Summary
Wasmot fungeert als een ongewervelde model voor gedissemineerde candidiasis. Hier, we detail de infectie protocol en ondersteunende gegevens verstrekken voor de effectiviteit van het model.
Abstract
Candida -soorten zijn gemeenschappelijk schimmels commensals van de mens, de huid, de mucosal oppervlakken, en de maag-darmkanaal te koloniseren. Onder bepaalde voorwaarden, kan Candida hun natuurlijke gebieden resulterend in slopende mucosal infecties als goed als levensbedreigende systemische infecties, die een belangrijk aandachtspunt van onderzoek als gevolg van hun bijbehorende hoge sterftecijfers zijn overwoekeren. Dierlijke modellen van gedissemineerde infectie bestaan voor bestuderen van progressie van de ziekte en de ontrafeling van de kenmerken van Candida pathogeniteit. Van deze biedt de wasmot waxworm infectie model een kosteneffectieve experimentele rol voor high-throughput onderzoek van systemische virulentie. Vele andere bacteriële en eukaryote infectieuze agentia zijn effectief bestudeerd in G. mellonella te begrijpen van de pathogeniteit, waardoor het een algemeen aanvaarde modelsysteem. Variatie in de methode gebruikt voor het infecteren van G. mellonella kan echter veranderen van fenotypische resultaten en interpretatie van de resultaten bemoeilijken. We schetsen hier, de voordelen en nadelen van het model van de waxworm te bestuderen van systemische Candida pathogenese en een aanpak ter verbetering van de reproduceerbaarheid in detail te beschrijven. Onze resultaten wijzen op het bereik van sterfte kinetiek in G. mellonella en beschrijven van de variabelen die deze kinetiek moduleren kunnen. Deze methode staat uiteindelijk, als een ethische, snelle en kosteneffectieve benadering bestuderen de virulentie in een model van gedissemineerde candidiasis.
Introduction
Candida -soorten zijn gemeenschappelijke menselijke commensals die kunnen ontpopt zich als een opportunistische pathogenen in ernstig immuungecompromitteerde en dysbiotic patiënten. Hoewel veel Candida -soorten, leiden ziekte tot kan, is C. albicans de meest voorkomende oorzaak van gedissemineerde candidiasis1,2. Systemische ziekten voortvloeit uit C. albicans toegang tot de bloedbaan via beide rechtstreekse penetratie van eerder restrictief host belemmeringen of introductie op chirurgische sites en andere inbreuken op het lichaam3. Candida -soorten maken gebruik van een aantal pathogene processen veroorzaken systemische ziekten binnen de host met inbegrip van filamentation, vorming van biofilms, immuun cel belastingontduiking en ontsnappen, en ijzer opruiming4. In vitro methoden bestaan om te onderzoeken van individuele pathogene mechanismen, maar dierlijke modellen blijven met de beste optie om te onderzoeken van het geheel van5,6van de uitkomst van de ziekte. Eerder onderzoek heeft veel exemplaren van veelbelovende in vitro onderzoeken van virulentie bij gebreke te reproduceren in vivo7,8gedetailleerd. Dus, dierlijke modellen zijn nog steeds vereist om te beoordelen van virulentie in vivo. De meeste modellen van de ziekte, is afhankelijk van muizen om te dienen als een surrogaat voor menselijke infecties ondanks C. albicans onvermogen om te koloniseren natuurlijk lymfkliertest systemen als een commensale9. Ongewervelde modellen van gedissemineerde candidiasis omvatten de nematode Caenorhabditis elegans, de vrucht vliegen Drosophila melanogaster, en de waxworm wasmot, hoewel bezorgdheid over fundamentele verschillen in de basis fysiologie, hebben host lichaam temperaturen en blootstellingswegen belemmerd hun brede acceptatie10,11.
