Birçok diğer bakteriyel ve ökaryotik bulaşıcı yaygın olarak kabul edilen modeli sistemi yapım o patojenitesi, anlamak için G. mellonella içinde etkili bir şekilde incelenmiştir. Henüz, G. mellonella bulaştırmak için kullanılan yöntem varyasyon fenotipik sonuçları değiştirmek ve sonuçların yorumlanması zorlaştırıyor. Burada, avantajları ve dezavantajları sistemik Candida Patogenez çalışma ve tekrarlanabilirlik geliştirmek için bir yaklaşım detay waxworm modelinin anahat. Sonuçlarımız G. mellonella mortalite kinetik aralığı vurgulamak ve bu kinetik modüle değişkenler açıklanmaktadır. Sonuçta, bu yöntem virülans Dissemine kandidiyaz, bir modeli eğitim için etik, hızlı ve uygun maliyetli bir yaklaşım gibi duruyor.
Introduction
Candida türlerinin çoğu fırsatçı patojenler olarak ortaya yeteneğine sahip ortak insan commensals ağır immün ve dysbiotic hastalar. Her ne kadar pek çok Candida tür hastalığa neden olabilir, C. albicans Dissemine kandidiyazis1,2en yaygın nedeni. Sistemik hastalığı kan dolaşımına daha önce kısıtlayıcı ana engelleri ya doğrudan penetrasyon veya cerrahi siteleri ve diğer ihlaller vücut3giriş aracılığıyla erişme C. albicans kaynaklanır. Candida türleri çeşitli filamentation, biyofilm oluşumu, bağışıklık hücre kaçırma ve kaçış ve4atma demir de dahil olmak üzere ana bilgisayar içinde sistemik hastalığı neden patojenik kullanmaktadır. Vitro yaklaşımlar bireysel patojenik mekanizmaların araştırmak için vardır, ancak hayvan modelleri hastalık sonucu5,6tamamını araştırmak için en iyi seçenek sunmaya devam ediyoruz. Önceki araştırma vivo içinde7,8çoğaltmak başarısız virülans in vitro araştırmalar umut verici, birçok örnekleri ayrıntılı. Böylece, hayvan modelleri yine virülans değerlendirmek gerekir içinde vivo. Çoğu hastalık modelleri C. albicans yetersizlik doğal komensal9fare sistemleri kolonize rağmen insan enfeksiyonları için bir vekil olarak hizmet verecek fareler güveniyor. Dissemine kandidiyazis omurgasız modelleri arasında Yuvarlak solucanlar Caenorhabditis elegans, meyve Drosophila melanogasterve waxworm Galleria mellonella, her ne kadar sinek temel farklar hakkında endişeler temel fizyolojisi ana bilgisayar vücut sıcaklığı ve maruz kalma yolları onların geniş kabul10,11. engel
Son olarak, G. mellonella waxworm enfeksiyon modeli modeli patojenitesi bakteriyel ve fungal patojenlerin12,13,14, geniş bir aralığı için kabul edilmiştir. Bu modelin avantajları onun nispeten düşük maliyetli, yüksek üretilen iş dahil, kullanım kolaylığı ve Etik kaygılar ile ilgili hayvan ihsan fare modellerle karşılaştırıldığında sınırlı. Araştırmacılar için bu test birden çok değişken, daha güçlü güven aralıkları, daha hızlı deneme ve bypass hayvan iletişim kurallarının artan yeteneği çevirir. G. mellonella hızla pertürbasyon klinik yalıtır11arasında,15 biyofilm oluşumu, filamentation ve gen düzenleme için gerekli genleri takip C. albicans virülans değerlendirmek için bir platform olarak hizmet vermiştir ,16. Son yıllarda yapılan çalışmalarda soruşturma antifungal etkinliğinin farmakokinetik uyuşturucu etkinlik ve direnç Aksi takdirde zor ve zaman alıcı vivo içinde ayarları'nın altında değerlendirmek için G. mellonella kullanarak dahil var. 17,18. Henüz, G. mellonella C. albicans virülans çalışmaların varyasyon deneyleri ve farklı virülans fenotipleri üretmek araştırma grupları arasında tutarsız iletişim kuralları içinde bildirildi yüksek düzeyde karmaşık bir hal Fareler waxworms11,13,19,20,ve21arasında. Burada, bir G. mellonella protokol C. albicans enfeksiyonları, artış tekrarlanabilirlik virülans deneylerde standartlaştırmak ve tutarlılık virülans antikorundan daha önce açıklanan çalışmaları ile göstermek için anahat modelleri.
