Summary
Galleria mellonella sert d’un modèle d’invertébrés pour la candidose disséminée. Ici, nous détaillons l’infection du protocole et de prévoir l’efficacité du modèle de données à l’appui.
Abstract
Les espèces de Candida sont commun champignons commensaux des humains qui colonisent la peau, des muqueuses et tube digestif. Sous certaines conditions, le Candida peut proliférer leurs niches naturelles entraînant débilitante infections muqueuses comme bien comme menaçant les infections systémiques, qui sont un élément majeur de l’enquête en raison de leur taux de mortalité élevé. Les modèles animaux d’infection disséminée existent pour étudier la progression de la maladie et de disséquer les caractéristiques de pathogénicité de Candida . Parmi ces, le modèle d’infection de teigne Galleria mellonella offre un outil expérimental rentable à haut débit des investigations de virulence systémique. De nombreux autres agents infectieux bactériens et eucaryotes ont été étudiés efficacement dans g. mellonella de pathogénicité, de comprendre ce qui en fait un système modèle largement accepté. Pourtant, variation de la méthode utilisée pour infecter g. mellonella peut altérer les résultats phénotypiques et compliquer l’interprétation des résultats. Ici, nous présentons les avantages et les inconvénients du modèle réalisé pour étudier la pathogenèse de Candida systémique et une approche pour améliorer la reproductibilité en détail. Nos résultats soulignent l’éventail des cinétiques de la mortalité chez les g. mellonella et décrivent les variables qui peuvent moduler ces cinétiques. En fin de compte, cette méthode se présente comme une approche éthique, rapide et rentable pour étudier la virulence dans un modèle de candidose disséminée.
Introduction
Les espèces de Candida sont des commensaux humaines communes qui sont capables d’en train de devenir des agents pathogènes opportunistes dans sévèrement immunodéprimés et les patients dysbiotic. Bien que plusieurs espèces de Candida peuvent provoquer des maladies, c. albicans est la cause prédominante de candidose disséminée1,2. Maladie systémique résultant c. albicans , accès à la circulation sanguine grâce à une pénétration directe des barrières de l’hôte déjà restrictives ou introduction au sites chirurgicaux et d’autres violations du corps3. Les espèces de Candida utilisent un éventail de processus pathogènes provoquent des maladies systémiques au sein de l’hôte, y compris la filamentation, la formation de biofilm, évasion de cellules immunitaires et évasion et fer nettoyage4. In vitro des approches existent pour étudier les mécanismes pathogènes individuels, mais des modèles animaux continuent de fournir la meilleure option pour enquêter sur l’ensemble des maladies résultat5,6. Des recherches antérieures a détaillé les nombreux cas de promettre en vitro enquêtes de virulence avoir omis de reproduire in vivo7,8. Ainsi, les modèles animaux sont encore nécessaires afin d’évaluer la virulence in vivo. La plupart des modèles de la maladie dépendent de la souris pour servir de substitut pour les infections humaines malgré l’incapacité de c. albicans naturellement coloniser murines systèmes comme un commensal9. Invertébrés ultrarésistant de candidose disséminée le nématode Caenorhabditis elegans, le fruit fly Drosophila melanogasteret la teigne Galleria mellonella, bien que les préoccupations au sujet des différences fondamentales en physiologie de base, la température du corps hôte et voies d’exposition ont entravé leur acceptation large10,11.
Plus récemment, le modèle d’infection de teigne g. mellonella a été adopté à la pathogénicité de modèle d’un large éventail d’agents pathogènes bactériens et fongiques12,13,14. Avantages de ce modèle incluent son coût relativement faible, une augmentation débit, facilité d’utilisation et réduit les préoccupations d’ordre éthique concernant les animaux par rapport aux modèles murins de la bienfaisance. Pour les chercheurs, cela se traduit par une capacité accrue de tester plusieurs variables, des intervalles de confiance plus fortes, l’expérimentation plus rapide et contournement des protocoles animaux. G. mellonella a servi de plateforme d’évaluer rapidement la virulence de c. albicans après perturbation des gènes nécessaires à biofilm formation filamentation et gène règlement dans l’ensemble des isolats cliniques11,15 ,,16. Des études récentes ont intégré l’enquête d’efficacité antifongique avec g. mellonella pour évaluer la pharmacocinétique de drogues est très actif et résistance sous in vivo paramètres, qui sont autrement difficile et chronophage 17,,18. Pourtant, les études de c. albicans virulence chez g. mellonella ont été compliquées par aurait été de hauts niveaux de variation au sein des expériences et des protocoles incompatibles entre les groupes de recherche qui produisent différents phénotypes de résistance entre la souris et waxworms11,13,19,20,21. Ici, nous exposons un protocole de g. mellonella visant à normaliser les infections, de c. albicans augmentation reproductibilité dans les expériences de virulence et démontrer leur cohérence avec les études décrites précédemment de virulence dans murin modèles.