Recentelijk is de G. mellonella waxworm infectie model overgenomen aan model pathogeniteit van een breed scala van bacteriële en schimmelinfecties ziekteverwekkers12,13,14. Voordelen van dit model zijn relatief lage kosten, hogere doorvoer opnemen, gebruiksgemak en verminderde ethische bezwaren met betrekking tot dierlijke weldadigheid ten opzichte van lymfkliertest modellen. Voor onderzoekers vertaalt dit in meer mogelijkheden voor het testen van meerdere variabelen, sterkere betrouwbaarheidsintervallen, snellere experimenten en bypass van dierlijke protocollen. G. mellonella heeft gediend als een platform voor het snel beoordelen C. albicans virulentie na verstoring van genen die vereist is voor de biofilm vorming, filamentation en gene verordening via klinische isolaten11,15 ,16. Recente studies hebben opgenomen onderzoek van antischimmel werkzaamheid met behulp van G. mellonella te beoordelen van de farmacokinetiek van drug activiteit en weerstand onder in vivo instellingen die anders uitdagend en tijdrovend 17,18. Nog, hebben studies van C. albicans virulentie in G. mellonella is bemoeilijkt door naar verluidt hoge niveaus van variatie binnen experimenten en inconsistent protocollen tussen onderzoeksgroepen die verschillende fenotypes van virulentie produceren tussen muizen en waxworms11,13,19,20,21. Hier, schetsen we een G. mellonella protocol om te standaardiseren C. albicans infecties, verhoging van de reproduceerbaarheid in virulentie experimenten, en tonen van consistentie met eerder beschreven studie van virulentie in RattenUitrustingen modellen.
Vorige studies aangetoond dat het C. albicans type-achtige (MTL) locus op chromosoom 5 paring regelt cel identiteit en bevoegdheid vergelijkbaar met Saccharomyces cerevisiae en andere Ascomycota schimmels22paring. De meerderheid van C. albicans isolaten zijn heterozygoot op de MTL locus, codering een van elk van de MTLeen en MTLα allelen (MTLeen/α), en zijn bijgevolg steriele15, 23 , 24. verlies van één van de allelen MTL door verlies van heterozygoten (LOH) of mutatie leidt tot homozygoot MTLeen of MTLα stammen die kunnen ondergaan een fenotypische schakelaar van de steriele 'witte' staat aan de paring bevoegde 'ondoorzichtig' staat25. Vorige werk heeft benadrukt dat verlies van MTL heterozygoten vermindert ook de virulentie in lymfkliertest modellen van systemische infectie over verschillende stam achtergronden26. Hier, detail we de G. mellonella model voor gedissemineerde candidiasis met behulp van een genetisch gelijkaardige experimentele reeks verbeelden de bijdrage van MTL heterozygoten naar virulentie in G. mellonella. We laten zien dat MTL configuratie beïnvloed C. albicans pathogeniteit, waar MTLα stammen waren minder virulente met betrekking tot zowel MTLeen/α en MTLeen cellen, vergelijkbaar met de bevindingen model26binnen lymfkliertest infectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden zijn afhankelijk van gebruik van ongewervelde gastheren en vereisen geen goedkeuring van institutionele Animal Care en gebruiken Comité (IACUC).
1. wasmot Waxworm larven
- De larven van de volgorde van groothandels en leveranciers die geen hormonen, antibiotica of andere behandelingen om de larven invoeren en die kunnen verzenden en leveren van levende specimens.
- Zorg ervoor dat alle larven kopen van dezelfde leverancier in de loop van experimenten. Wees voorzichtig bij het bestellen van larven tijdens de zomermaanden, als de temperatuur meer dan 30 ° C dalen larven levensvatbaarheid.
- Temperaturen over de verwachte verzending route controleren en dienovereenkomstig plannen van verzending en levering of kiezen voor verzending per expresse naar het minimaliseren van hun blootstelling aan omgevingsfactoren.
- Wanneer de larven komen, Controleer elke container om ervoor te zorgen dat levensvatbare, gezonde larven aanwezig zijn. Gezonde larven zal volledig worden ondergedompeld onder het beddengoed, verplaatsen, en beschikken over een lichte verkleuring van geel/tan met enkele larven met zwarte vlekken of verkleuringen langs het lichaam.
- Bewaar larven in hun container in een geventileerde ruimte bij kamertemperatuur (25 ° C). Afhankelijk van de oorspronkelijke toestand van de larven, kunnen ze worden gebruikt voor maximaal twee weken.
2. cultuur wasmot infectie voorbereiding
Opmerking: Juiste lab kledij moet gedragen worden tijdens dit gedeelte van het protocol met inbegrip van handschoenen, laboratoriumjas en veiligheidsbril.
- Maken van Gist-pepton dextrose (YPD) vloeistof en agar platen. 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 70% ethanol oplossingen voor te bereiden.
- Groeien C. albicans stammen 's nachts worden geïnjecteerd in 3 mL verse YPD in standaard cultuur buizen op een roterende trommel op middellange snelheid en 30 ° C.
- Spin cellen naar beneden bij 2.500 x g gedurende 5 minuten in een tafelblad centrifuge. Giet af supernatant, voorzichtig niet te verstoren, de cel-pellet.
- Resuspendeer de cellen volledig in 5 mL 1 x PBS door herhaalde pipetteren of vortexing. Herhaal het centrifugeren en resuspensie van cellen in PBS tweemaal meer om verwijdering van alle voedingsbodems.
