Summary
Galleria Mellonella dient als ein Wirbellosen Modell für disseminierter Candidiasis. Hier beschreiben wir die Infektion Protokoll und unterstützende Daten für das Modell Wirksamkeit.
Abstract
Candida -Spezies sind häufige Pilzinfektionen Kommensalen des Menschen besiedeln, Magen-Darm-Trakt, Haut und Schleimhaut-Oberflächen. Unter bestimmten Bedingungen kann Candida überwuchern ihre natürliche Nischen wodurch schwächenden Schleimhaut Infektionen als auch lebensbedrohliche systemische Infektionen, sind ein wichtiger Schwerpunkt der Untersuchung wegen der damit verbundenen hohen Sterblichkeitsraten. Tiermodelle der disseminierten Infektion gibt es für Fortschreiten der Krankheit zu studieren und die Merkmale der Candida Pathogenität seziert. Von diesen bietet die Galleria Mellonella Waxworm Infektionsmodell ein kostengünstige experimentelles Werkzeug für Hochdurchsatz-Untersuchungen der systemischen Virulenz. Vielen anderen bakteriellen und Eukaryoten Krankheitserregern sind effektiv in G. Mellonella , Pathogenität, verstehen untersucht worden, so dass es eine weithin akzeptierte Modellsystem. Jedoch kann Variation in der Methode verwendet, um G. Mellonella infizieren verändern phänotypischen Ergebnisse und Interpretation der Ergebnisse erschweren. Hier beschreiben wir die vor- und Nachteile des Modells Waxworm zu studieren systemischen Candida -Pathogenese und detail einen Ansatz zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit. Unsere Ergebnisse markieren Sie den Bereich der Sterblichkeit Kinetik in G. Mellonella und beschreiben Sie die Variablen, die diese Kinetik modulieren können. Schließlich steht diese Methode als eine ethische, schnelle und kostengünstige Ansatz zur Virulenz in einem Modell von disseminierter Candidiasis zu studieren.
Introduction
Candida -Spezies sind gemeinsame menschliche Kommensalen, die in der Lage als opportunistische Krankheitserreger in Schwellenländern sind stark immungeschwächten und Dysbiotic Patienten. Obwohl viele Candida -Spezies Krankheit verursachen können, ist C. Albicans die am weitesten verbreitete Ursache von disseminierter Candidose1,2. Systemische Erkrankung ergibt sich aus C. Albicans Zugriff auf den Blutkreislauf durch entweder direkte Penetration der bisher restriktiven Host Barrieren oder Einführung in chirurgischen Websites und andere Verstöße gegen die Körper-3. Candida -Spezies nutzen eine Reihe von pathogenen Prozessen, systemische Erkrankung innerhalb des Hosts, einschließlich Filamentierung, Biofilmbildung Immunzelle ausweichen und entkommen und Eisen4Aufräumvorgang zu verursachen. In-vitro- Methoden existieren um individuelle pathogenen Mechanismen zu untersuchen, aber Tiermodellen weiterhin die beste Option, um die Gesamtheit der Krankheit Ergebnis5,6untersuchen. Die bisherige Forschung hat viele Instanzen der vielversprechenden in-vitro- Untersuchungen der Virulenz zu reproduzieren in Vivo7,8detaillierte. So, Tiermodelle sind erforderlich, um die Virulenz zu bewerten in-vivo. Die meisten Krankheitsmodelle setzen auf Mäuse, als Surrogat für Infektionen beim Menschen trotz C. Albicans Unfähigkeit, natürlich murinen Systeme besiedeln als Kommensalen9dienen. Wirbellosen Modelle von disseminierter Candidiasis gehören der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans, die Frucht zu fliegen, Drosophila Melanogasterund Waxworm Galleria Mellonella, obwohl Bedenken über grundsätzliche Unterschiede in grundlegende Physiologie haben Host Körpertemperaturen und Expositionswege ihre breite Akzeptanz10,11. behindert
Vor kurzem wurde die G. Mellonella Waxworm Infektionsmodell, Modell Pathogenität einer Vielzahl von bakteriellen und pilzlichen Krankheitserregern12,13,14übernommen. Vorteile dieses Modells sind die relativ geringen Kosten, erhöhter Durchsatz, Benutzerfreundlichkeit und ethische Bedenken bezüglich tierischen Wohltätigkeit gegenüber murinen Modellen reduziert. Für Forscher bedeutet dies höhere Fähigkeit, mehrere Variablen, stärkere Konfidenzintervalle, schnellere experimentieren und Umgehung des tierischen Protokolle zu testen. G. Mellonella diente als Plattform, um schnell beurteilen, C. Albicans Virulenz nach Störung der Gene, die erforderlich für Biofilm-Bildung, Filamentierung und gen-Verordnung über klinische Isolate11,15 ,16. Jüngste Studien haben Untersuchung antimykotische Wirksamkeit mit G. Mellonella bewerten die Pharmakokinetik von Drogetätigkeit und Widerstand unter in-Vivo -Einstellungen, die sonst schwierig und zeitaufwendig sind integriert 17,18. Jedoch haben Studien von C. Albicans Virulenz in G. Mellonella kompliziert durch angeblich hohe Variation innerhalb Experimente und inkonsistente Protokolle zwischen Forschungsgruppen, die unterschiedliche Virulenz Phänotypen erzeugen zwischen Mäusen und Waxworms11,13,19,20,21. Hier beschreiben wir eine G. Mellonella Protokoll zur Standardisierung von C. Albicans Infektionen, Erhöhung der Reproduzierbarkeit in Virulenz Experimente, und Übereinstimmung mit den zuvor beschriebenen Studien der Virulenz in Murine zu demonstrieren Modelle.