Des études antérieures ont démontré que c. albicans , accouplement de type semblable (MTL) locus sur le chromosome 5 régule identité cellulaires et accouplement de compétence similaire à Saccharomyces cerevisiae et autres de champignons ascomycètes22. La majorité des isolats de c. albicans est hétérozygote au locus MTL , codant chacun des MTLun et MTLα allèles (MTLun/α) et est par conséquent stériles15, 23 , 24. perte de l’un des allèles MTL par le biais de perte d’hétérozygotie (LOH) ou mutation conduit à homozygotes MTLune ou des souches α de MTLqui peuvent subir une commutation phénotypique de l’état stérile « blanc » à la accouplement d’État compétent de « opaque »25. Les travaux précédents a mis en évidence que perte d’hétérozygotie MTL réduit également virulence dans les modèles murins d’infection systémique à travers de souche différente origines26. Ici, nous détaillons le modèle de g. mellonella pour candidose disséminée utilisant un jeu expérimental génétiquement semblable pour illustrer la contribution d’hétérozygotie MTL de virulence chez g. mellonella. Nous montrons que MTL configuration influencé pathogénicité de c. albicans , où MTLα souches étaient moins virulentes MTLun/α tant MTLa cellules, semblables aux conclusions au sein de l’infection murine modèle26.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites s’appuient sur l’utilisation des hôtes d’invertébrés et ne nécessitent pas d’approbation institutionnelle animalier et utiliser Comité (IACUC).
1. les larves de teigne galleria mellonella
- Commander des larves de grossistes et fournisseurs qui n’introduisent pas d’hormones, antibiotiques ou autres traitements aux larves et qui sont en mesure d’expédier et livrer des spécimens vivants.
- N’oubliez pas d’acheter toutes les larves auprès du même fournisseur au cours de l’expérimentation. Soyez prudent lorsque vous passez votre commande de larves pendant les mois d’été que des températures supérieures à 30 ° C diminuent la viabilité des larves.
- Surveiller les températures dans l’ensemble de l’itinéraire de livraison prévue et plan d’expédition et livraison en conséquence ou choisir une expédition accélérée afin de minimiser leur exposition aux conditions environnementales.
- Lorsque les larves arrivent, vérifier chaque conteneur afin d’assurer des larves viables, en bonne santés sont présents. Les larves saines seront complètement submergées sous la literie, le déplacement et possèdent une légère coloration jaune/navy/red avec peu de larves contenant des marques noires ou décoloration le long du corps.
- Ranger les larves dans le contenant dans un endroit ventilé à température ambiante (25 ° C). Selon la condition initiale des larves, ils peuvent servir jusqu'à deux semaines.
2. culture préparation pour Infection Galleria mellonella
NOTE : Vêtements de laboratoire approprié doit être porté tout au long de cette partie du protocole notamment gants, blouse et lunettes de sécurité.
- Faire dextrose peptone levure plaques de liquide et l’agar (DPJ). Préparer 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et solutions d’éthanol 70 %.
- Croissance des souches de C. albicans à injecter du jour au lendemain dans 3 mL de la DPJ fraîche dans des tubes de culture standard sur un tambour rotatif à vitesse moyenne et 30 ° C.
- Faire tourner les cellules vers le bas à 2 500 g pendant 5 min dans une centrifugeuse de table. Décanter le liquide surnageant, en veillant à ne pas déranger le culot cellulaire.