- Na een laatste wassen, resuspendeer de cellen in 1 mL PBS en overbrengen naar een microcentrifuge buis.
- Een set seriële verdunningen in PBS voor het genereren van een 1:100, 1:1, 000, voeren en 1:100,000 verdunningsreeks.
Opmerking: Alternatieve verdunningen mogelijk moet bereiken van de gewenste cellen.- Met behulp van een hemocytometer, de cellen uit de 1:100 of de 1:1,000-verdunning tellen. In de meeste gevallen biedt de verdunning 1:1,000 dat de gewenste cel telt voor C. albicans culturen.
- Bereken de totale concentratie van cellen binnen de oorspronkelijke cultuur met behulp van het raster math van de hemocytometer, aiming voor tussen 30-300 cellen worden geteld in de centrale 5 x 5 raster. Een geautomatiseerde cel teller kan worden gebruikt als een alternatief; gebruik van optische dichtheid bepalen cellen wordt afgeraden als cel morfologie (grootte, vorm, enz.) kan echter aanzienlijk beïnvloeden de juistheid ervan.
- Met behulp van de graven van de gemeten cel, maak een nieuwe verdunning van 2.5x107 cellen/mL in 1 x PBS in een microcentrifuge buis. Deze verdunning zal dienen als de basis voor elke inoculatie van G. mellonella met C. albicans. Elke injectie vergt 10 µL van deze entmateriaal voor een infectieuze dosis van 250.000 C. albicans cellen.
- Bevestig nauwkeurigheid van de infectieuze dosis door plating de juiste omvang van de verdunning van de 1:100,000 voor 100 kolonie-vormende eenheden (CFUs) op YPD agar voor elke cultuur om te worden gebruikt in de infectie.
- Cel graaf platen uit stap 2.7 Incubeer gedurende 48 uur (h) bij 30 ° C en het aantal kolonies per plaat geteld. Tussen 80 en 120 kolonies vormt een acceptabel bereik liggen voor nauwkeurigheid in het entmateriaal.
3. infectie van de larven van de wasmot met Candida culturen
Opmerking: Juiste lab kledij moet gedragen worden tijdens dit gedeelte van het protocol met inbegrip van handschoenen, laboratoriumjas en veiligheidsbril.
- Voeg 1 mL 100% ethanol en 1 mL 1 x PBS twee aparte microcentrifuge buizen. De ethanol en PBS worden gebruikt voor het wassen van de injectie naald tussen infecties.
- Een kleine hoeveelheid waxworm beddengoed in een lege, 100 x 15 mm steriele petrischaal, die zal het huis van de larven na inoculatie voor elke onafhankelijke stam verspreid. Toevoeging van het beddengoed beperkt hechting van dode G. mellonella larven naar de oppervlakte van de petrischaal.
- Steriliseren een 26 G, 10 µL spuit door innemen en expunging 10 µL van 70% ethanol driemaal gevolgd door drie wast met 10 µL van 1 x PBS. Vortex de inoculatie verdunning van C. albicans en nemen 10 µL van cultuur. Ervoor zorgen dat er geen luchtbellen binnen de spuit als injectie van lucht dood bevordert en downstream analyse zal bemoeilijken.
- Open een container bezit de G. mellonella larven en zorgvuldig omdraaien beddengoed met een vinger te ontdekken van de larven. Selecteer de larven die in goede gezondheid zoals geïdentificeerd door actieve beweging, een lichte kleur geel/tan, en een gebrek aan zwarte pigment op het lichaam van de larven. Deze larven moeten zijn van gelijkaardige grootte over de volledige experimentele ingesteld.
- Halen van een enkele larven en houd van het zachtjes tussen de index/middelvinger en de duim vergelijkbaar met het houden van een potlood. De larven op haar rug rollen zodat de benen zijn naar boven. Houd de volledige lengte van het lichaam tussen de vingers en duim zodat de larven is te krullen of te trekken uit de buurt van de injectie.
Opmerking: Indien gewenst, steriliseren de plaats van injectie met een wattenstaafje gedrenkt in 100% ethanol. - Draaien van de spuit zodat de naald van schuine kant omhoog gezichten en langzaam Breng de tip van de naald met inbegrip van de lengte van de schuine kant in het lichaam op de kruising met de achterste linkerbeen. Ervoor zorgen dat de naald het lichaam doordringt en doet niet alleen het lichaam van de larven naar binnen duwen. Gebruik geen kracht in het lichaam doordringen, zoals de naald volledig via de larven snel doorboren kan. Voorzichtig opheffen met de naald zal passende penetratie bevestigen. Injecteer de volledige 10 µL Candida entmateriaal en uitpakken van de naald.