Önceki çalışmalar türü gibi (MTL) odağı kromozom 5 üzerinde çiftleşme C. albicans hücre kimliğini ve yetkinlik Saccharomyces cerevisiae ve diğer Ascomycete mantar22benzer çiftleşme düzenleyen gösterdi. C. albicans yalıtır çoğunluğu MTL odağı her biri MTLbir ve MTLα gen (MTLbir/α) kodlama Heterozigoz ve sonuç olarak steril15, vardır 23 , 24. heterozygosity (LOH) veya mutasyon yoluyla MTL gen kaybı olur homozigoz MTLbir veya fenotipik anahtarından steril 'beyaz' durumuna geçirmek için MTLα suşları yetkili 'opak' devlet25çiftleşme. Önceki çalışma MTL heterozygosity kaybı da virülans sistemik enfeksiyon fare modelleri farklı zorlanma arka planlar26arasında azaltır vurgulanmış bulunmaktadır. Burada, G. mellonella modeli Dissemine kandidiyazis MTL heterozygosity G. mellonellavirülans için katkısını tasvir için genetik olarak benzer bir deneysel set kullanarak için ayrıntılı. Biz MTL yapılandırma C. albicans patojenitesi, etkilemiş nerede MTLα suşları MTLbir/α ve MTLbir hücre, benzer bulgular ile ilgili olarak daha az öldürücü olduğunu gösterir fare enfeksiyon modeli26içinde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak omurgasız ana bilgisayarların kullanımı üzerinde itimat ve kurumsal hayvan bakım ve kullanmak Komitesi (IACUC) onayı gerektirmeyen.
1. galleria mellonella Waxworm larvalar
- Toptancılar ve bu hormonlar, antibiyotikler veya diğer tedavilere larvalar tanıtmak değil ve gemi ve canlı örnekler teslim edebiliyoruz tedarikçilerden sipariş larvaları.
- Bütün larva deneme süresince aynı tedarikçiden satın almak emin olun. 30 ° C civarında larva canlılığı azaltmak gibi yaz aylarında larva sipariş verirken dikkatli olun.
- Beklenen nakliye rota sıcaklıklar izlemek ve Sevkiyat ve teslimat buna göre plan veya çevre koşullarına maruz kaldıkları en aza indirmek için hızlandırılmış nakliye seçin.
- Larva geldiğinde her kapsayıcı uygun, sağlıklı larvalar mevcut olduğundan emin olmak için kontrol edin. Sağlıklı larvalar tamamen hareketli, yatak altında sular altında ve siyah işaretleri veya lekeler vücut boyunca içeren birkaç larvaları ile hafif sarı/tan renklendirme sahip.
- Larvalar, ortam sıcaklığı (25 ° C) havalandırılmış bir alanda kendi konteyner saklayın. Larvalar ilk durumuna bağlı olarak, iki haftaya kadar kullanılabilir.
2. kültür hazırlama Galleria mellonella enfeksiyon için
Not: Eldiven, önlük ve koruyucu gözlük de dahil olmak üzere iletişim kuralı bu bölümü uygun laboratuvar kıyafetleri giyilmelidir.
- Maya pepton Dekstroz (YPD) sıvı ve ağar kaplamalar yapmak. 1 x fosfat tamponlu tuz (PBS) ve % 70 etanol çözümleri hazırlayın.
- C. albicans suşları gecede 3 mL standart kültür tüpler dönen davulunun orta hızda ve 30 ° c üzerinde taze YPD enjekte edilir büyümek
- Hücreleri aşağı 2500 x g masa üstü bir santrifüj 5 min için spin. Süpernatant hücre Pelet bozmamaya dikkat edin ' dökün.
- 5 mL 1 x PBS de tamamen hücrelerde tekrarlayan pipetting veya vortexing tarafından resuspend. Santrifüjü ve resuspension hücrelerinin PBS tüm kültür medya kaldırılmasını sağlamak için iki kez daha tekrarlayın.
- Son yıkama sonra PBS 1 mL hücrelerde resuspend ve bir microcentrifuge tüp aktarabilirsiniz.
- 1: 100, 1:1, üretmek için PBS 000, seri dilutions bir dizi yapmak ve 1:100,000 seyreltme serisi.
Not: Alternatif dilutions istenen hücre sayımları ulaşmak gerekli olabilir.- Bir hemasitometre kullanarak, 1: 100 veya 1:1,000 seyreltme hücreleri saymak. En sık 1:1,000 seyreltme uygun hücre C. albicans kültürler için sayar sağlar.