- Remettre en suspension les cellules entièrement dans 5 mL de PBS 1 x par la pipette répétées ou l’utilisation du vortex. Répétez la centrifugation et la remise en suspension des cellules dans deux fois plus de PBS pour garantir l’élimination de tous les milieux de culture.
- Après un lavage final, remettre en suspension des cellules dans 1 mL de PBS et transférez-les sur un tube de microcentrifuge.
- Procéder à une série de dilutions en série dans du PBS pour générer un 1/100, 1:1, 000 et série de dilution de 1/100 000.
Remarque : Dilutions Alternative peuvent être nécessaires pour atteindre les globules désirée.- Utilisant un hémocytomètre, compter les cellules depuis le 1/100 ou la dilution de 1 : 1 000. Le plus souvent, la dilution de 1 : 1 000 fournit que la cellule appropriée compte pour cultures de c. albicans .
- Calculer la concentration totale des cellules dans la culture initiale en utilisant le calcul de la grille de l’hémocytomètre, viser entre les cellules de 30-300 pour être comptés dans la grille de 5 x 5 centrale. Un compteur de cellules automatisées peut-être être utilisé comme alternative. Cependant, l’utilisation de la densité optique pour déterminer le nombre de cellules est déconseillée tant que la morphologie cellulaire (taille, forme, etc.) peut affecter significativement l’exactitude des informations.
- En utilisant le nombre de cellules mesurées, faire une dilution nouvelle de 2.5x107 cellules/mL dans une solution de 1 PBS x dans un tube de microcentrifuge. Cette dilution servira de base pour chaque inoculation de g. mellonella avec c. albicans. Chaque injection nécessitera 10 µL de cet inoculum pour une dose infectieuse de 250 000 cellules de c. albicans .
- Confirmer la précision de la dose infectieuse en ensemençant le volume exact de la dilution 1/100 000 pour 100 unités formant colonies (UFC) sur agar de la DPJ pour chaque culture à utiliser dans l’infection.
- Incuber les plaques de numération des cellules de l’étape 2.7 pendant 48 heures (h) à 30 ° C et compter le nombre de colonies par boîte. Entre 80 et 120 colonies constitue une plage acceptable pour une précision dans l’inoculum.
3. infection des larves de Galleria mellonella avec des Cultures de Candida
NOTE : Vêtements de laboratoire approprié doit être porté tout au long de cette partie du protocole notamment gants, blouse et lunettes de sécurité.
- Ajouter 1 mL d’éthanol à 100 % et 1 mL de solution 1 PBS x à deux tubes de microcentrifuge distinct. L’éthanol et PBS servira à laver l’aiguille d’injection entre les infections.
- Étendre une petite quantité de litière de teigne dans un vide, 100 x 15 mm boîte de Petri stérile, qui abritera les larves après inoculation pour chaque souche indépendante. Ajout de la literie limite l’adhérence des morts g. mellonella larves à la surface de la boîte de Pétri.
- Stériliser un 26 G, 10 seringue µL en reprenant et en radiation 10 µL d’éthanol 70 % trois fois suivie de trois lavages avec addition de 10 µL de solution 1 PBS x. Vortex la dilution de l’inoculation de c. albicans et prennent 10 µL de la culture. S’assurer qu’il n’y a aucune bulle d’air dans la seringue, injection d’air favorise la mort et va compliquer l’analyse en aval.
- Ouvrir un conteneur renfermant les larves de g. mellonella et retournez soigneusement literie avec un doigt pour découvrir des larves. Sélectionnez les larves qui sont en bonne santé, tels qu’identifiés par le mouvement actif, une lumière de couleur jaune/Navy/Red et un manque de pigmentation noire sur le corps de la larve. Ces larves doivent être de taille similaire à travers le plein expérimental définis.
- Ramasser une seule larve et maintenez-le délicatement entre le pouce et l’index ou du majeur semblable à tenir un crayon. Rouler les larves sur le dos afin que les jambes soient vers le haut. Maintenez toute la longueur du corps entre les doigts et le pouce afin que les larves ne parvient pas à boucler ou s’arracher de l’injection.