- Herhaal stap 3.3-3.5 voor elke larven. Om te voorkomen dat cel afwikkeling, vortex de Candida culturen voor inoculatie na iedere derde injectie. Als een besturingselement, een set van G. mellonella te injecteren met 10 µL van 1 X PBS.
- Co huis 10 larven uit de dezelfde Candida cultuur in elke 100 x 15 mm petrischaal na inoculatie geïnjecteerd. Incubeer larven bij 37 ° C gedurende acht dagen, larven elke 24 uur controleren om te controleren van de dood.
- Beoordelen van sterfte in eerste instantie door de donkere pigmentatie, de vorming van zwarte vlekken of organen, en een gebrek aan beweging. Om te bevestigen sterfte, gebruik pincet te zachtjes rollen stervende larven op hun rug en licht het porren van de larven de onderkant met de pincet. Niet-ontvankelijkheid zoals waargenomen door een gebrek aan zichtbare lichaam of been beweging is scoorde als dood en de larven zijn verwijderd uit de petrischaal.
- Record larven sterfte in de tijdsverloop. Larven die beginnen te verpoppen in vlinders en kunnen worden opgenomen in de analyse, maar moeten worden verwijderd als ze beginnen te molt. Larven verpoppen kunnen uit eindpunt analyse worden gecensureerd, zoals de virulentie verschillen tussen larven en Verpopping onduidelijk zijn.
- Statistische significantie, gebruik van Mantel-Cox statistische test te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier tonen we een reproduceerbare methode voor het gebruik van G. mellonella waxworms te onderzoeken van een gedissemineerde candidiasis model van infectie met C. albicans. De juiste opslag, onderhoud en selectie van larven voor infectie zijn kritische component reproduceerbaarheid te verzekeren in G. mellonella sterfte(Figuur 1). Gezonde larven, die actief zijn, hebben een lichte kleur geel/tan, en gebrek aan zwarte vlekken op het lichaam moeten worden gebruikt voor dit systeem en zijn meestal levensvatbaar is voor infectie tot twee weken na aankomst. Te minimaliseren alle potentieel storende effecten van G. mellonella fysiologie, uitgekozen larven van vergelijkbare grootte en gewicht. Een goed gemengde entmateriaal en consistente injectie op dezelfde anatomische locatie van het lichaam larven ook staan als belangrijke variabelen bij het bevorderen van reproduceerbaarheid tussen experimenten. Beelden vitrine onderhoud van geïnfecteerde larven tot en met de duur van experimenten (Figuur 1B).
Om te beoordelen van het effect van leeftijd van de larven in virulentie, werden aparte PBS controle infecties uitgevoerd met larven nul of tien dagen na aankomst. Geen significant verschil in de kinetiek van G. mellonella dood bestond tussen deze groepen(Figuur 2). Karakteristieke tekenen van ziekte ontstond in de larven van beide groepen die bezweken aan de infectie; de oorspronkelijk geel/tan verkleuring van de larven werd verkleurd en gaf manier om de zwarte vlekken voor totaal verlies van beweeglijkheid en, uiteindelijk, de dood (Figuur 2B). Infectie met C. albicans versnelt dit proces van verkleuring en morbiditeit maar verandert niets aanzienlijk de opeenvolging van fenotypische markeringen leiden tot dood in vergelijking met niet-geïnfecteerde larven of PBS geïnjecteerd larven (Figuur 2C).
De infectieuze dosis ook aanzienlijk beïnvloedt sterfte kinetiek van G. mellonella infecties. Om te beoordelen van de effecten van C. albicans entmateriaal grootte, we G. mellonella besmet met vier verschillende klinische isolaten (12 C, P60002, P75010 en SC5314: tabel 1) op drie verschillende doses. Larven geïnfecteerd met SC5314 weergegeven sterfte bij alle doses, consistent met verhoogde pathogeniteit van deze isolaat ten opzichte van de meeste anderen binnen het experiment (Figuur 2D) gebruikt. Meer larven bezweken aan infectie met 1.0 x 105 SC5314 of 12 C cellen ten opzichte van 1.0 x 104 cellen. De hoogste dosis van 1,0 x 106 cellen bleek uiterst dodelijk met larven sterven na infectie van alle soorten, met inbegrip van de minder virulente isolaten, P60002 en 12 C. Larven ingespoten met P75010 en SC5314 bezweken aan de infectie binnen de 24u, suggereert dat een meer gematigde infectieuze dosis is nodig om verschillen in virulentie te bepalen. Bijgevolg werd een infectieuze dosis 2.5x105 gebruikt voor alle latere experimenten.
