Summary
Barciak fungerer som en hvirvelløse model for formidlet candidiasis. Her, vi detalje infektionen protokol og give understøttende data for modellens effektivitet.
Abstract
Candida arter er fælles svampe latente af mennesker koloniserer huden, slimhindeinfektioner og mave-tarmkanalen. Under visse betingelser, Candida kan vokse hen over deres naturlige nicher resulterer i invaliderende slimhinde infektioner som godt som livstruende systemiske infektioner, som er en stor fokus i undersøgelsen på grund af deres tilknyttede høj dødelighed. Dyremodeller for formidlet infektion findes for at studere sygdomsprogression og dissekere Karakteristik af Candida sygdomsfremkaldende evne. Af disse giver barciak waxworm infektion model en omkostningseffektiv eksperimentelle værktøj for høj overførselshastighed undersøgelser af systemisk virulens. Mange andre bakterier og eukaryote smitsomme agenser er blevet effektivt studeret i G. mellonella at forstå sygdomsfremkaldende evne, hvilket gør det et bredt accepterede modelsystem. Endnu, variation i metoden bruges til at inficere G. mellonella kan ændre fænotypiske resultater og komplicere fortolkningen af resultaterne. Her, redegøre vi for de fordele og ulemper ved waxworm modellen til at studere systemisk Candida patogenese og detaljeret en tilgang til at forbedre reproducerbarhed. Vores resultater fremhæve vifte af dødelighed kinetik i G. mellonella og beskrive de variabler, som kan modulere disse kinetik. I sidste ende, denne metode står som en etisk, hurtig og omkostningseffektiv tilgang til at studere virulens i en model af dissemineret candidiasis.
Introduction
Candida arter er fælles menneskelige latente, der kan opstå som opportunistiske patogener i alvorligt immunkompromitterede og dysbiotic patienter. Selv om mange Candida arter kan forårsage sygdom, er C. albicans den mest udbredte årsag til dissemineret candidiasis1,2. Systemisk sygdom skyldes C. albicans adgang til blodbanen gennem enten direkte penetration af tidligere restriktive vært barrierer eller Introduktion på kirurgisk sites og andre overtrædelser af kroppen3. Candida arter udnytte en række sygdomsfremkaldende processer til at forårsage systemiske sygdomme inden for den vært, herunder filamentation, Biofilmdannelse, immun celle skatteunddragelse og flygte og jern scavenging4. In vitro metoder eksisterer for at undersøge individuelle patogene mekanismer, men dyremodeller fortsætte med at give den bedste mulighed for at undersøge helhed af sygdom resultatet5,6. Tidligere forskning har detaljerede mange forekomster af lovende in vitro- undersøgelser af virulens ikke at gengive i vivo7,8. Således dyremodeller er stadig forpligtet til at vurdere virulens in vivo. De fleste sygdomsmodeller stole på mus til at tjene som et surrogat for menneskelige infektioner trods C. albicans manglende evne til naturligt kolonisere murine systemer som en commensal9. Hvirvelløse modeller af dissemineret candidiasis omfatter nematode Caenorhabditis elegans, frugt flyver Drosophila melanogasterog waxworm barciak, selv om bekymringer om grundlæggende forskelle i grundlæggende fysiologi, har vært krop temperaturer og eksponeringsveje hæmmet deres bred accept10,11.
Senest har er G. mellonella waxworm infektion model blevet vedtaget til model sygdomsfremkaldende evne af en bred vifte af bakterier og svampe patogener12,13,14. Fordelene ved denne model omfatter dens relativt lave omkostninger, øget overførselshastighed, brugervenlighed og reduceret etiske bekymringer med hensyn til dyrs godgørenhed sammenlignet med murine modeller. For forskere, dette udmønter sig i øget evne til at teste flere variabler, stærkere konfidensintervaller, hurtigere eksperimenter og bypass af animalske protokoller. G. mellonella har fungeret som en platform til hurtigt at vurdere C. albicans virulens efter undertrykkelse af netbårne af gener, der kræves for biofilm dannelse, filamentation og gen regulering på tværs af kliniske isolater11,15 ,16. Nylige undersøgelser har indarbejdet undersøgelse af svampedræbende effekt ved hjælp af G. mellonella at vurdere farmakokinetik drug aktivitet og modstand under i vivo indstillinger, der er ellers udfordrende og tidskrævende 17,18. Endnu, undersøgelser af C. albicans virulens i G. mellonella har været kompliceret af efter sigende høje niveauer af variation inden for eksperimenter og inkonsekvent protokoller mellem forskergrupper, der producerer forskellige virulens fænotyper mellem mus og waxworms11,13,19,20,21. Her, skitsere vi en G. mellonella protokol for at standardisere C. albicans infektioner, stigning reproducerbarhed i virulens eksperimenter, og at påvise sammenhængen med tidligere beskrevne undersøgelser af virulens i murine modeller.