Frühere Studien gezeigt, dass die Paarung Typ-wie (MTL) Locus auf Chromosom 5 C. Albicans Zelle Identität und Kompetenz ähnlich Saccharomyces Cerevisiae und andere Ascomycete Pilze22Paarung regelt. Die Mehrheit der C. Albicans Isolate sind heterozygot MTL Locus, Codierung eines jeden der MTLein und MTLα Allele(MTL/α), und sind folglich steril15, 23 , 24. Verlust eines MTL Allele durch Verlust der Heterozygotie (LOH) oder Mutation führt zu homozygoten MTLein oder MTL-α-Stämme, die einen phänotypischen Wechsel von der sterilen "weiße" Zustand zu unterziehen, können die Paarung zuständigen "undurchsichtig" Staat25. Bisherigen Arbeit hat hervorgehoben, dass Verlust der Heterozygotie MTL Virulenz in murinen Modellen einer systemischen Infektion über anderen Stamm Hintergründe26reduziert. Hier zeigen wir das G. Mellonella Modell für disseminierter Candidose mit genetisch ähnliche experimentelle können Sie den Beitrag der MTL Heterozygotie, Virulenz in G. Mellonelladarzustellen. Wir zeigen, dass MTL Konfiguration beeinflusst C. Albicans Pathogenität, wo MTLα Stämme waren weniger virulenten sowohl in Bezug auf MTL/α MTLein Zellen, ähnlich wie Erkenntnisse in murinen Infektion Modell26.
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Protocol
Alle beschriebene Methoden setzen auf Einsatz von Wirbellosen Gastgeber und bedürfen keiner Zustimmung der institutionellen Animal Care und verwenden Committee (IACUC).
1. Galleria Mellonella Waxworm Larven
- Bestellen Sie Larven von Großhändlern und Lieferanten, die nicht einzuführen, Hormone, Antibiotika oder andere Behandlungen für die Larven und die sind in der Lage zu versenden und liefern lebende Exemplare.
- Achten Sie darauf, alle Larven vom gleichen Lieferanten im Laufe des Experimentierens zu erwerben. Seien Sie vorsichtig wenn Sie Larven während der Sommermonate zu bestellen, als Temperaturen über 30 ° C Larven Rentabilität verringern.
- Überwachen von Temperaturen über der erwarteten Versandweg und Versand- und Lieferbedingungen entsprechend zu planen oder wählen Sie Expressversand ihrer Exposition gegenüber Umweltbedingungen zu minimieren.
- Wenn Larven ankommen, überprüfen Sie jedes Containers um sicherzustellen, dass tragfähige, gesunde Larven vorhanden sind. Gesunde Larven werden unter das Bettzeug, Umzug, völlig untergetaucht werden und besitzen eine helle gelb/rote Färbung mit wenigen Larven mit schwarzen Flecken oder Verfärbungen am Körper entlang.
- Larven in ihren Behälter in einem belüfteten Raum bei Raumtemperatur (25 ° C) aufbewahren. Je nach dem ursprünglichen Zustand der Larven können sie bis zu zwei Wochen verwendet werden.
(2) Kultur Vorbereitung auf Galleria Mellonella Infektion
Hinweis: Richtige Lab Kleidung sollte während dieser Teil des Protokolls darunter Handschuhe, Kittel und Schutzbrille getragen werden.