Om aan te tonen gelijkenis in virulentie tussen RattenUitrustingen en G. mellonella modellen van systemische ziekten, we vehiculumcontrolegroep virulentie van SC5314 afkomstige C. albicans stammen codering ofwel heterozygoot (een/α of homozygoot (een/-of Α /-) MTL loci. Infectie van G. mellonella met MTL heterozygoten uit de SC5314 of de prototrofe afgeleide BWP17 genetische achtergrond geproduceerd hoge sterfte in vergelijking met PBS-geïnjecteerd dieren. Driekwart van de controle-larven overleefde tot dag 8 vergeleken met verlies van meer dan de helft van alle C. albicans geïnjecteerd dieren binnen 3 dagen post infectie (dpi) dat verder met 8 dpi (Figuur 3A, 3B toegenomen). Infectie met BWP17 getemperd C. albicans letaliteit in dit model (27% overleving in vergelijking met 4% overleving in SC5314 MTL heterozygoten op 8 dpi; Figuur 3 C, 3D). G. mellonella larven besmet met MTLα /-stammen overleefde aanzienlijk langer vergeleken met de MTL heterozygoot ouderlijke soorten (log-rank test, SC5314; p = 0.0006, BWP17; p = 0.0002). Interessant, virulentie van MTLeen/-C. albicans cellen gematched zijn heterozygoot tegenhanger van MTL in zowel de SC5314 als de BWP17 achtergronden. Dus, MTL configuratie heeft een invloed op C. albicans virulentie met MTLα /-stammen verminderde doden ten opzichte van MTLeen/α of MTLeen/-cellen weer te geven.
Figuur 1 . Overzicht van de procedure van de infectie. (A) een stroomdiagram belicht de belangrijkste elementen van de procedure van de infectie met inbegrip van bestellen en opslag van larven, infectie cultuur voorbereiding en injectie. (B) representatieve beelden tonen gezonde opslagcondities, voorbereiding van de infectie ruimte, injectie en larven onderhoud na infectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . De effecten van G. mellonella infectie procedures. (A) PBS besturingselementen werden besmet onmiddellijk bij aankomst (PBS-D0, blauw) of na 10 dagen (PBS-D10, rood). (B) Leg uit representatieve beelden larven verkleuring en dood. (C) een beeld-reeks van infectie platen detail de gevolgen van injectie met PBS (midden) of met SC5314 (lagere) ten opzichte van niet-geïnfecteerde larven (boven) op de dagen 1, 3, 5 en 7 na injectie. (D) dosering effecten worden weergegeven in een collectie van klinische isolaten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . De MTLeen allel bevordert C. albicans doden van G. mellonella. MTL locus heterozygoot (een/α) en homozygoot (een/- en α /-) SC5314 (A) en BWP17 (C) derivaten zijn uitgezet voor de larven sterfte over acht dagen. Betrouwbaarheidsintervallen worden uitgezet voor elke SC5314 (B) en BWP17 (D) afgeleide stam Markeer consistentie in de kinetiek van larven sterfte in experimenten. Het gemiddelde (vaste lijn) is die zijn getekend met de standaarddeviaties (gevuld in de ruimte) voor drie biologische replicatieonderzoeken van elk 10 larven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Candida stam | Ouderlijke stam | Genotype | MTL | Referentie |
| MAY1 | SC5314 | Candida albicans klinische isolaat | a/α | Wu et al. 2007 |
| MAY6 | P60002 | Candida albicans klinische isolaat | a/a | Wu et al. 2007 |
| MAY11 | P75010 | Candida albicans klinische isolaat | a/α | Wu et al. 2007 |
| MAY15 | 12C | Candida albicans klinische isolaat | a/a | Wu et al. 2007 |
| MAY61 | SC5314 | MTLa:: SAT1 | Α /- | Deze studie |
| MAY71 | SC5314 | MTLα:: SAT1S tac1::TAC1-GFP-HYGR | een /- | Deze studie |
| MAY313 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-arg4-ura3-BN sir2::his1/sir2::dpl200 | a/α | Deze studie |
| MAY314 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-BN sir2::HIS1/sir2::dpl200 | Α /- | Deze studie |
| MAY315 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-BN sir2::HIS1/sir2::dpl200 | een /- | Deze studie |
Tabel 1. C. albicans streinen gebruikt in deze studie.