Tidligere undersøgelser viste, at C. albicans parring type-lignende (MTL) locus på kromosom 5 regulerer celle identitet og parring kompetence svarende til Saccharomyces cerevisiae og andre Ascomycete svampe22. Fleste af C. albicans isolater er heterozygous på locus MTL kodning en af hver af MTLen og MTLα alleler (MTLen/α), og er derfor steril15, 23 , 24. tab af en af MTL alleler gennem tab af heterozygositet (LOH) eller mutation fører til homozygot MTLen eller MTLα stammer, der kan undergå en fænotypiske switch fra sterile 'hvide' staten til den parring kompetente 'opaque' stat25. Tidligere arbejde har fremhævet, at tab af MTL heterozogycitet også reducerer virulens i murine modeller af systemisk infektion på tværs af forskellige stamme baggrunde26. Her, detalje vi G. mellonella model for formidlet candidiasis ved hjælp af en genetisk lignende eksperimentelle sæt for at skildre bidrag af MTL heterozogycitet til virulens i G. mellonella. Vi viser at MTL konfiguration påvirket C. albicans patogenicitet, hvor MTLα stammer var mindre virulente både MTLen/α og MTLen celler, svarende til resultater inden for murine infektion model26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoderne er afhængige af brugen af hvirvelløse værter og kræver ikke institutionelle Animal Care og bruge udvalg (IACUC) godkendelse.
1. barciak Waxworm larver
- Bestil larver fra grossister og leverandører, der ikke indfører hormoner, antibiotika eller andre behandlinger, at larverne og som er i stand til at sende og levere levende enheder.
- Sørg for at købe alle larver fra den samme leverandør i løbet af eksperimenter. Være forsigtig, når du bestiller larver i sommermånederne som temperaturer over 30 ° C nedsætte larver levedygtighed.
- Overvåge temperaturer på tværs af den forventede rute og planlægger forsendelse og levering i overensstemmelse hermed eller vælge fremskyndet shipping at minimere deres eksponering for miljøforhold.
- Når larverne ankommer, tjekke hver beholder for at sikre levedygtige, sunde larver er til stede. Sunde larver vil være fuldstændig neddykket under sengetøj, flytning, og besidde en lys gul/tan farvning med par larver der indeholder sorte mærker eller misfarvninger langs kroppen.
- Gemme larver i deres container i et ventileret rum ved stuetemperatur (25 ° C). Afhængigt af den oprindelige tilstand af larverne, kan de bruges i op til to uger.
2. kultur forberedelse til barciak infektion
Bemærk: Ordentlig lab påklædning bør bæres i hele denne del af protokollen herunder handsker, laboratoriekittel og sikkerhedsbriller.
- Gør gær pepton dextrose (YPD) væske og agar plader. Forberede 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og 70% ethanol løsninger.
- Vokse C. albicans stammer skal injiceres natten over i 3 mL frisk YPD i standard kultur rør på en roterende tromle på medium hastighed og 30 ° C.
- Spin celler ned på 2.500 x g i 5 min i en bordplade centrifuge. Hæld supernatanten, være omhyggelig med ikke at forstyrre den celle pellet.
- Resuspend celler fuldt ud i 5 mL 1 x PBS ved gentagen pipettering eller vortexing. Gentag centrifugering og resuspension af celler i PBS to gange mere at sikre fjernelse af alle medier.
- Efter en sidste vask, resuspend celler i 1 mL PBS og overføre dem til et microcentrifuge rør.
- Gennemføre et sæt af serielle fortyndinger i PBS til at generere en 1: 100, 1:1, 000, og 1:100,000 fortyndingsrække.