- Stellen Sie Hefe Pepton Traubenzucker (YPD) Flüssigkeit und Agar-Platten. 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 70 % Ethanol Lösungen vorzubereiten.
- Wachsen Sie C. Albicans -Stämme in 3 mL frische YPD in standard Kultur Röhren auf einer rotierenden Trommel mit mittlerer Geschwindigkeit und 30 ° c über Nacht injiziert werden
- Drehen Sie Zellen mit 2.500 x g für 5 min in einer Tischplatte Zentrifuge nach unten. Überstand, wobei Sie darauf achten, nicht zu stören das Zelle-Pellet abgießen.
- Aufschwemmen Sie Zellen vollständig in 5 mL 1 X PBS durch wiederholte Pipettieren oder aufschütteln. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Wiederfreisetzung Zellen in PBS zweimal mehr Entfernung aller Kultur Medien sicherzustellen.
- Aufschwemmen Sie nach dem letzten Waschen Zellen in 1 mL PBS und übertragen Sie sie auf einem Microcentrifuge Schlauch.
- Führen eine Reihe von seriellen Verdünnungen in PBS generieren eine 1: 100, 1:1 000 und 1: 100.000 Verdünnungsreihe.
Hinweis: Alternative Verdünnungen möglicherweise notwendig, um gewünschte Zellenzahlen erreichen.- Mit einem Hemocytometer, zählen Sie Zellen aus der 1: 100 oder die 1:1,000 Verdünnung. In den meisten Fällen bietet die 1:1,000 Verdünnung die entsprechende Zelle für C. Albicans Kulturen zählt.
- Berechnen Sie die Gesamtkonzentration von Zellen innerhalb der ursprünglichen Kultur über die Raster-Mathematik der Hemocytometer, mit dem Ziel, zwischen 30-300 Zellen in dem zentralen 5 x 5 Raster gezählt werden. Als Alternative kann ein automatisierter Zelle Zähler verwendet werden; Nutzung der optischen Dichte bestimmen Zellenzahlen wird abgeraten, als Zelle Morphologie (Größe, Form, etc.) kann jedoch deutlich seine Genauigkeit beeinflussen.
- Mit der gemessenen Zellenzahlen stellen Sie eine neue Verdünnung der 2.5x107 Zellen/mL in 1 X PBS in einem Microcentrifuge Schlauch. Diese Verdünnung dient als Grundlage für jede Impfung von G. Mellonella mit C. Albicans. Jeder Injektion benötigen 10 µL dieses Inokulum für eine infektiöse Dosis von 250.000 C. Albicans Zellen.
- Bestätigen Sie die Richtigkeit der die infektiöse Dosis durch Ausplattieren das korrekte Volumen der Verdünnung 1: 100.000 für 100 Kolonie bildende Einheiten (KBE) auf YPD Agar für jede Kultur in Infektion verwendet werden.
- Graf Zellplatten aus Schritt 2.7 für 48 Stunden (h) bei 30 ° C inkubieren und die Anzahl der Kolonien pro Platte. Zwischen 80 und 120 Kolonien bildet einen akzeptablen Bereich für Genauigkeit in das Inokulum.
3. Infektion der Galleria Mellonella Larven mit Candida Kulturen
Hinweis: Richtige Lab Kleidung sollte während dieser Teil des Protokolls darunter Handschuhe, Kittel und Schutzbrille getragen werden.
- Zwei separate Mikrozentrifugenröhrchen 1 mL 100 % Ethanol und 1 mL 1 X PBS hinzufügen. Ethanol und PBS wird verwendet um die Injektionsnadel zwischen Infektionen zu waschen.
- Verteilen Sie eine kleine Menge Waxworm Bettwäsche in einem leeren, sterile Petrischale 100 x 15 mm, die die Larven nach Impfung für jede unabhängige Belastung beherbergen wird. Ergänzung der Einstreu begrenzt Einhaltung der Toten G. Mellonella Larven an die Oberfläche der Petrischale.
- Eine 26 G, 10 µL Spritze durch aufgreifen und expunging 10 µL 70 % Ethanol dreimal gefolgt von drei Wäschen mit 10 µL 1 X PBS zu sterilisieren. Wirbel der Inokulation Verdünnung von C. Albicans und nehmen 10 µL der Kultur. Sicherzustellen Sie, dass keine Luftblasen in der Spritze als Injektion von Luft Tod fördert und nachgelagerte Analyse zu erschweren.