- İlk Kültür Merkezi 5 x 5 kılavuz sayılacak 30-300 hücreler arasında hedefleyen hemasitometre, kılavuz matematik içinde hücrelerin toplam konsantrasyonu hesaplayın. Bir otomatik hücre sayaç alternatif olarak kullanılabilir; Ancak, hücre sayısı hücre morfolojisi (boyut, şekil, vb) cesareti belirlemek için optik yoğunluk kullanımını önemli ölçüde onun doğruluğunu etkileyebilir.
- Ölçülen hücre sayımları kullanarak, yeni bir seyreltme olarak 2.5x107 hücre/mL 1 x PBS microcentrifuge tüp içinde olun. Bu seyreltme G. mellonella C. albicansile her aşı için temel olarak hizmet verecek. Her enjeksiyon bu inoculum 10 µL 250.000 C. albicans hücreleri bulaşıcı bir doz için gerektirir.
- Bulaşıcı doz doğruluğunu 1:100,000 seyreltme 100 koloni oluşturan birim (CFUs) için doğru birim kaplama tarafından YPD agar enfeksiyonunda kullanılmak üzere her kültür için onaylayın.
- 30 ° C'de 48 saattir (h) hücre sayısı Tabaklar adım 2.7 kuluçkaya ve koloniler plaka başına saymak. 80 ile 120 kolonileri arasında kabul edilebilir bir Aralık inoculum doğruluk için kabul ettiğiniz anlamına gelir.
3. enfeksiyon Galleria mellonella larva Candida kültürlerle
Not: Eldiven, önlük ve koruyucu gözlük de dahil olmak üzere iletişim kuralı bu bölümü uygun laboratuvar kıyafetleri giyilmelidir.
- 1 mL % 100 etanol ve 1 mL 1 x PBS için iki ayrı microcentrifuge tüp ekleyin. Etanol ve PBS enfeksiyonlar arasında enjeksiyon iğne yıkamak için kullanılır.
- Waxworm yatak boş, 100 x 15 mm Steril Petri dish, hangi her bağımsız zorlanma için aşı takip larva evi olacak içinde az miktarda yayıldı. Yatak ilavesi sınırlar bağlılık ölü G. mellonella larva Petri kabına yüzeye.
- 26 G, 10 µL şırınga kadar çekici ve üç kez 10 µL 1 x PBS ile üç yıkama ardından % 70 etanol 10 µL expunging tarafından sterilize. Girdap aşılama seyreltme C. albicans ve kültür 10 µL almak. Hava enjeksiyon ölüm teşvik ve aşağı akım Analizi zorlaştıracaktır hiçbir hava kabarcıkları şırınga içinde olduğundan emin olun.
- G. mellonella larva tutan bir kapsayıcı açın ve dikkatle üzerinde yatak larva ortaya çıkarmak için bir parmak ile açın. Etkin hareket, açık sarı/tan renk ve siyah pigmentasyon larva vücuttaki eksikliği ile tanımlanan gibi sağlığı yerinde olan larvalar seçin. Bu larvaların deneysel tam karşısında benzer boyuttaki ayarlamanız gerekir.
- Tek bir larva al ve yavaşça Dizin/orta parmak ve başparmak arasında benzer bir kalem tutan tutun. Bacaklar karşı karşıya bu yüzden larva sırtını üzerine rulo. Böylece larvalar curl veya enjeksiyon uzak çekmek parmak ve başparmak arasında vücudun tam uzunlukta tutun.
Not: arzu edilirse, % 100 etanol ıslatılmış bir pamuk bez kullanarak Enjeksiyon Makinası sterilize. - İbre eğim yukarı dönük şırınga döndürmek ve yavaş yavaş rearmost sol bacak ile kavşağında vücuda eğimi uzunluğu dahil olmak üzere iğne ucu yerleştirin. İğne vücut nüfuz eder ve sadece larva içe doğru vücut itmek değil emin olun. Güç kullanmayın içinde vücut delici iğne tamamen larvaları hızlı bir şekilde işlemek gibi. Yavaşça iğneyle kaldırma uygun penetrasyon onaylayacaktır. Tam 10 µL Candida inoculum enjekte ve iğne ayıklayın.
- 3.3-3.5 her larva için yineleyin. Yerleşme, girdap Candida hücre önlemek için her üçüncü enjeksiyon sonra aşılama için kültürler. Bir denetimi gibi bir dizi G. mellonella 1 X PBS 10 µL ile enjekte et.
- Ortak evi 10 larva aşılama takip her 100 x 15 mm Petri kabına aynı Candida kültüründen enjekte. Larva 37 ° C'de larva her 24 h ölüm izlemek için denetimi sekiz gün için kuluçkaya.