Bemærk: Alternative fortyndinger kan være nødvendigt at nå ønskede celletal.- Ved hjælp af en hemocytometer, tælle celler fra enten 1: 100 eller 1:1,000 fortynding. Oftest, giver 1:1,000 fortyndingen den relevante celle tæller for C. albicans kulturer.
- Beregne total koncentration af celler i den oprindelige kultur ved hjælp af gitteret matematik af hemocytometer, satsning nemlig mellem 30-300 celler skal optælles i den centrale 5 x 5-gitter. En automatiseret celle counter kan bruges som en alternativ; anvendelse af optiske tæthed til at bestemme celletal frarådes som celle morfologi (størrelse, form, etc.) kan dog betydeligt påvirke dets nøjagtighed.
- Brug de målte celletal, lave en ny fortynding af 2.5x107 celler/mL i 1 x PBS i et microcentrifuge rør. Denne fortynding vil tjene som grundlag for hver podning af G. mellonella med C. albicans. Hver injektion vil kræve 10 µL af denne inokulum for en smitsom dosis af 250.000 C. albicans celler.
- Bekræfte nøjagtigheden af den infektiøse dosis af plating den korrekte volumen af 1:100,000 fortynding for 100 koloni danner enheder (CFUs) på YPD agar for hver kultur skal anvendes i infektion.
- Inkuber celle count plader fra trin 2.7 i 48 timer (h) ved 30 ° C og tælle antallet af kolonier pr. plade. Mellem 80 og 120 kolonier udgør et acceptabelt interval for nøjagtighed i inokulat.
3. infektion af barciak larver med Candida kulturer
Bemærk: Ordentlig lab påklædning bør bæres i hele denne del af protokollen herunder handsker, laboratoriekittel og sikkerhedsbriller.
- Der tilsættes 1 mL 100% ethanol og 1 mL af 1 x PBS til to separate microcentrifuge rør. Ethanol og PBS vil blive brugt til at vaske injektion nålen mellem infektioner.
- Sprede en lille mængde af waxworm sengetøj i en tom, 100 x 15 mm steril petriskål, som vil huse larverne efter podning for hver uafhængig stamme. Tilsætning af strøelse begrænser overholdelse af døde G. mellonella larver petriskål overflade.
- Sterilisere et 26 G, 10 µL sprøjten ved at tage og expunging 10 µL af 70% ethanol tre gange efterfulgt af tre vasker med 10 µL 1 x PBS. Vortex podning fortynding af C. albicans og tage op 10 µL af kultur. Sikre, at der er ingen luftbobler i sprøjten som injektion af luft fremmer død og vil komplicere downstream analyse.
- Åbner en beholder holding G. mellonella larver og omhyggeligt slå sengetøj over med en finger til at afdække larver. Vælg larver, som i godt helbred som identificeret af aktiv bevægelse, en lys gul/tan farve og en mangel på sort pigmentering på selve larver. Disse larver fastsættes af samme størrelse på tværs af den fulde eksperimentelle.
- Afhente en enkelt larver og hold det forsigtigt mellem indeks/midterste finger og tommelfinger ligner holding en blyant. Roll larver på sin ryg, så benene står. Hold den fulde længde af kroppen mellem fingre og tommelfinger, så larverne er i stand til at krølle eller trække væk fra injektion.
Bemærk: Hvis det ønskes, sterilisere injektionsstedet ved hjælp af en vatpind dyppet i 100% ethanol. - Rotere sprøjten, så den nål facet ansigter og langsomt indsætte nålen spidsen herunder længden af facet ind i kroppen på krydset med den bageste venstre ben. Sikre at nålen trænger ind i kroppen og ikke blot skubbe kroppen af larver indad. Brug ikke kraft i at trænge ind i kroppen som nålen kan gennembore helt gennem larverne hurtigt. Forsigtigt løfte med nålen vil bekræfte passende penetration. Injicere fuld 10 µL Candida inokulum og udtrække nålen.
- Gentag trin 3.3-3.5 for hver larver. At forhindre cell afregning, vortex Candida kulturer til podning efter hver tredje indsprøjtning. Som et kontrolelement, skal du injicere et sæt af G. mellonella med 10 µL 1 X PBS.