NOTE : Si vous le souhaitez, Stérilisez le point d’injection à l’aide d’un coton-tige imbibé d’éthanol à 100 %. - Faire pivoter la seringue pour coupe en biseau de l’aiguille vers le haut et introduire doucement la pointe de l’aiguille dont la longueur du biseau dans le corps à la jonction avec la jambe gauche plus en arrière. Veiller à ce que l’aiguille pénètre dans le corps et ne pousse pas simplement le corps de l’intérieur des larves. Ne forcez pas à pénétrer le corps comme l’aiguille peut percer complètement par les trématodes rapidement. Soulever délicatement avec l’aiguille confirmera la pénétration appropriée. Injecter l’inoculum de Candida complet 10 µL et extraire l’aiguille.
- Répétez l’étape 3.3-3.5 pour chaque larve. Pour empêcher la cellule de décantation, vortex le Candida cultures pour l’inoculation après chaque troisième injection. Comme contrôle, injecter 10 µL de solution 1 PBS X un ensemble de g. mellonella .
- Maison Co 10 larves injectés de la même culture de Candida dans chaque boîte de Pétri 100 x 15 mm suivant l’inoculation. Incuber à 37 ° C, les larves pendant huit jours, vérification des larves toutes les 24 h pour surveiller la mort.
- Évaluer la mortalité initialement par pigmentation sombre, la formation de taches noires ou des organes et le manque de mouvement. Pour confirmer la mortalité, utiliser des pinces à rouler doucement les larves moribonds sur leur dos et pousser légèrement dessous de larve avec la pince à épiler. Non-réactivité tel qu’observé par l’absence de mouvement de corps ou de la jambe visible est marquée comme mort et les larves sont supprimés de la boîte de Pétri.
- Mortalité des larves record au cours du temps. Les larves qui commencent à se nymphoser dans papillons peuvent être incluses dans l’analyse mais doivent être retirés si ils commencent à muer. Larves de poupée peuvent être censurés de point de terminaison analyse que les différences de virulence entre la larve et la nymphe ne sont pas claires.
- Évaluer la signification statistique en utilisant le test statistique de Mantel-Cox.
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Representative Results
Ici, nous démontrons une méthode reproductible pour l’utilisation de g. mellonella waxworms pour enquêter sur un modèle de candidose disséminée de l’infection à l’aide de c. albicans. Le rangement, l’entretien et la sélection des larves d’infection sont une composante essentielle d’assurer la reproductibilité mellonella g. mortalité (Figure 1A). Les larves saines qui sont actifs, ont une légère couleur jaune/navy/red, et correctifs manque noir sur le corps doivent être utilisés pour ce système et sont généralement viable pour l’infection jusqu'à deux semaines après l’arrivée. Pour minimiser les effets potentiellement confondants de g. mellonella physiologie, les larves ont été sélectionnés de taille et de poids similaires. Un inoculum bien mélangée et injection compatible sur le même site anatomique du corps des larves sont aussi des variables importantes dans la promotion de reproductibilité entre les expériences. Images en vedette entretien des larves infectées pendant toute la durée de l’expérimentation (Figure 1B).
Afin d’évaluer l’incidence de l’âge des larves sur la virulence, PBS distincts contrôler les infections ont été réalisées avec des larves soit zéro, soit dix jours après son arrivée. Aucune différence significative dans la cinétique de la mort de g. mellonella n’existait entre ces groupes (Figure 2A). Les signes caractéristiques de la maladie ont été soulevées dans les larves des deux groupes qui ont succombé à l’infection ; la coloration jaune initialement/navy/red de la larve devenue décolorée et a cédé la place à des taches noires avant la perte totale de motilité et, éventuellement, la mort (Figure 2B). L’infection par c. albicans accélère ce processus de décoloration et de morbidité, mais ne modifie pas significativement la cascade de marqueurs phénotypiques conduisant à la mort par rapport aux larves non infectées ou PBS injecté des larves (Figure 2C).