| Variabele component | Voorgestelde controle | Referentie |
| Larven leeftijd ten tijde van de injectie | Minimaliseren van de tijd tussen worm aankomst en inoculatie | Deze studie |
| De grootte van de larven bij tijd voor injectie | Zorgen voor samenhang bij de keuze van wormen | Fuchs et al. 2010 |
| Larven gezondheid ten tijde van de injectie | Bestellen van wormen tijdens gematigde temperatuur, gebruik onmiddellijk bij aankomst | Deze studie |
| Infectieuze dosis met C. albicans | Selecteer een besmettelijke concentratie waarin de breedste waaier van resultaten | Deze studie |
| Larven reactie op de injectie | Voeren van PBS injectie besturingselementen naast wormen met geen injectie | Hirakawa et al. 2015 |
Tabel 2. Overwegingen met betrekking tot G. mellonella infectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het waxworm-model van G. mellonella staat als een effectief instrument voor de snelle en reproduceerbare analyse van C. albicans virulentie. Dit gedetailleerde protocol is gebaseerd op consistente levering van een gedefinieerde infectieuze dosis aan dezelfde site over een batch van larven. Infectieuze dosis heeft een diepgaande invloed op G. mellonella mortaliteit, terwijl gebruik van larven tussen hun eerste aankomst en tien dagen na ontvangst soortgelijke resultaten opgeleverd. Verlies van de C. albicansMTLeen allel resulteert in verminderde virulentie conform eerdere experimenten met muizen, hoewel verstoring van het MTLα-allel larven dood niet gewijzigd.
Het resultaat van G. mellonella infecties kan aanzienlijk worden beïnvloed door de proefopzet. In tegenstelling tot gewervelde modellen van de infectie, kan kleine variatie in de injectieplaats, entmateriaal volume en entmateriaal grootte interpretaties van de gegevens beïnvloeden. Infecties met het toenemend aantal C. albicans cellen leidde tot meer en snellere morbiditeit van geïnfecteerde larven. Op een bepaald moment, injecteren van te veel C. albicans wordt weergegeven staat van verdediging van de gastheer leidt tot snelle dood van de host, mogelijk door middel van toxische shock overweldigende. SC5314 was echter consequent de meest virulente stam op alle doses, gevolgd door 12C, en vervolgens de andere stammen. Dus infectie parameters hebben een diepgaande invloed op de absolute kinetiek van infecties maar kunnen nog steeds van relatieve virulentie schattingen op te leveren. Voorafgaande werk binnen deze experimenten aangetoond verder het belang van grondig wassen de Candida -cellen. Residuele YPD opgenomen in de injectie bolus aanzienlijk vermindert larven overleven (gegevens niet worden weergegeven).
Worm gezondheid is een belangrijke variabele bij het uitvoeren van G. mellonella experimenten. Larven vervoerd met behulp van standaard verzending in het midden van de zomer vaak komen vroegtijdig verouderd of benadrukt, bedekt met zwarte vlekken, met verminderde levensvatbaarheid. Geen belangrijke rol voor de grootte van de larven op morbiditeit eerder geconstateerd hoewel de hier beschreven experimenten gericht op het analyseren van larven van ongeveer gelijke massa. Gezonde larven en larven van PBS controle moeten altijd worden uitgevoerd naast infectie groepen ter verantwoording voor eventuele wijzigingen in de levensvatbaarheid van de larven tussen biologische replicatieonderzoeken uitgevoerd op verschillende dagen. G. mellonella besmet tien dagen na aankomst gematched de kinetiek van larven besmet onmiddellijk na ontvangst. Dus, kan een enkele zending van larven bieden voldoende materiaal en tijd uit te voeren volledige experimenten. Deze experimenten ingeroepen 30 dieren per stam verschillen in virulentie, die aanzienlijk meer dieren dan meestal gebruikt in lymfkliertest modellen, wat resulteert in een sterker vertrouwen van de waargenomen resultaten11,27 bepalen , 28. dit model ook minder ethische bezwaren, tijd en kosten in vergelijking met gewervelde modellen van infectie. Zo kan het gebruik van wax larven identificatie van kleinere effecten op systemische virulentie vergemakkelijken, dan is het mogelijk in andere systemen.