- Co hus 10 larver injiceres fra samme Candida kultur i hver 100 x 15 mm petriskål efter podning. Inkuber larver ved 37 ° C i otte dage, kontrol larver hver 24 timer for at overvåge død.
- Vurdere dødelighed i første omgang af mørkelagt pigmentering, dannelsen af sorte pletter eller organer, og mangel på bevægelse. For at bekræfte dødelighed, skal du bruge pincet til at forsigtigt rulle døende larver på deres ryg og let stikke den larver undersiden med pincet. Non-lydhørhed konstateret ved en mangel på synlig krop eller ben bevægelse er scoret som død og larverne er fjernet fra petriskålen.
- Optage larver dødelighed over tid kurset. Larver, der begynder at forpupper i møl kan indgå i analysen, men bør fjernes, hvis de begynder at molt. Pupating larver kan censureret fra slutpunktet analyse, som virulens forskelle mellem larver og puppe er uklart.
- Vurdere Statistisk signifikans brug Mantel-Cox statistiske test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her viser vi en reproducerbar metode for anvendelse af G. mellonella waxworms til at undersøge en formidlet candidiasis model af infektion med C. albicans. Passende opbevaring, vedligeholdelse og udvalg af larver for infektion er kritisk komponent af forsikring reproducerbarhed i G. mellonella dødelighed (fig. 1A). Sunde larver, der er aktive, har en lys gul/tan farve, og manglende sorte pletter på kroppen bør anvendes til dette system og er typisk rentabelt for infektion op til to uger efter ankomsten. For at minimere enhver potentielt forstyrrende virkninger af G. mellonella fysiologi, var larver valgt af lignende størrelse og vægt. Et godt blandet inokulum og konsekvent injektion på samme anatomiske site af larver kroppen også stå som vigtige variabler for at fremme reproducerbarhed mellem eksperimenter. Billeder fremvise vedligeholdelse af inficerede larver gennem varigheden af eksperimenter (figur 1B).
For at vurdere virkningen af larver alder på virulens, blev separat PBS kontrol infektioner udført med larver enten nul eller ti dage efter ankomsten. Ingen signifikant forskel i kinetik af G. mellonella død eksisterede mellem disse grupper (fig. 2A). Karakteristiske tegn på sygdom opstået i larver fra begge grupper, der bukkede under for infektion; Oprindeligt gul/tan farvelægningen af larverne blev misfarvet og banede vejen for sorte pletter før samlede tab af motilitet og i sidste ende, død (figur 2B). Infektion med C. albicans fremskynder denne proces af misfarvning og sygelighed, men ændrer ikke væsentligt kaskade af fænotypiske markører fører til døden i forhold til ikke-inficerede larver eller PBS injiceres larver (figur 2C).
Den infektiøse dosis påvirker også i høj grad dødelighed kinetik af G. mellonella infektioner. For at vurdere virkningerne af C. albicans inokulum størrelse, vi smittet G. mellonella med fire forskellige kliniske isolater (12 C, P60002, P75010 og SC5314: tabel 1) på tre forskellige doser. Larverne inficeret med SC5314 vises dødelighed på alle doser, i overensstemmelse med øget patogenicitet denne isolat i forhold til de fleste andre bruges i eksperimentet (figur 2D). Flere larver bukket under for infektion med 1,0 x 105 SC5314 eller 12 C celler i forhold til 1,0 x 104 celler. Den højeste dosis på 1,0 x 106 celler viste sig alt for dødbringende med larverne dør efter infektion for alle stammer, herunder de mindre virulente isolater, P60002 og 12 C. Larverne injiceres med P75010 og SC5314 bukkede under for infektion inden for 24 timer, hvilket tyder på en mere moderat infektiøse dosis er passende at fastslå forskelle i virulens. Derfor, en smitsom dosis af 2.5x105 blev brugt til alle efterfølgende forsøg.