- Ölüm Başlangıçta tarafından karanlık pigmentasyon, siyah yamalar veya organları, oluşumu değerlendirmek ve taşıma bir eksikliği. Ölüm onaylamak için yavaşça onların geri üzerine can çekişen larva rulo ve hafifçe larva'nın alt cımbız ile poke için cımbız kullanın. Sigara gibi görünür vücut ya da bacak hareket eksikliği tarafından yanıt olarak ölüm attı ve larvalar Petri kabına kaldırılır.
- Larva ölüm saat boyunca kaydedin. Güveler YavruIar başlar larva Analize dahil ama tüy dökme etmeye başladığınızda kaldırılmalıdır. Larva ve pupa virülans farklılıkları belirsiz olduğu gibi pupating larva bitiş noktası analizi sansür.
- İstatistiksel anlamlılık Mantel-Cox istatistiksel test kullanarak değerlendirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, G. mellonella waxworms C. albicanskullanarak enfeksiyon Dissemine kandidiyazis modeli araştırmak için kullanmak için tekrarlanabilir bir yöntemi göstermektedir. Uygun bir depolama, bakım ve larva için hastalık yelpazesi tekrarlanabilirlik G. mellonella mortalite (Şekil 1A) sigortalanması kritik bileşeni vardır. Etkin olan sağlıklı larvalar var açık sarı/tan renk ve eksikliği siyah yamalar vücuttaki bu sistemi ve genellikle enfeksiyon için uygun olan için kullanılması gereken en fazla iki hafta varış takip. G. mellonella Fizyoloji herhangi bir potansiyel karıştırıcı etkilerini en aza indirmek için larva benzer boyut ve ağırlık seçildi. Ayrıca iyi karışık inoculum ve larva vücudun aynı anatomik sitesindeki tutarlı enjeksiyon tekrarlanabilirlik deneyler arasında teşvik önemli değişkenler olarak stand. Deneme (Şekil 1B) süresi ile enfekte larva bakım vitrin görüntüleri.
Larva yaş virülans üzerinde etkisini değerlendirmek için ayrı PBS denetim enfeksiyonlar geldikten sonra sıfır veya on gün larva ile gerçekleştirilmiştir. Bu gruplar arasında (Şekil 2A) G. mellonella ölüm kinetik içinde anlamlı bir fark vardı. Karakteristik işaret-in hastalık larva içinde enfeksiyona yenik her iki gruplarından ortaya çıktı; Larvalar başlangıçta sarı/tan coloration renksiz oldu ve toplam kaybı önce siyah yamalar hareketliliği ve sonunda, ölüm (Şekil 2B) bıraktı. C. albicans ile enfeksiyon renk değişikliği ve morbidite bu süreci hızlandırır ancak önemli ölçüde fenotipik işaretleri bulaşmamış larva veya enjekte PBS larva (Şekil 2C) ile karşılaştırıldığında ölüm önde gelen çağlayan değiştirmez.
Enfektif doz ölüm kinetik G. mellonella enfeksiyonların de önemli ölçüde etkiler. C. albicans inoculum boyutu etkilerini değerlendirmek için biz hasta G. mellonella dört farklı klinik yalıtır ile (12 C, P60002, P75010 ve SC5314: Tablo 1) üç farklı dozda. SC5314 ile enfekte larva ölüm tüm dozda, bu izole en diğerleri deneme (Şekil 2D) içinde kullanılan göre artan patojenitesi ile tutarlı görüntülenir. Daha fazla larva 1.0 x 1.0 x 104 hücreleri göre 105 SC5314 veya 12 C hücre ile enfeksiyona yenik. Tüm suşların az öldürücü yalıtır, P60002 ve 12 c de dahil olmak üzere enfeksiyon ölüyor larvaları ile 1.0 x 106 hücreler en yüksek doz aşırı derecede ölümcül ispat P75010 ve SC5314 ile enjekte larva daha ılımlı bir bulaşıcı doz virülans farklılıkları belirlemek için uygun olduğunu düşündüren 24 h içinde enfeksiyona yenik. Sonuç olarak, 2.5x105 bulaşıcı bir doz tüm sonraki deneyler için kullanıldı.