Inherente beperkingen aan het systeem van G. mellonella bestaan die zijn nut bij het bestuderen van de gastheer-pathogeen interacties beperken. Ten eerste, G. mellonella ontbreken een adaptieve immuunsysteem en kan niet worden gebruikt om te onderzoeken antigenicity of immunologisch geheugen zoals in hogere eukaryoten29. Het lichaam van de larven is samengesteld uit een enkele continu holte gevuld met Hemolymfe, die functie te laten circuleren van voedingsstoffen, signalering van moleculen, immune cellen en antimicrobiële peptiden. Deze immuuncellen, hemocytes, kunnen werken op dezelfde manier aan neutrofielen en daarom phagocytose, genereren oxidatieve uitbarstingen en lytische enzymen na activering door extracellulaire pathogen erkenning receptoren30afscheiden. Deze functie is echter een subset van aangeboren immuun cel processen binnen chordate systemen die niet volledig met alle activiteiten van de leukocyten overeen mogelijk. Een andere belangrijke caveat is het ontbreken van een genoom-vergadering voor G. mellonella hoewel het genoom onlangs gesequenceerd31 was. Bijgevolg, de omvang van de genotypische verscheidenheid binnen de soort is onbekend en waarschijnlijk de meeste leveranciers schip genetisch heterogene populaties die sterfte in experimenten kunnen beïnvloeden. Bovendien, moleculaire technieken niet bestaan voor het organisme en compliceren elke poging tot ontleden van host bijdragen aan de pathogenese. Toch ondersteunt consistente virulentie resultaten na infectie met C. albicans over experimenten, leveranciers, tijd en labs hun nut in fundamentele vraagstukken pathogeniteit.
Verlies van MTLeen verminderde virulentie van C. albicans ten opzichte van MTL heterozygoten en MTLα homozygote achtergronden. Deze trend is in overeenstemming met eerder werk uitgevoerd met behulp van Muismodellen van systemische virulentie26. In tegenstelling tot lymfkliertest modellen, verlies van MTLα virulentie ten opzichte van de MTLeen/α ouderlijke stam niet gewijzigd. De discrepantie tussen deze resultaten is onduidelijk, maar kan ook onderdelen van adaptieve immuniteit die in ongewervelde organismen ontbreken. U kunt ook kan verhoogde virulentie MTL heterozygoten is gekoppeld aan te wijten zijn alleen de MTLα allel in SC5314, potentiating van de behoefte aan beoordeling over meerdere achtergronden van de stam. Wij stellen daarom voor een differentiële rol voor virulentie tussen de twee allelen van MTL .
Over het geheel genomen fungeert de G. mellonella model als een snelle en reproduceerbare model voor de beoordeling van systemische candidiasis. Andere uitlezingen van virulentie kunnen worden bepaald met dit model met inbegrip van schimmel prevalentie door larven homogenaat voor kolonievormende eenheden (CFUs)11 of bioluminescentie, waarin ook schimmel lokalisatie32plating. In de toekomst dit model kan worden uitgebreid om te kunnen beoordelen van virulentie kenmerken van andere Candida -soorten zoals verhoogde resistentie in de nieuw opkomende Candida auris soorten33. Verdere ontwikkeling van tools om te visualiseren lymfocyt binnen G. mellonella interactie met Candida, infecteren ingeteelde waxworm geslachten te reduceren van variabiliteit in infecties resultaten en visualisatie van de infectieuze proces via verslaggever Candida lijnen34 verder verfijnen dit model van ziekte en toestaan dieper onderzoek van in vivo gastheer-pathogeen interacties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs wil erkennen de hulp van Pamela Washington en Leah Anderson bij het verkrijgen van de wasmot voor gebruik in deze studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Snackworms.com | Buy twice as many worms as expected to use | |
| 10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe | Hamilton | 80000 | |
| Petri dish, 100X15 mm, 500 pack | Fisher | FB0875712 | |
| Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack | VWR | 87003-294 | |
| Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL | VWR | 97062-818 | |
| Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL | Millipore Sigma | EM-EX0276-1S | |
| autoclaved ddH2O |
References
- Kauffman, C. A., et al. Prospective multicenter surveillance study of funguria in hospitalized patients. The National Institute for Allergy and Infectious Diseases (NIAID) Mycoses Study Group. Clinical Infectious Diseases. 30 (1), 14-18 (2000).
- Horn, D. L., et al. Epidemiology and outcomes of candidemia in 2019 patients: data from the prospective antifungal therapy alliance registry. Clinical Infectious Diseases. 48 (12), 1695-1703 (2009).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clinical Microbiology Reviews. 20 (1), 133-163 (2007).
- Sardi, J. C., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 1 10-24 (2013).
- Segal, E., Frenkel, M. Experimental in Vivo Models of Candidiasis. J Fungi (Basel). 4 (1), (2018).
- Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L. Animal models for candidiasis. Current Protocols in Immunology. 105, 11-17 (2014).