- Öffnen Sie einen Behälter mit G. Mellonella Larven und drehen Sie vorsichtig Bettwäsche mit einem Finger um Larven zu entdecken. Wählen Sie Larven, die bei guter Gesundheit sind, wie durch aktive Bewegung, eine gelb/rote Farbe und einen Mangel an schwarze Pigmentierung auf den Larven Körper identifiziert. Diese Larven sind von ähnlicher Größe über die volle experimentelle festzusetzen.
- Nehmen Sie eine einzelne Larven und halten Sie ihn sanft zwischen den Index/Mittelfinger und Daumen ähnlich wie einen Stift halten. Rollen Sie die Larven auf den Rücken, so dass die Beine nach oben zeigt. Halten Sie die volle Länge des Körpers zwischen die Finger und Daumen, so dass die Larven ist nicht in der Lage, Rollen oder ziehen weg von der Injektion.
Hinweis: Falls gewünscht, Sterilisieren der Injektionsstelle mit einem Wattestäbchen, getränkt in 100 % igem Ethanol. - Drehen Sie die Spritze so Abschrägung der Nadel nach oben zeigt, und fügen Sie langsam die Nadelspitze unter anderem die Länge der Fase in den Körper an der Kreuzung mit dem hintersten linken Bein. Stellen Sie sicher, dass die Nadel dringt in den Körper und nicht einfach den Körper der Larven nach innen drücken. Nicht mit Gewalt in den Körper eindringen, da die Nadel vollständig die Larven schnell durchdringen kann. Leichtes Anheben mit der Nadel werden entsprechende eindringen bestätigen. Injizieren Sie das volle 10 µL Candida Inokulum zu und extrahieren Sie die Nadel.
- Wiederholen Sie Schritt 3.3-3.5 für jede Larven. Zelle, Abrechnung, Wirbel die Candida zu verhindern Kulturen für die Impfung nach jeder dritten Injektion. Als Kontrolle eine Reihe von G. Mellonella mit 10 µL 1 X PBS zu injizieren.
- Co Haus 10 Larven aus der gleichen Candida -Kultur in jeder 100 x 15 mm Petrischale nach Inokulation eingespritzt. Acht Tage, die Larven alle 24 h zu überprüfen, um Tod zu überwachen inkubieren Sie Larven bei 37 ° C.
- Sterblichkeit zunächst durch dunkle Pigmentierung, die Bildung von schwarzen Flecken oder Einrichtungen, zu bewerten und ein Mangel an Bewegung. Um die Sterblichkeit zu bestätigen, benutzen Sie eine Pinzette sanft sterbende Larven auf den Rücken Rollen und leicht stecken die Larven Unterseite mit der Pinzette. Non-Reaktionsfähigkeit wie durch einen Mangel an sichtbaren Körper oder Bein Bewegung beobachtet wird bewertet, wie der Tod und die Larven sind aus der Petrischale entfernt.
- Sterblichkeit der Larven über den zeitlichen Verlauf aufzeichnen. Larven, die beginnen in Motten verpuppen können in die Analyse einbezogen werden, aber sollte entfernt werden, wenn sie beginnen zu mausern. Verpuppung Larven können vom Endpunkt Analyse zensiert werden, da die Virulenz Unterschiede zwischen Larven und Puppen unklar sind.
- Statistischen Signifikanz mit Mantel-Cox statistischen Test zu bewerten.
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Representative Results
Hier zeigen wir eine reproduzierbare Methode für die Verwendung von G. Mellonella Waxworms ein disseminierter Candidiasis Modell einer Infektion mit C. Albicansuntersuchen. Die fachgerechte Lagerung, Wartung und Auswahl der Larven für eine Infektion sind wesentlicher Bestandteil der Versicherung Reproduzierbarkeit G. Mellonella Sterblichkeit (Abb. 1A). Gesunde Larven, die aktiv sind, haben eine helle Farbe gelb/tan, und fehlende schwarze Flecken auf dem Körper sollte verwendet werden, für dieses System und sind in der Regel tragbar für Infektion bis zu zwei Wochen nach Ankunft. Um eine potenziell verwirrende Effekte von G. Mellonella Physiologie zu minimieren, wurden Larven von ähnlicher Größe und Gewicht ausgewählt. Eine gut gemischte Inokulum und konsequente Injektion an der gleichen Lokalisation des Körpers Larven stehen auch als wichtige Variablen bei der Förderung der Reproduzierbarkeit zwischen Experimente. Bilder zu präsentieren Wartung von infizierten Larven durch die Dauer des Experimentierens (Abbildung 1B).