For at påvise ligheden i virulens mellem murine og G. mellonella modeller af systemisk sygdom, vi analyseret virulens i SC5314-afledte C. albicans stammer kodning enten heterozygous (en/α eller homozygot (en/eller Α /-) MTL loci. Infektion af G. mellonella med MTL heterozygote fra enten SC5314 eller dens prototrophic afledte BWP17 genetiske baggrund produceret høje dødelighed i forhold til PBS-indsprøjtning dyr. Tre fjerdedele af kontrol larver overlevede til dag 8 i forhold til tab af over halvdelen af alle C. albicans injiceres dyr inden 3 dage efter infektion (dpi), yderligere forøget ved 8 dpi (fig. 3A, 3B). Infektion med BWP17 dæmpet C. albicans dødelighed i denne model (27% overlevelse sammenlignet med 4% overlevelse i SC5314 MTL heterozygote på 8 dpi; Figur 3 C, 3D). G. mellonella larver inficeret med MTLα /-stammer, der overlevede betydeligt længere i forhold til MTL heterozygous forældrenes stammer (log-rank test, SC5314, p = 0.0006, BWP17; p = 0.0002). Interessant, matchede virulens MTLen/-C. albicans celler modstykket MTL heterozygous i både SC5314 og BWP17 baggrunde. Således har MTL konfiguration en indflydelse på C. albicans virulens med MTLα /-stammer viser nedsat drab i forhold til enten MTLen/α eller MTLen/-celler.
Figur 1 . Oversigt over infektion procedure. (A) et rutediagram fremhæver de centrale elementer i proceduren infektion, herunder bestilling og opbevaring af larver infektion kultur forberedelse og injektion. (B) repræsentative billeder viser sund opbevaringsbetingelser, forberedelse af infektion plads, injektion og larver vedligeholdelse efter infektion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Virkningerne af G. mellonella infektion procedurer. (A) PBS kontrol blev smittet enten straks efter ankomsten (PBS-D0, blå) eller efter 10 dage (PBS-D10, røde). (B) repræsentative billeder fremhæve larver misfarvning og død. (C) en billed serie af infektion plader detaljer virkningerne af injektion med PBS (midten) eller med SC5314 (lavere) i forhold til ikke-inficerede larver (øverst) på dag 1, 3, 5 og 7 efter injektion. (D) dosering effekter er vist inden for en samling af kliniske isolater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . MTLen allel fremmer C. albicans drab af G. mellonella. MTL locus heterozygous (en/α) og homozygot (en/- og α /-) SC5314 (A) og BWP17 (C) derivater er afbildet for larver dødelighed over otte dage. Konfidensintervaller afbildes for hver SC5314 (B) og BWP17 (D) afledte stamme at fremhæve sammenhængen i kinetik af larver dødelighed på tværs af eksperimenter. Gennemsnit (solid line) er afbildet med standardafvigelser (fyldt i rummet) for tre biologiske replikater af 10 larver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Candida stamme | Forældrenes stamme | Genotype | MTL | Reference |
| MAY1 | SC5314 | Candida albicans klinisk isolere | a/α | Wu et al. 2007 |
| MAY6 | P60002 | Candida albicans klinisk isolere | en/et | Wu et al. 2007 |
| MAY11 | P75010 | Candida albicans klinisk isolere | a/α | Wu et al. 2007 |
| MAY15 | 12C | Candida albicans klinisk isolere | en/et | Wu et al. 2007 |
| MAY61 | SC5314 | MTLa:: SAT1 | Α /- | Denne undersøgelse |
| MAY71 | SC5314 | MTLα:: SAT1S tac1::TAC1-normal god landbrugspraksis-HYGR | en /- | Denne undersøgelse |
| MAY313 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-arg4-ura3-BN sir2::his1/sir2::dpl200 | a/α | Denne undersøgelse |
| MAY314 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-BN sir2::HIS1/sir2::dpl200 | Α /- | Denne undersøgelse |
| MAY315 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-BN sir2::HIS1/sir2::dpl200 | en /- | Denne undersøgelse |
Bord 1. C. albicans stog anvendes i denne undersøgelse.