- Heymann, P., et al. The siderophore iron transporter of Candida albicans (Sit1p/Arn1p) mediates uptake of ferrichrome-type siderophores and is required for epithelial invasion. Infection and Immunity. 70 (9), 5246-5255 (2002).
- Priest, S. J., Lorenz, M. C. Characterization of Virulence-Related Phenotypes in Candida Species of the CUG Clade. Eukaryotic Cell. 14 (9), 931-940 (2015).
- Savage, D. C., Dubos, R. J. Localization of indigenous yeast in the murine stomach. J Bacteriol. 94 (6), 1811-1816 (1967).
- Ewbank, J. J., Zugasti, O. C. elegans: model host and tool for antimicrobial drug discovery. Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 300-304 (2011).
- Amorim-Vaz, S., Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. Examining the virulence of Candida albicans transcription factor mutants using Galleria mellonella and mouse infection models. Frontiers in Microbiology. 6, 367 (2015).
- Harding, C. R., Schroeder, G. N., Collins, J. W., Frankel, G. Use of Galleria mellonella as a model organism to study Legionella pneumophila infection. Journal of Visualized Experiments. (81), e50964 (2013).
- Jacobsen, I. D. Galleria mellonella as a model host to study virulence of Candida. Virulence. 5 (2), 237-239 (2014).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
- Hirakawa, M. P., et al. Genetic and phenotypic intra-species variation in Candida albicans. Genome Research. 25 (3), 413-425 (2015).
- Dunn, M. J., Kinney, G. M., Washington, P. M., Berman, J., Anderson, M. Z. Functional diversification accompanies gene family expansion of MED2 homologs in Candida albicans. PLoS Genetics. 14 (4), 1007326 (2018).
- Astvad, K. M. T., Meletiadis, J., Whalley, S., Arendrup, M. C. Fluconazole Pharmacokinetics in Galleria mellonella Larvae and Performance Evaluation of a Bioassay Compared to Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry for Hemolymph Specimens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).
- Mesa-Arango, A. C., et al. The non-mammalian host Galleria mellonella can be used to study the virulence of the fungal pathogen Candida tropicalis and the efficacy of antifungal drugs during infection by this pathogenic yeast. Med Mycol. 51 (5), 461-472 (2013).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Fuchs, B. B., O'Brien, E., Khoury, J. B., Mylonakis, E. Methods for using Galleria mellonella as a model host to study fungal pathogenesis. Virulence. 1 (6), 475-482 (2010).
- Kavanagh, K., Fallon, J. P. Galleria mellonella larvae as models for studying fungal virulence. Fungal Biology Reviews. 24 (1-2), 79-83 (2010).
- Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285 (5431), 1271-1275 (1999).
- Legrand, M., et al. Homozygosity at the MTL locus in clinical strains of Candida albicans: karyotypic rearrangements and tetraploid formation. Molecular Microbiology. 52 (5), 1451-1462 (2004).
- Lockhart, S. R., et al. In Candida albicans, white-opaque switchers are homozygous for mating type. Genetics. 162 (2), 737-745 (2002).
- Miller, M. G., Johnson, A. D. White-opaque switching in Candida albicans is controlled by mating-type locus homeodomain proteins and allows efficient mating. Cell. 110 (3), 293-302 (2002).
- Wu, W., Lockhart, S. R., Pujol, C., Srikantha, T., Soll, D. R. Heterozygosity of genes on the sex chromosome regulates Candida albicans virulence. Molecular Microbiology. 64 (6), 1587-1604 (2007).
- Herrero, A. B., et al. KRE5 gene null mutant strains of Candida albicans are avirulent and have altered cell wall composition and hypha formation properties. Eukaryotic Cell. 3 (6), 1423-1432 (2004).
- Hall, R. A., et al. The Mnn2 mannosyltransferase family modulates mannoprotein fibril length, immune recognition and virulence of Candida albicans. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003276 (2013).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Journal of Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
- Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infection and Immunity. 73 (7), 4161-4170 (2005).
- Lange, A., et al. Genome Sequence of Galleria mellonella (Greater Wax Moth). Genome Announcements. 6 (2), (2018).
- Krappmann, S. Lightning up the worm: How to probe fungal virulence in an alternative mini-host by bioluminescence. Virulence. 6 (8), 727-729 (2015).
- Chowdhary, A., Voss, A., Meis, J. F. Multidrug-resistant Candida auris: 'new kid on the block' in hospital-associated infections. Journal of Hospital Infection. 94 (3), 209-212 (2016).
- Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. Adaptation of a Gaussia princeps Luciferase reporter system in Candida albicans for in vivo detection in the Galleria mellonella infection model. Virulence. 6 (7), 684-693 (2015).