Zur Bewertung der Auswirkungen des Alters der Larven auf Virulenz wurden separate PBS Kontrolle Infektionen mit Larven entweder Null oder zehn Tage nach der Ankunft durchgeführt. Keinen signifikanten Unterschied in der Kinetik von G. Mellonella Tod gab es zwischen diesen Gruppen (Abbildung 2A). Charakteristische Zeichen der Krankheit entstand in Larven aus beiden Gruppen, die erlag der Infektion; die ursprünglich gelb/rote Färbung der Larven wurde verfärbt und wich schwarzen Flecken vor dem Totalverlust der Motilität und schließlich zum Tod (Abbildung 2B). Infektion mit C. Albicans beschleunigt diesen Prozess der Verfärbung und Morbidität aber ändert nicht deutlich die Kaskade der phänotypischen Marker zum Tod im Vergleich zu nicht infizierten Larven oder PBS injiziert Larven (Abbildung 2C).
Die infektiöse Dosis wirkt sich auch deutlich Sterblichkeit Kinetik von G. Mellonella Infektionen. Zur Beurteilung der Auswirkungen von C. Albicans Inokulum Größe wir G. Mellonella mit vier verschiedenen klinischen Isolaten infiziert (12 C, P60002, P75010 und SC5314: Tabelle 1) in drei verschiedenen Dosierungen. Larven mit SC5314 infiziert angezeigt Mortalität bei allen Dosen, Einklang mit erhöhter Pathogenität dieser Isolat im Vergleich zu den meisten anderen innerhalb des Experiments (Abbildung 2D) verwendet. Mehr Larven erlag Infektion mit 1.0 x 105 SC5314 oder 12 C Zellen im Vergleich zu 1.0 x 104 Zellen. Die höchste Dosis von 1,0 x 106 Zellen erwies sich übermäßig tödlich mit Larven sterben nach Infektion aller Sorten, einschließlich die weniger virulenten Isolate, P60002 und 12 C. Larven mit P75010 und SC5314 injiziert erlag der Infektion innerhalb von 24 h, was nahelegt, dass sich Unterschiede in Virulenz bestimmen eine gemäßigtere infektiöse Dosis eignet. Infolgedessen wurde eine infektiöse Dosis von 2.5x105 für alle nachfolgenden Experimente verwendet.
Um Ähnlichkeit in Virulenz zwischen Murine und G. Mellonella Modelle der systemischen Erkrankung zu demonstrieren, untersucht wir Virulenz des SC5314 abgeleitet C. Albicans Stämme Codierung entweder heterozygot (ein/α oder homozygot (/-oder Α /-) MTL -Loci. Infektion von G. Mellonella mit MTL heterozygoten aus der SC5314 oder ihrer prototrophic Derivative BWP17 genetischen Hintergrund produziert hohe Rate von Sterblichkeit, im Vergleich zu Tieren PBS injiziert. Drei Viertel der Kontrolle Larven überlebten bis Tag 8 im Vergleich zu einem Verlust von mehr als die Hälfte aller C. Albicans injiziert Tiere innerhalb von 3 Tagen post-Infektion (dpi), die bei 8 dpi (Bild 3A, 3 b) weiter erhöht. Infektion mit BWP17 gedämpft C. Albicans Letalität in diesem Modell (27 % überleben im Vergleich zu 4 % überleben in SC5314 MTL -heterozygot mit 8 dpi; Abbildung 3 C, 3D). G. Mellonella Larven infiziert mit MTLα /-Stämme deutlich länger leben im Vergleich zu den MTL heterozygot elterliche Stämme (Log-Rank-Test, SC5314; p = 0,0006, BWP17; p = 0,0002). Interessanterweise abgestimmt Virulenz von MTLein/C. Albicans Zellen MTL heterozygot Pendant in der SC5314 und BWP17 Hintergrund. So MTL Konfiguration C. Albicans Virulenz mit MTLα /-Stämme anzeigen verringerte Tötung im Vergleich zu MTL/αoder MTLein/-Zellen beeinflussen.