Virülans antikorundan ve sistemik hastalik G. mellonella modelleri arasındaki benzerliği göstermek için biz de kodlama SC5314 elde edilen C. albicans suşlarının virülans denetlesinler Heterozigoz (bir/α ya da homozigoz (bir/-veya α /-) MTL loci. G. mellonella enfeksiyon MTL heterozygotes SC5314 veya prototrophic türev BWP17 genetik arka ile PBS enjekte hayvanlara göre ölüm oranı yüksek oranda üretilen. Kontrol larvaları dörtte hayatta gün kaybına yol karşılaştırıldığında 8 üzerinde yarısı 3 gün içinde tüm enjekte C. albicans hayvanların enfeksiyon (dpi) daha fazla 8 dpi (Şekil 3A, 3B) artış sonrası. Enfeksiyon BWP17 ile nemlendirilmiş C. albicans ölümcül bu modelde (%4 hayatta SC5314 için karşılaştırıldığında % 27'si hayatta kalma MTL heterozygotes 8 dpi; Şekil 3 C, 3D). MTLα /-önemli ölçüde daha uzun hayatta suşları ile enfekte G. mellonella larva karşılaştırıldığında MTL Heterozigoz ebeveyn suşları için (günlük-rank testi, SC5314; p 0,0006, BWP17; = p 0.0002 =). İlginçtir, virülans MTL/C. albicans hücre MTL Heterozigoz muadili hem SC5314 hem de BWP17 arka planlar içinde eşleştirdi. Böylece, MTL yapılandırmasına MTLα /-azaldı öldürmenin MTLbir/α ya da MTLbir/-hücreleri ile karşılaştırıldığında görüntüleme suşları ile C. albicans virülans üzerinde bir etkiye sahip.
Resim 1 . Enfeksiyon yordama genel bakış. (A) bir akış çizelgesi sipariş ve larva, enfeksiyon kültür hazırlama ve enjeksiyon depolama da dahil olmak üzere enfeksiyon yordamı temel unsurları vurgulamaktadır. (B) sağlıklı saklama koşulları, enfeksiyon takip enfeksiyon alanı, enjeksiyon ve larva bakım hazırlanması temsilcisi resimleri göster. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . G. mellonella enfeksiyon yordamlar etkileri. (A) PBS denetimleri hemen girişte (PBS-D0, mavi) veya 10 gün (PBS-D10, kırmızı) sonra enfekte. (B) temsilcisi görüntüleri larva renk değişikliği ve ölüm vurgulayın. (C) enfeksiyon plakaların bir görüntü serisi enjeksiyon PBS (orta) ile etkileri detay veya SC5314 (alt) ile virüs bulaşmamış larva (üst) 1, 3, 5 ve 7 enjeksiyon izleyen günlerde karşılaştırıldığında. (D) dozaj etkileri klinik yalıtır topluluğu içinde gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . MTLbir gen G. mellonellaöldürülmesi C. albicans teşvik. MTL locus Heterozigoz (bir/α) ve homozigoz (bir/- ve α /-) SC5314 (A) ve BWP17 (C) türev sekiz gün içinde larva ölüm için çizilen. Güven aralıkları için her SC5314 çizilen deneyler arasında tutarlılık larva ölüm kinetik vurgulamak için (B) ve BWP17 (D) türev zorlanma. Ortalama (düz çizgi) 10 larva üç biyolojik çoğaltır için standart sapmalar (uzayda dolu) ile çizilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Candida zorlanma | Ebeveyn zorlanma | Genotip | MTL | Başvuru |
| MAY1 | SC5314 | Candida albicans klinik izole | a/α | Wu ve ark. 2007 |
| MAY6 | P60002 | Candida albicans klinik izole | a / | Wu ve ark. 2007 |
| MAY11 | P75010 | Candida albicans klinik izole | a/α | Wu ve ark. 2007 |
| MAY15 | 12C | Candida albicans klinik izole | a / | Wu ve ark. 2007 |
| MAY61 | SC5314 | MTLa:: SAT1 | α /- | Bu çalışmada |
| MAY71 | SC5314 | MTLα:: SAT1S tac1::TAC1-GFP-HYGR | bir /- | Bu çalışmada |
| MAY313 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-arg4-ura3-BN sir2::his1/sir2::dpl200 | a/α | Bu çalışmada |
| MAY314 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-BN sir2::HIS1/sir2::dpl200 | α /- | Bu çalışmada |
| MAY315 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-BN sir2::HIS1/sir2::dpl200 | bir /- | Bu çalışmada |
Tablo 1. C. albicans sBu çalışmada kullanılan trenler.