La dose infectieuse également significativement impact cinétique de la mortalité des infections de g. mellonella . Afin d’évaluer les effets de la taille d’inoculum de c. albicans , nous avons infecté g. mellonella avec quatre différents isolats cliniques (12C, P60002, P75010 et SC5314 : tableau 1) à trois doses différentes. Les larves infectées avec SC5314 affichent mortalité à toutes les doses, conformes à la pathogénicité accrue de cet isolat par rapport à la plupart des autres utilisés au sein de l’expérience (Figure 2D). Plus de larves a succombé à l’infection avec 1,0 x 105 SC5314 ou C 12 cellules par rapport à 1,0 x 104 cellules. La dose maximale de 1,0 x 106 cellules se sont avérées trop mortelle avec larves meurent suite à une infection de toutes les souches dont les souches moins virulentes, P60002 et 12 C. Les larves injectés avec P75010 et SC5314 a succombé à l’infection dans les 24h, ce qui suggère qu'une dose infectieuse plus modérée est appropriée pour déterminer les différences dans la virulence. Par conséquent, une dose infectieuse de 2.5x105 a été utilisée pour toutes les expériences ultérieures.
Pour démontrer la similitude dans la virulence entre murin et g. mellonella modèles de maladie systémique, nous dosés virulence de souches de SC5314 dérivé c. albicans encodage soit hétérozygote (un/α ou homozygote (un/-ou Α /-) locus MTL . Infectionà MTL hétérozygotes de la SC5314 ou de son bagage génétique prototrophe de dérivés BWP17 de g. mellonella produit des taux élevés de mortalité par rapport aux animaux PBS-injecté. Les trois quarts des larves contrôle ont survécu au jour 8 par rapport à la perte de plus de la moitié de tous les animaux c. albicans injecté dans les 3 jours après l’infection (dpi) qui a encore augmenté à 8 dpi (Figure 3A, 3 b). Infectionà BWP17 imbibé de létalité de c. albicans dans ce modèle (survie de 27 % par rapport à 4 % de survie en SC5314 MTL hétérozygotes à 8 points par pouce ; Figure 3 C, 3D). G. mellonella larves infectées par MTLα/variétés ont survécu beaucoup plus longtemps par rapport aux souches parentales hétérozygotes MTL (log-rank test, SC5314 ; p = 0,0006, BWP17 ; p = 0,0002). Fait intéressant, virulence de MTLacellules/-C. albicans correspondants à son homologue hétérozygote MTL dans les milieux de la SC5314 et BWP17. Ainsi, la configuration de MTL a-t-il une influence sur la virulence de c. albicans avec MTLα/variétés affichant tuer une diminution par rapport àun/α MTLou MTLa/-les cellules.
Figure 1 . Vue d’ensemble de la procédure de l’infection. (A) un diagramme met en évidence les éléments clés de la procédure de l’infection dont vous passez votre commande et le stockage des larves, préparation de la culture de l’infection et l’injection. (B) images représentatives indiquent des conditions d’entreposage en bonne santé, préparation de l’entretien de l’espace, injection et les larves infection suite à une infection. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Les effets des procédures de g. mellonella infection. (A) contrôles de PBS étaient infectés soit dès votre arrivée (PBS-D0, bleu), soit après 10 jours (PBS-D10, rouge). (B) images représentatives en évidence mort et décoloration des larves. (C) une séries d’images des plaques de l’infection en détail les effets de l’injection avec du PBS (au milieu) ou avec SC5314 (en bas) par rapport aux larves non infectées (en haut) les jours 1, 3, 5 et 7 après injection. (D) effets de Dosage sont affichés dans une collection d’isolats cliniques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . La MTLun allèle favorise la mort de c. albicans de g. mellonella. Locus MTL hétérozygotes (un/α) et homozygotes (un/- et α /-) SC5314 (A) et BWP17 (C) dérivés sont tracés pour la mortalité des larves pendant huit jours. Intervalles de confiance sont tracés pour chaque SC5314 (B) et BWP17 (D) souche dérivée pour mettre en évidence la cohérence dans la cinétique de la mortalité des larves à travers des expériences. La moyenne (ligne continue) est tracée avec des écarts-types (remplis dans l’espace) pour trois réplicats biologiques de 10 larves chaque. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Souche de Candida | Souche parentale | Génotype | MTL | Référence |
| 1ERMAI | SC5314 | Isolat clinique de Candida albicans | a/α | Wu et al., 2007 |
| MAI6 | P60002 | Isolat clinique de Candida albicans | un/une | Wu et al., 2007 |
| 11 | P75010 | Isolat clinique de Candida albicans | a/α | Wu et al., 2007 |
| 15 | 12C | Isolat clinique de Candida albicans | un/une | Wu et al., 2007 |
| MAY61 | SC5314 | MTLa:: SAT1 | Α /- | Cette étude |
| MAY71 | SC5314 | MTLα:: SAT1S tac1::TAC1-GFP-HYGR | un /- | Cette étude |
| MAY313 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-arg4-ura3-BN sir2::his1/sir2::dpl200 | a/α | Cette étude |
| MAY314 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-BN sir2::HIS1/sir2::dpl200 | Α /- | Cette étude |
| MAY315 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-BN sir2::HIS1/sir2::dpl200 | un /- | Cette étude |
Table 1. C. albicans strains utilisés dans cette étude.