Abbildung 1 . Überblick über Verfahren der Infektion. (A) ein Flussdiagramm zeigt die wichtigsten Elemente des Verfahrens Infektion einschließlich Bestellung und Lagerung von Larven, Infektion Kultur Vorbereitung und Injektion. (B) repräsentative Bilder zeigen gesunde Lagerbedingungen, Vorbereitung der Infektion Raum, Injektions- und Larven Wartung nach Infektion. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Die Auswirkungen von G. Mellonella Infektion Verfahren. (A) PBS Kontrollen wurden infiziert, entweder unmittelbar nach der Ankunft (PBS-D0, blau) oder nach 10 Tagen (PBS-D10, rot). (B) repräsentative Bilder markieren Sie Larven Verfärbung und Tod. (C) eine Bilderserie der Infektion Platten ausführlich die Auswirkungen der Versenkung mit PBS (Mitte) oder mit SC5314 (unten) im Vergleich zu nicht infizierten Larven (oben) an den Tagen 1, 3, 5 und 7 nach der Injektion. (D) Dosierung Effekte sind in einer Sammlung von klinischen Isolaten gezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Die MTLein Allel fördert C. Albicans Tötung von G. Mellonella. MTL Locus heterozygot (ein/α) und homozygot (ein/- und α /-) SC5314 (A) und BWP17 (C) -Derivate sind für die Sterblichkeit der Larven über acht Tage aufgetragen. Konfidenzintervalle sind für jede SC5314 dargestellt (B) und BWP17 (D) abgeleitete Sorte um Konsistenz in der Kinetik der Sterblichkeit der Larven über Experimente zu markieren. Der Mittelwert (durchgezogene Linie) ist für drei biologische Wiederholungen von 10 Larven mit Standardabweichungen (im Raum gefüllt) aufgetragen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Candida-Belastung | Elterlichen Belastung | Genotyp | MTL | Referenz |
| MAI1 | SC5314 | Candida Albicans klinische isolate | a/α | Wu Et Al. 2007 |
| MAY6 | P60002 | Candida Albicans klinische isolate | a/a | Wu Et Al. 2007 |
| MAY11 | P75010 | Candida Albicans klinische isolate | a/α | Wu Et Al. 2007 |
| MAY15 | 12C | Candida Albicans klinische isolate | a/a | Wu Et Al. 2007 |
| MAY61 | SC5314 | MTLa:: SAT1 | Α /- | Diese Studie |
| MAY71 | SC5314 | MTLα:: SAT1S tac1::TAC1-GFP-HYGR | ein /- | Diese Studie |
| MAY313 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-arg4-ura3-BN sir2::his1/sir2::dpl200 | a/α | Diese Studie |
| MAY314 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-BN sir2::HIS1/sir2::dpl200 | Α /- | Diese Studie |
| MAY315 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-BN sir2::HIS1/sir2::dpl200 | ein /- | Diese Studie |
Tabelle 1. C. Albicans sZüge, die in dieser Studie verwendeten.
| Variable Komponente | Empfohlene Kontrolle | Referenz |
| Larven Alter zum Zeitpunkt der Injektion | Minimieren Sie die Zeit zwischen Wurm an- und Impfung | Diese Studie |
| Larven Größe zum Zeitpunkt der Injektion | Sicherstellung der Konsistenz bei der Auswahl der Würmer | Fuchs Et Al. 2010 |
| Larven Gesundheit zum Zeitpunkt der Injektion | Bestellen Sie Würmer bei mäßiger Temperatur zu, verwenden Sie sofort bei der Ankunft | Diese Studie |
| Infektiöse Dosis mit C. albicans | Wählen Sie eine infektiöse Konzentration die unterschiedlichsten Ergebnisse präsentiert | Diese Studie |
| Larven als Reaktion auf die Injektion | Durchführen Sie PBS-Injektion-Kontrollen neben Würmer mit keine Injektion | Hirakawa Et Al. 2015 |
Tabelle 2: Überlegungen in Bezug auf G. Mellonella Infektion.
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Discussion
G. Mellonella Waxworm Modell steht als ein wirksames Instrument für die schnelle und reproduzierbare Analyse von C. Albicans Virulenz. Dieses ausführliche Protokoll stützt sich auf konsistente Bereitstellung einer definierten infektiöse Dosis an der gleichen Stelle über einen Stapel von Larven. Infektiöse Dosis hat tiefgreifende Auswirkungen auf die G. Mellonella Mortalität während der Verwendung von Larven zwischen ihren ersten Ankunft und zehn Tagen nach Erhalt zu ähnlichen Ergebnissen. Verlust von C. AlbicansMTLein Allel führt im Einklang mit früheren Experimenten an Mäusen verminderte Virulenz, obwohl Störungen des MTLα-Allels Larven Tod nicht verändert.