| Değişken bileşen | Önerilen kontrol | Başvuru |
| Larva yaş zaman enjeksiyon | Solucan varış ve aşılama arasında süresini en aza indirmek | Bu çalışmada |
| Larva boyutu zaman enjeksiyon | Solucanlar seçerken tutarlılığı | Fuchs ve ark. 2010 |
| Larvalar sağlık zaman enjeksiyon | Sipariş sırasında orta sıcaklık solucanlar, hemen girişte kullanmak | Bu çalışmada |
| C. albicans ile bulaşıcı doz | Geniş sonuçlar sunan bulaşıcı bir konsantrasyon seçin | Bu çalışmada |
| Enjeksiyon larva yanıt | PBS enjeksiyon denetimleri solucanlar hiçbir enjeksiyon ile birlikte yapmak | Hirakawa ve ark. 2015 |
Tablo 2. Konuları ile ilgili olarak G. mellonella enfeksiyon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
G. mellonella waxworm modeli C. albicans virülans hızlı ve tekrarlanabilir analizi için etkili bir araç duruyor. Bu ayrıntılı iletişim kuralı aynı site için tanımlanmış bir bulaşıcı doz tutarlı teslim üzerine larva bir dizi dayanır. Larvalar ilk varış ve alış irsaliyesi izleyen on gün arasında kullanımı benzer sonuçlar üretilen ise bulaşıcı doz G. mellonella mortalite üzerinde derin bir etkisi vardır. MTLα alleli bozulma larva ölüm değiştirmemeyi rağmen C. albicansMTLbir gen kaybı azalmış virülans tutarlı farelerde önceki deneyler ile sonuçlanır.
G. mellonella enfeksiyonları sonucu önemli ölçüde deneysel tasarım tarafından etkilenebilir. Enfeksiyon omurgalı modellerinin aksine, enjeksiyon yeri, inoculum cilt ve inoculum boyutta küçük varyasyon yorumların verileri etkileyebilir. C. albicans hücre sayısının artması ile enfeksiyonlar virüslü larva morbidite daha fazla ve daha hızlı yol açtı. Belirli bir noktada çok fazla C. albicans enjekte ana bilgisayar potansiyel olarak toksik şok üzerinden hızlı ölüm önde gelen ana savunma ezici yeteneğine sahip görünür. Ancak, SC5314 sürekli olarak tüm dozda 12 C tarafından takip, en şiddetli zorlanma ve sonra diğer suşların oldu. Böylece, enfeksiyon parametreleri enfeksiyonlar mutlak kinetik üzerinde derin bir etkisi var ama hala göreli virülans tahminleri sağlamak. Bu deneyler içinde ön çalışma daha da iyice Candida hücreleri yıkama önemini gösterdi. Artık YPD enjeksiyon bolus önemli ölçüde dahil larva hayatta kalma (veri gösterilmez) azaltır.
G. mellonella deneyler zaman solucan sağlık önemli bir değişkendir. Standart nakliye kez yazın ortasında kullanarak taşınan larva erken yaş grubundaki veya vurguladı, siyah yamalar ile azalmış canlılık ile kaplı geliyor. Burada açıklanan deneyler kabaca eşdeğer kitle larvaları raporlaması üzerinde duruldu rağmen morbidite larva boyutu için önemli hiçbir rol daha önce gözlenmiştir. Sağlıklı larvalar ve PBS kontrol larvaları her zaman larva canlılığı arasındaki biyolojik çoğaltır ayrı günlerde gerçekleştirilen herhangi bir değişiklik için hesabı için enfeksiyon grupları yanında çalıştırılması gerekir. G. mellonella on gün sonra gelen larvaları hemen aldıktan sonra infekte kinetik eşleşen bulaşmış. Böylece, larva tek sevkiyatı yeterli malzeme ve tam deneyler gerçekleştirmek için zaman sağlar. Genellikle gözlemlenen sonuçları11,27 daha güçlü güven içinde kaynaklanan fare modellerinde kullanılan daha önemli ölçüde daha fazla hayvan virülans farklılıkları belirlemek için zorlanma başına 30 hayvanlar bu deneyler güvenerek , 28. bu model aynı zamanda Etik kaygılar, zaman ve enfeksiyon omurgalı modellerle karşılaştırıldığında maliyeti azaltılmış. Böylece, balmumu larva kullanımı diğer sistemlerde mümkün olduğundan daha küçük etkileri sistemik virülans tanımlaması kolaylaştırabilir.