| Variable komponent | Foreslåede kontrol | Reference |
| Larverne alder ved tidspunktet for indsprøjtning | Minimer tid mellem orm ankomst og podning | Denne undersøgelse |
| Larverne størrelse på tidspunktet for indsprøjtning | Sikre sammenhæng, når du vælger orme | Fuchs et al. 2010 |
| Larverne sundhed på tidspunktet for indsprøjtning | Bestille orme under moderat temperatur, brug straks ved ankomsten | Denne undersøgelse |
| Infektiøse dosis med C. albicans | Vælg en infektiøs koncentration, som præsenterer bredeste sortiment af resultater | Denne undersøgelse |
| Larverne svar til injektion | Gennemføre PBS injektion kontrol sammen med orme med ingen injektion | Hirakawa et al. 2015 |
Tabel 2. Overvejelser med hensyn til G. mellonella infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
G. mellonella waxworm model står som et effektivt redskab til hurtig og reproducerbare analyse af C. albicans virulens. Denne detaljerede protokollen er afhængig af ensartet levering af en defineret infektiøse dosis til det samme sted på tværs af en batch af larver. Infektiøse dosis har en dybtgående indvirkning på G. mellonella dødelighed, mens brugen af larverne mellem deres indledende ankomst og ti dage efter modtagelsen givet lignende resultater. Tab af C. albicansMTLen -allel resulterer i nedsat virulens i overensstemmelse med tidligere forsøg i mus selv om afbrydelse af MTLα allel ikke ændrede larver død.
Resultatet af G. mellonella infektioner kan blive betydeligt påvirket af den eksperimentelle design. I modsætning til hvirveldyr modeller af infektion, kan lille variation i injektionsstedet, inokulum volumen og inokulum størrelse påvirke fortolkninger af dataene. Infektioner med stigende antal af C. albicans celler førte til større og hurtigere sygelighed af inficerede larver. På et tidspunkt vises indsprøjtning for mange C. albicans i stand til af overvældende vært forsvar fører til hurtig død af værten, eventuelt gennem giftig shock. SC5314 var imidlertid konsekvent den mest ondskabsfulde tone på alle doser, efterfulgt af 12C, og derefter de andre stammer. Således infektion parametre har en dybtgående indvirkning på den absolutte kinetik af infektioner, men kan stadig give et skøn over relativ virulens. Forudgående arbejde inden for disse eksperimenter viste yderligere betydningen af grundigt vaske Candida celler. Resterende YPD inkluderet i injektion bolus betydeligt reducerer larver overlevelse (data ikke vist).
Ormen sundhed er en kritisk variabel når gennemføre G. mellonella eksperimenter. Larverne transporteres ved hjælp af standard fragt i midten af sommeren ofte ankommer tidligt i alderen eller stresset, dækket med sorte pletter, med nedsat levedygtighed. Ingen væsentlig rolle for larver størrelse på sygelighed er observeret tidligere, selv om eksperimenter beskrevet her fokuseret på boltpistoler larver af nogenlunde tilsvarende masse. Sunde larver og PBS kontrol larver bør altid køres sammen med infektion grupper at tage højde for eventuelle ændringer i larver levedygtighed mellem biologiske replikater udført på forskellige dage. G. mellonella inficeret ti dage efter ankommer matchede kinetik af larver inficeret straks ved modtagelsen. Således, en enkelt overførsel af larver kan give tilstrækkelig materiale og tid til at udføre fulde eksperimenter. Disse eksperimenter kan påberåbes 30 dyr pr. stamme til at bestemme forskelle i virulens, der er betydeligt flere dyr end typisk udnyttes i murine modeller, hvilket resulterer i stærkere tillid af observerede resultater11,27 , 28. denne model også reduceret etiske bekymringer, tid og omkostninger i forhold til hvirveldyr modeller af infektion. Således kan brug af voks larver lette identifikation af mindre effekter på systemisk virulens end det er muligt i andre systemer.