Das Ergebnis von G. Mellonella Infektionen kann durch das experimentelle Design stark belastet. Im Gegensatz zu Wirbeltieren Modelle der Infektion kann kleine Variation in der Injektionsstelle, Inokulum Volumen und Inokulum Größe Interpretation der Daten auswirken. Infektionen mit einer zunehmenden Zahl von C. Albicans Zellen führte zu größeren und schnelleren Morbidität der infizierten Larven. An einem bestimmten Punkt erscheint die Injektion zu viele C. Albicans kann überwältigend Host Verteidigung führt zum schnellen Tod des Wirtes, potentiell durch toxischen Schock. SC5314 war jedoch immer wieder die heftigsten Belastung bei allen Dosen, gefolgt von 12C, und dann die anderen Stämmen. Also können Infektion Parameter haben eine tief greifende Auswirkungen auf die absolute Kinetik der Infektionen aber noch Schätzungen der relativen Virulenz. Vor der Arbeit innerhalb dieser Experimente weiter gezeigt, wie wichtig es ist, die Candida -Zellen gründlich waschen. Verbleibende YPD enthalten in der Bolus Injektion deutlich verringert Larven Überleben (Daten nicht gezeigt).
Wurm-Gesundheit ist eine wichtige Variable, wenn G. Mellonella Experimente durch. Larven, die unter Verwendung der standard-Versand mitten im Sommer oft transportiert ankommen vorzeitig im Alter oder gestresst sind, bedeckt mit schwarzen Flecken, mit verringerten Lebensfähigkeit. Keine entscheidende Rolle für die Größe der Larven auf Morbidität wurde bisher beobachtet, obwohl die hier beschriebenen Experimente konzentrierte sich auf Larven entspricht in etwa Masse prüfen. Gesunden Larven und PBS Kontrolle Larven sollte immer neben Infektion Gruppen für Änderungen in Larven Lebensfähigkeit auf biologische Wiederholungen an separaten Tagen ausgeführt Konto ausgeführt werden. G. Mellonella infiziert zehn Tage nach Ankunft der Kinetik der Larven infiziert sofort nach Erhalt abgestimmt. So kann eine einzige Sendung der Larven ausreichend Material und Zeit voller Experimente durchführen bieten. Diese Experimente stützte sich auf 30 Tiere pro Stamm, Unterschiede in der Virulenz, zu bestimmen, die deutlich mehr Tiere als in der Regel in murinen Modellen, was zu stärkeren Vertrauen der beobachteten Ergebnisse11,27 genutzt wird , 28. dieses Modell reduziert auch ethische Bedenken, Zeit und Kosten im Vergleich zu vertebrate Modelle der Infektion. So kann die Verwendung von Wachs Larven kleinere Auswirkungen auf systemische Virulenz identifizieren als bei anderen Systemen möglich ist.
Inhärente Einschränkungen zum G. Mellonella System gibt, die ihre Nützlichkeit bei der Untersuchung von Wirt-Pathogen Interaktionen zu begrenzen. Erstens G. Mellonella fehlt eine adaptive Immunsystem und kann nicht verwendet werden, um die Antigenität oder immunologisches Gedächtnis wie in höheren Eukaryoten29untersuchen. Der Körper der Larven besteht aus einem einzigen kontinuierlichen Hohlraum gefüllt mit Hämolymphe, welche Funktion Nährstoffe, Signalisierung Moleküle, Immunzellen und antimikrobielle Peptide zirkulieren. Diese Immunzellen, Hemocytes, können Verhalten sich ähnlich, Neutrophilen und daher phagozytieren, oxidativen Bursts zu generieren und sezernieren lytische Enzymen nach Aktivierung durch extrazelluläre Erreger Anerkennung Rezeptoren30. Diese Funktion ist jedoch eine Teilmenge der angeborenen Immunzelle Prozesse innerhalb Chordate Systeme, die nicht in vollem Umfang alle Leukozyten Aktivitäten widerspiegeln können. Ein weiterer großer Nachteil ist das Fehlen einer Genom-Versammlung für G. Mellonella , obwohl das Genom vor kurzem sequenzierten31 wurde. Infolgedessen das Ausmaß der genotypischen Vielfalt innerhalb der Arten ist nicht bekannt und wahrscheinlich die meisten Anbieter liefern genetisch heterogene Populationen, die Sterblichkeit über Experimente beeinflussen können. Darüber hinaus Molekulare Techniken nicht für den Organismus existieren und alle Versuche, Host Beiträge zur Pathogenese sezieren zu erschweren. Doch unterstützt konsequente Virulenz Ergebnisse nach Infektion mit C. Albicans über Experimente, Kreditoren, Zeit und Labs ihre Nützlichkeit in Grundfragen der Pathogenität.