| Composante variable | Suggéré de contrôle | Référence |
| Âge au moment de l’injection de larves | Réduire le temps entre l’arrivée de ver et inoculation | Cette étude |
| Taille de larves au moment de l’injection | Garantir la cohérence lors de la sélection vers | Fuchs et al., 2010 |
| Santé de larves au moment de l’injection | Commander vers lors de température modérée, utiliser immédiatement à l’arrivée | Cette étude |
| Dose infectieuse avec c. albicans | Sélectionnez une concentration infectieuse qui présente le plus large éventail de résultats | Cette étude |
| Réponse de larves à injection | Effectuer des contrôles injection PBS aux côtés de worms avec aucune injection | Hirakawa et coll. 2015 |
Le tableau 2. Considérations en ce qui concerne g. mellonella infection.
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Discussion
Le modèle de teigne g. mellonella se présente comme un outil efficace pour l’analyse rapide et reproductible de la virulence de c. albicans . Ce protocole détaillé s’appuie sur une prestation uniforme d’une dose infectieuse définie au même endroit dans un lot de larves. Dose infectieuse a un impact profond sur la mortalité mellonella g. considérant que l’utilisation de larves entre leur arrivée et les dix jours suivant la réception produit des résultats similaires. Perte de l’allèle c. albicansMTLun se traduit par une diminution virulence conforme aux expériences antérieures chez les souris bien que la perturbation de l’allèle α MTLn’altère pas la mort des larves.
Le résultat d’infections de g. mellonella peut être touché par le protocole expérimental. Contrairement aux modèles vertébrés de l’infection, petite variation dans le site d’injection, le volume de l’inoculum et taille de l’inoculum peut-être avoir une incidence des interprétations des données. Infections par un nombre croissant de cellules de c. albicans a conduit à une plus grande et plus rapide de la morbidité des larves infectées. À un certain moment, injecter trop c. albicans semble capable d’un écrasant les défenses de l’hôte conduisant à une mort rapide de l’hôte, éventuellement par le biais de choc toxique. Cependant, SC5314 a été constamment la souche plus virulente à toutes les doses, suivi par 12C et puis les autres souches. Ainsi, les paramètres d’infection ont un impact profond sur la cinétique absolue des infections mais peuvent encore fournir des estimations de virulence relative. Les travaux préalable au sein de ces expériences nouvelles démontré l’importance de se laver soigneusement les cellules de Candida . Résiduelle YPD inclus dans le bolus injection significativement diminue la survie des larves (données non présentées).
Santé de ver est une variable critique lorsqu’il procède à des expériences de g. mellonella . Larves transportées à l’aide de sous-normes plein été souvent arrivent prématurément vieilli ou stressé, recouvert de taches noires, avec viabilité réduite. Aucun rôle important pour la taille des larves sur la morbidité n’a déjà été observée bien qu’expériences décrites ici axé sur l’analyse des larves de masse à peu près équivalent. Larves saines et des larves de contrôle PBS doivent toujours être exécutées aux côtés de groupes d’infection pour tenir compte de tout changement dans la viabilité des larves entre réplicats biologiques effectués sur des jours distincts. G. mellonella infectées dix jours après que l’arrivée correspondait la cinétique des larves infectées immédiatement à la réception. Ainsi, un seul envoi des larves peut fournir suffisamment de matériel et de temps d’effectuer des expériences complets. Ces expériences s’est appuyé sur les 30 animaux par souche afin de déterminer les différences de virulence, qui est sensiblement plus d’animaux que généralement utilisé dans les modèles murins, résultant en une plus forte confiance des résultats observés11,27 , 28. ce modèle réduit également des préoccupations éthiques, du temps et des coûts par rapport aux modèles de vertébrés de l’infection. Ainsi, l’utilisation de larves de cire peut-être faciliter l’identification des effets plus faibles sur la virulence systémique est possible dans d’autres systèmes.