Iboende forbehold til G. mellonella system findes der begrænser dens nytte i at studere vært-patogen interaktioner. Først, G. mellonella mangler en adaptive immunsystem og kan ikke bruges til at undersøge antigenicity eller immunologisk hukommelse som højere eukaryoter29. Kroppen af larverne er sammensat af en enkelt kontinuerlig hulrum fyldt med hemolymph, som funktion for at cirkulere næringsstoffer, signalering molekyler, immunceller og antimikrobielle peptider. Disse immunceller, hemocytes, kan opfører sig på samme måde til neutrofile og derfor phagocytosis, generere oxidative byger og udskiller lytisk enzymer efter aktivering via ekstracellulære patogen anerkendelse receptorer30. Men denne funktion er en delmængde af medfødte immun celle processer inden for chordate-systemer, der ikke muligvis fuldt ud afspejler alle leukocyt aktiviteter. En anden vigtig advarsel er manglen på en genom forsamling for G. mellonella selvom genomet blev for nylig sekventeret31. Derfor, omfanget af genotypiske mangfoldighed indenfor arterne er ukendt og de fleste leverandører sandsynligvis skib genetisk heterogene befolkninger, der kan påvirke dødeligheden på tværs af eksperimenter. Derudover molekylærbiologiske teknikker ikke findes for organismen og komplicere ethvert forsøg på at dissekere vært bidrag til patogenesen. Endnu, konsekvent virulens resultater efter infektion med C. albicans på tværs af eksperimenter, leverandører, tid og labs understøtter deres nytte i grundlæggende spørgsmål sygdomsfremkaldende.
Tab af MTLen reduceret virulens af C. albicans MTL heterozygote og MTLα homozygote baggrunde. Denne tendens er i overensstemmelse med forudgående arbejde udføres ved hjælp af musen modeller af systemisk virulens26. I modsætning til murine modeller ændrede tab af MTLα ikke virulens i forhold til den MTLen/α forældrenes stamme. Uoverensstemmelse mellem disse resultater er uklart, men kan omfatte komponenter af adaptive immunitet, der mangler i hvirvelløse organismer. Alternativt kan øget virulens tilknyttet MTL heterozogycitet henføres kun til MTLα allel i SC5314, forstærket behovet for en vurdering på tværs af flere stamme baggrunde. Derfor foreslår vi en differentieret rolle for virulens mellem de to MTL alleler.
Samlet set fungerer G. mellonella model som en hurtig og reproducerbare model til vurdering af systemisk candidiasis. Andre udlæsninger af virulens kan analyseres med denne model, herunder svampe forekomsten af plating larver homogenatet for kolonidannende enheder (CFUs)11 eller bioluminescens, som også giver svampe lokalisering32. I fremtiden, denne model kan udvides til at vurdere virulens Karakteristik af andre Candida arter såsom forhøjet resistens i de nyligt emergent Candida auris arter33. Fortsatte udvikling af værktøjer til at visualisere lymfocyt inden for G. mellonella interagere med inficerer Candida, indavlede waxworm lineages at reducere variation i infektioner resultater og visualisering af de infektiøst proces via reporter Candida linjer34 vil yderligere forfine denne model af sygdom og give dybere undersøgelser in vivo vært-patogen interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende bistand af Pamela Washington og Leah Anderson at opnå barciak til brug i denne undersøgelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Snackworms.com | Buy twice as many worms as expected to use | |
| 10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe | Hamilton | 80000 | |
| Petri dish, 100X15 mm, 500 pack | Fisher | FB0875712 | |
| Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack | VWR | 87003-294 | |
| Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL | VWR | 97062-818 | |
| Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL | Millipore Sigma | EM-EX0276-1S | |
| autoclaved ddH2O |
References
- Kauffman, C. A., et al. Prospective multicenter surveillance study of funguria in hospitalized patients. The National Institute for Allergy and Infectious Diseases (NIAID) Mycoses Study Group. Clinical Infectious Diseases. 30 (1), 14-18 (2000).
- Horn, D. L., et al. Epidemiology and outcomes of candidemia in 2019 patients: data from the prospective antifungal therapy alliance registry. Clinical Infectious Diseases. 48 (12), 1695-1703 (2009).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clinical Microbiology Reviews. 20 (1), 133-163 (2007).
- Sardi, J. C., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 1 10-24 (2013).
- Segal, E., Frenkel, M. Experimental in Vivo Models of Candidiasis. J Fungi (Basel). 4 (1), (2018).
- Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L. Animal models for candidiasis. Current Protocols in Immunology. 105, 11-17 (2014).
- Heymann, P., et al. The siderophore iron transporter of Candida albicans (Sit1p/Arn1p) mediates uptake of ferrichrome-type siderophores and is required for epithelial invasion. Infection and Immunity. 70 (9), 5246-5255 (2002).
- Priest, S. J., Lorenz, M. C. Characterization of Virulence-Related Phenotypes in Candida Species of the CUG Clade. Eukaryotic Cell. 14 (9), 931-940 (2015).