G. mellonella sistemine doğasında uyarılar ana bilgisayar-patojen etkileşimleri eğitim yararını sınırlayan adlı biri yok. İlk olarak, G. mellonella edinilmiş bağışıklık sistemi yetersizliği ve antigenicity veya olduğu gibi daha yüksek Ökaryotlar29immünolojik bellek araştırmak için kullanılamaz. Larvalar gövdesi tek bir sürekli boşluğu hemolymph ile dolu hangi besin molekülleri, bağışıklık hücreleri ve antimikrobiyal peptidler sinyal, dolaşmaya çalışması oluşur. Bu bağışıklık hücreleri, hemocytes, nötrofiller için benzer şekilde davranır ve bu nedenle phagocytose, oksidatif patlamaları oluşturmak ve etkinleştirme ekstraselüler patojen tanıma reseptörleri30üzerinden takip litik enzimler salgılar. Ancak, bu işlev tüm lökosit faaliyetlerin tam olarak yansıtmayabilir Kordalılar sistemleri içinde doğuştan gelen bağışıklık hücre süreçlerin bir alt kümesidir. Genom Son zamanlarda sıralı31olmasına rağmen başka bir büyük mağara G. mellonella için bir genom derleme olmaması. Sonuç olarak, genotypic çeşitlilik türlerin içinde ölçüde bilinmeyen ve çoğu tedarikçiler muhtemel ölüm deneyler etkileyebilir genetik olarak türdeş olmayan nüfus gemi. Ayrıca, moleküler teknikleri değil organizma için var ve ana bilgisayar katkıları Patogenez incelemek için girişimleri karmaşık hale. Henüz, tutarlı virülans sonuçları, C. albicans ile enfeksiyon üzerinde deneyler aşağıdaki satıcılar, zaman ve labs destekler onların yardımcı programı patojenitesi temel soruları.
MTLbir kaybı C. albicans virülans MTL heterozygotes ve MTLα homozigot arka planlar göre azalır. Bu eğilim sistemik virülans26fare modelleri kullanılarak gerçekleştirilen ön çalışma ile tutarlıdır. Fare modelleri aksine MTLα kaybı virülans MTLbir/α ebeveyn zorlanma göre değişiklik. Bu sonuçlar arasında tutarsızlık belli değil ama omurgasız canlılar arasında eksik edinilmiş bağışıklığın bileşenleri içerebilir. Alternatif olarak, artan virülans MTL heterozygosity ile ilişkili birden fazla zorlanma arka plan üzerinde değerlendirme ihtiyacını potentiating sadece MTLα alleli SC5314 içinde atfedilebilecek olabilir. Bu nedenle, biz iki MTL alelleri arasında virülans için farklı bir rol öneririz.
Genel olarak, G. mellonella modeli sistemik kandidiyazis değerlendirmek için hızlı ve tekrarlanabilir bir model olarak hizmet vermektedir. Diğer dökümanları virülans larva homogenate birimleri (CFUs)11 ya da mantar yerelleştirme32sağlar bioluminescence oluşturan colony için kaplama tarafından mantar yaygınlık dahil bu model ile denetlesinler. Gelecekte, bu model yeni acil olarak yükseltilmiş ilaç direnci gibi diğer Candida türün virülans özelliklerini değerlendirmek için Genişletilebilir Candida auris türler33. Lenfosit G. mellonella Candida, hastalık ile etkileşim içinde görselleştirmek için araçları yolu ile enfeksiyonlar sonuçları ve görselleştirme infektif sürecinin değişkenlik azaltmak için doğuştan waxworm soy sürekli gelişimi muhabir Candida satırları34 daha fazla hastalık bu model iyileştirmek ve in vivo içinde daha derin araştırmalar ana bilgisayar-patojen etkileşimleri izin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar bu çalışmada kullanılmak Galleria mellonella edinmenizde Pamela Washington ve Leah Anderson yardım kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Snackworms.com | Buy twice as many worms as expected to use | |
| 10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe | Hamilton | 80000 | |
| Petri dish, 100X15 mm, 500 pack | Fisher | FB0875712 | |
| Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack | VWR | 87003-294 | |
| Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL | VWR | 97062-818 | |
| Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL | Millipore Sigma | EM-EX0276-1S | |
| autoclaved ddH2O |
References
- Kauffman, C. A., et al. Prospective multicenter surveillance study of funguria in hospitalized patients. The National Institute for Allergy and Infectious Diseases (NIAID) Mycoses Study Group. Clinical Infectious Diseases. 30 (1), 14-18 (2000).
- Horn, D. L., et al. Epidemiology and outcomes of candidemia in 2019 patients: data from the prospective antifungal therapy alliance registry. Clinical Infectious Diseases. 48 (12), 1695-1703 (2009).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clinical Microbiology Reviews. 20 (1), 133-163 (2007).
- Sardi, J. C., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 1 10-24 (2013).
- Segal, E., Frenkel, M. Experimental in Vivo Models of Candidiasis. J Fungi (Basel). 4 (1), (2018).
- Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L. Animal models for candidiasis. Current Protocols in Immunology. 105, 11-17 (2014).