Mises en garde inhérentes au système g. mellonella existent qui limitent son utilité dans l’étude des interactions hôte-pathogène. Tout d’abord, g. mellonella n’ont pas un système immunitaire adaptatif et ne peut servir à enquêter sur l’antigénicité ou mémoire immunologique comme supérieur eucaryotes29. Le corps des larves est composé d’une cavité continue unique remplie d’hémolymphe, qui fonctionnent pour faire circuler des substances nutritives, signalisation des molécules, cellules immunitaires et des peptides antimicrobiens. Ces cellules immunitaires, hemocytes, se comportent de la même façon que les neutrophiles peuvent donc phagocyter, générer des rafales oxydatifs et sécrètent des enzymes lytiques après activation par le biais des pathogènes extracellulaires reconnaissance récepteurs30. Pourtant, cette fonction est un sous-ensemble des processus des cellules immunitaires innées au sein des systèmes de chordés qui ne reflètent pas entièrement toutes les activités de leucocytes. Un autre inconvénient majeur est le manque d’un assemblage de génome de g. mellonella bien que le génome a été séquencé récemment31. Par conséquent, on ignore l’ampleur de la diversité génotypique au sein de l’espèce et probablement la plupart fournisseurs expédient des populations génétiquement hétérogènes qui peuvent influer sur la mortalité dans l’ensemble des expériences. En outre, des techniques moléculaires n’existent pour l’organisme et compliquer toute tentative visant à disséquer les contributions d’hôte à la pathogenèse. Pourtant, résultats de virulence cohérent suite à une infection à c. albicans à travers des expériences, vendeurs, temps et laboratoires prend en charge leur utilité dans les questions fondamentales de la pathogénicité.
Perte de MTLun réduit de virulence de c. albicans par rapport à MTL hétérozygotes et α la MTLhomozygote. Cette tendance est conforme aux travaux préalable effectuée à l’aide de modèles murins de virulence systémique26. Contrairement aux modèles murins, perte de MTLα n’altère pas la virulence par rapport à la MTLun/α souche parentale. L’écart entre ces résultats n’est pas clair, mais peut inclure des composants de l’immunité adaptative qui ne figurent pas dans les organismes invertébrés. Alternativement, une virulence accrue associée à MTL hétérozygotie peut être attribuée uniquement à l’allèle MTLα en SC5314, potentialisant la nécessité d’évaluation à travers de multiples origines de souche. Par conséquent, nous suggèrent un rôle différentiel pour la virulence entre les deux allèles MTL .
Dans l’ensemble, le modèle de g. mellonella sert de modèle rapid et reproductible pour évaluer la candidose systémique. Autres lectures de la virulence peuvent être dosés avec ce modèle, y compris la prévalence fongique en ensemençant des larves homogénat de colonies formant des unités (UFC)11 ou bioluminescence, qui fournit également la localisation fongiques32. À l’avenir, ce modèle peut être étendu pour évaluer les caractéristiques de virulence des autres espèces de Candida comme pharmacorésistance élevée dans le nouvellement émergentes auris Candida espèces33. Poursuite du développement d’outils pour visualiser des lymphocytes dans g. mellonella interagissant avec l’infection à Candida, lignées consanguines teigne afin de réduire la variabilité des résultats des infections et la visualisation du processus infectieux via journaliste Candida lignes34 va affiner ce modèle de la maladie et permettre des investigations plus profondes de in vivo interactions hôte-pathogène.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs aimerait l’aide de Pamela Washington et Leah Anderson dans l’obtention de Galleria mellonella devant servir à cette étude.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Snackworms.com | Buy twice as many worms as expected to use | |
| 10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe | Hamilton | 80000 | |
| Petri dish, 100X15 mm, 500 pack | Fisher | FB0875712 | |
| Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack | VWR | 87003-294 | |
| Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL | VWR | 97062-818 | |
| Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL | Millipore Sigma | EM-EX0276-1S | |
| autoclaved ddH2O |
References
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