- Savage, D. C., Dubos, R. J. Localization of indigenous yeast in the murine stomach. J Bacteriol. 94 (6), 1811-1816 (1967).
- Ewbank, J. J., Zugasti, O. C. elegans: model host and tool for antimicrobial drug discovery. Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 300-304 (2011).
- Amorim-Vaz, S., Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. Examining the virulence of Candida albicans transcription factor mutants using Galleria mellonella and mouse infection models. Frontiers in Microbiology. 6, 367 (2015).
- Harding, C. R., Schroeder, G. N., Collins, J. W., Frankel, G. Use of Galleria mellonella as a model organism to study Legionella pneumophila infection. Journal of Visualized Experiments. (81), e50964 (2013).
- Jacobsen, I. D. Galleria mellonella as a model host to study virulence of Candida. Virulence. 5 (2), 237-239 (2014).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
- Hirakawa, M. P., et al. Genetic and phenotypic intra-species variation in Candida albicans. Genome Research. 25 (3), 413-425 (2015).
- Dunn, M. J., Kinney, G. M., Washington, P. M., Berman, J., Anderson, M. Z. Functional diversification accompanies gene family expansion of MED2 homologs in Candida albicans. PLoS Genetics. 14 (4), 1007326 (2018).
- Astvad, K. M. T., Meletiadis, J., Whalley, S., Arendrup, M. C. Fluconazole Pharmacokinetics in Galleria mellonella Larvae and Performance Evaluation of a Bioassay Compared to Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry for Hemolymph Specimens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).
- Mesa-Arango, A. C., et al. The non-mammalian host Galleria mellonella can be used to study the virulence of the fungal pathogen Candida tropicalis and the efficacy of antifungal drugs during infection by this pathogenic yeast. Med Mycol. 51 (5), 461-472 (2013).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Fuchs, B. B., O'Brien, E., Khoury, J. B., Mylonakis, E. Methods for using Galleria mellonella as a model host to study fungal pathogenesis. Virulence. 1 (6), 475-482 (2010).
- Kavanagh, K., Fallon, J. P. Galleria mellonella larvae as models for studying fungal virulence. Fungal Biology Reviews. 24 (1-2), 79-83 (2010).
- Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285 (5431), 1271-1275 (1999).
- Legrand, M., et al. Homozygosity at the MTL locus in clinical strains of Candida albicans: karyotypic rearrangements and tetraploid formation. Molecular Microbiology. 52 (5), 1451-1462 (2004).
- Lockhart, S. R., et al. In Candida albicans, white-opaque switchers are homozygous for mating type. Genetics. 162 (2), 737-745 (2002).
- Miller, M. G., Johnson, A. D. White-opaque switching in Candida albicans is controlled by mating-type locus homeodomain proteins and allows efficient mating. Cell. 110 (3), 293-302 (2002).
- Wu, W., Lockhart, S. R., Pujol, C., Srikantha, T., Soll, D. R. Heterozygosity of genes on the sex chromosome regulates Candida albicans virulence. Molecular Microbiology. 64 (6), 1587-1604 (2007).
- Herrero, A. B., et al. KRE5 gene null mutant strains of Candida albicans are avirulent and have altered cell wall composition and hypha formation properties. Eukaryotic Cell. 3 (6), 1423-1432 (2004).
- Hall, R. A., et al. The Mnn2 mannosyltransferase family modulates mannoprotein fibril length, immune recognition and virulence of Candida albicans. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003276 (2013).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Journal of Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
- Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infection and Immunity. 73 (7), 4161-4170 (2005).
- Lange, A., et al. Genome Sequence of Galleria mellonella (Greater Wax Moth). Genome Announcements. 6 (2), (2018).
- Krappmann, S. Lightning up the worm: How to probe fungal virulence in an alternative mini-host by bioluminescence. Virulence. 6 (8), 727-729 (2015).
- Chowdhary, A., Voss, A., Meis, J. F. Multidrug-resistant Candida auris: 'new kid on the block' in hospital-associated infections. Journal of Hospital Infection. 94 (3), 209-212 (2016).
- Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. Adaptation of a Gaussia princeps Luciferase reporter system in Candida albicans for in vivo detection in the Galleria mellonella infection model. Virulence. 6 (7), 684-693 (2015).