- Heymann, P., et al. The siderophore iron transporter of Candida albicans (Sit1p/Arn1p) mediates uptake of ferrichrome-type siderophores and is required for epithelial invasion. Infection and Immunity. 70 (9), 5246-5255 (2002).
- Priest, S. J., Lorenz, M. C. Characterization of Virulence-Related Phenotypes in Candida Species of the CUG Clade. Eukaryotic Cell. 14 (9), 931-940 (2015).
- Savage, D. C., Dubos, R. J. Localization of indigenous yeast in the murine stomach. J Bacteriol. 94 (6), 1811-1816 (1967).
- Ewbank, J. J., Zugasti, O. C. elegans: model host and tool for antimicrobial drug discovery. Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 300-304 (2011).
- Amorim-Vaz, S., Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. Examining the virulence of Candida albicans transcription factor mutants using Galleria mellonella and mouse infection models. Frontiers in Microbiology. 6, 367 (2015).
- Harding, C. R., Schroeder, G. N., Collins, J. W., Frankel, G. Use of Galleria mellonella as a model organism to study Legionella pneumophila infection. Journal of Visualized Experiments. (81), e50964 (2013).
- Jacobsen, I. D. Galleria mellonella as a model host to study virulence of Candida. Virulence. 5 (2), 237-239 (2014).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
- Hirakawa, M. P., et al. Genetic and phenotypic intra-species variation in Candida albicans. Genome Research. 25 (3), 413-425 (2015).
- Dunn, M. J., Kinney, G. M., Washington, P. M., Berman, J., Anderson, M. Z. Functional diversification accompanies gene family expansion of MED2 homologs in Candida albicans. PLoS Genetics. 14 (4), 1007326 (2018).
- Astvad, K. M. T., Meletiadis, J., Whalley, S., Arendrup, M. C. Fluconazole Pharmacokinetics in Galleria mellonella Larvae and Performance Evaluation of a Bioassay Compared to Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry for Hemolymph Specimens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).
- Mesa-Arango, A. C., et al. The non-mammalian host Galleria mellonella can be used to study the virulence of the fungal pathogen Candida tropicalis and the efficacy of antifungal drugs during infection by this pathogenic yeast. Med Mycol. 51 (5), 461-472 (2013).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Fuchs, B. B., O'Brien, E., Khoury, J. B., Mylonakis, E. Methods for using Galleria mellonella as a model host to study fungal pathogenesis. Virulence. 1 (6), 475-482 (2010).
- Kavanagh, K., Fallon, J. P. Galleria mellonella larvae as models for studying fungal virulence. Fungal Biology Reviews. 24 (1-2), 79-83 (2010).
- Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285 (5431), 1271-1275 (1999).
- Legrand, M., et al. Homozygosity at the MTL locus in clinical strains of Candida albicans: karyotypic rearrangements and tetraploid formation. Molecular Microbiology. 52 (5), 1451-1462 (2004).
- Lockhart, S. R., et al. In Candida albicans, white-opaque switchers are homozygous for mating type. Genetics. 162 (2), 737-745 (2002).
- Miller, M. G., Johnson, A. D. White-opaque switching in Candida albicans is controlled by mating-type locus homeodomain proteins and allows efficient mating. Cell. 110 (3), 293-302 (2002).
- Wu, W., Lockhart, S. R., Pujol, C., Srikantha, T., Soll, D. R. Heterozygosity of genes on the sex chromosome regulates Candida albicans virulence. Molecular Microbiology. 64 (6), 1587-1604 (2007).
- Herrero, A. B., et al. KRE5 gene null mutant strains of Candida albicans are avirulent and have altered cell wall composition and hypha formation properties. Eukaryotic Cell. 3 (6), 1423-1432 (2004).
- Hall, R. A., et al. The Mnn2 mannosyltransferase family modulates mannoprotein fibril length, immune recognition and virulence of Candida albicans. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003276 (2013).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Journal of Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
- Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infection and Immunity. 73 (7), 4161-4170 (2005).
- Lange, A., et al. Genome Sequence of Galleria mellonella (Greater Wax Moth). Genome Announcements. 6 (2), (2018).
- Krappmann, S. Lightning up the worm: How to probe fungal virulence in an alternative mini-host by bioluminescence. Virulence. 6 (8), 727-729 (2015).
- Chowdhary, A., Voss, A., Meis, J. F. Multidrug-resistant Candida auris: 'new kid on the block' in hospital-associated infections. Journal of Hospital Infection. 94 (3), 209-212 (2016).
- Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. Adaptation of a Gaussia princeps Luciferase reporter system in Candida albicans for in vivo detection in the Galleria mellonella infection model. Virulence. 6 (7), 684-693 (2015).