Verlust von MTLein reduziert Virulenz von C. Albicans relativ MTL heterozygoten und MTLα homozygoten Hintergründe. Dieser Trend steht im Einklang mit früheren Arbeiten mit Maus-Modellen der systemischen Virulenz26durchgeführt. Im Gegensatz zu murinen Modellen ändern Verlust von MTLα Virulenz im Verhältnis zu den MTLein/α elterlichen Belastung nicht. Die Diskrepanz zwischen diesen Ergebnissen ist unklar, aber möglicherweise Bestandteile der adaptiven Immunität, die in wirbellosen Organismen fehlen. Alternativ kann erhöhte Virulenz zugeordnet MTL Heterozygotie nur MTLα Allel in SC5314, die Notwendigkeit einer Bewertung über mehrere Stamm Hintergründe potenzierende zugeschrieben werden. Daher empfehlen wir eine differenzierte Rolle für Virulenz zwischen die zwei MTL -Allel.
Insgesamt dient das G. Mellonella Modell als schnelle und reproduzierbare Modell zur Bewertung von Systemische Candidose. Andere Messwerte der Virulenz können mit diesem Modell einschließlich Pilzinfektionen Prävalenz durch Ausplattieren Larven Homogenat für Koloniebildenden Einheiten (KBE)11 oder Biolumineszenz, bietet auch Pilz Lokalisierung32untersucht werden. In der Zukunft dieses Modell erweitert werden, um die Beurteilung Virulenz Eigenschaften der anderen Candida -Spezies wie z. B. erhöhte Resistenzen in den neu entstehenden Auris Candida Spezies33. Weiterentwicklung von Werkzeugen, Lymphozyten in G. Mellonella Interaktion mit Candidazu infizieren zu visualisieren Inzucht Waxworm Linien, Variabilität in Infektionen Ergebnisse und Visualisierung von infektiösen Prozess über zu reduzieren Reporter Candida Linien34 weiter verfeinern dieses Modell von Krankheit und ermöglichen tiefere Untersuchungen in Vivo Wirt-Pathogen Interaktionen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Hilfe von Pamela Washington und Leah Anderson bei der Beschaffung von Galleria Mellonella für den Einsatz in dieser Studie bestätigen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Snackworms.com | Buy twice as many worms as expected to use | |
| 10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe | Hamilton | 80000 | |
| Petri dish, 100X15 mm, 500 pack | Fisher | FB0875712 | |
| Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack | VWR | 87003-294 | |
| Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL | VWR | 97062-818 | |
| Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL | Millipore Sigma | EM-EX0276-1S | |
| autoclaved ddH2O |
References
- Kauffman, C. A., et al. Prospective multicenter surveillance study of funguria in hospitalized patients. The National Institute for Allergy and Infectious Diseases (NIAID) Mycoses Study Group. Clinical Infectious Diseases. 30 (1), 14-18 (2000).
- Horn, D. L., et al. Epidemiology and outcomes of candidemia in 2019 patients: data from the prospective antifungal therapy alliance registry. Clinical Infectious Diseases. 48 (12), 1695-1703 (2009).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clinical Microbiology Reviews. 20 (1), 133-163 (2007).
- Sardi, J. C., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 1 10-24 (2013).
- Segal, E., Frenkel, M. Experimental in Vivo Models of Candidiasis. J Fungi (Basel). 4 (1), (2018).
- Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L. Animal models for candidiasis. Current Protocols in Immunology. 105, 11-17 (2014).
- Heymann, P., et al. The siderophore iron transporter of Candida albicans (Sit1p/Arn1p) mediates uptake of ferrichrome-type siderophores and is required for epithelial invasion. Infection and Immunity. 70 (9), 5246-5255 (2002).
- Priest, S. J., Lorenz, M. C. Characterization of Virulence-Related Phenotypes in Candida Species of the CUG Clade. Eukaryotic Cell. 14 (9), 931-940 (2015).
- Savage, D. C., Dubos, R. J. Localization of indigenous yeast in the murine stomach. J Bacteriol. 94 (6), 1811-1816 (1967).
- Ewbank, J. J., Zugasti, O. C. elegans: model host and tool for antimicrobial drug discovery. Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 300-304 (2011).
- Amorim-Vaz, S., Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. Examining the virulence of Candida albicans transcription factor mutants using Galleria mellonella and mouse infection models. Frontiers in Microbiology. 6, 367 (2015).
- Harding, C. R., Schroeder, G. N., Collins, J. W., Frankel, G. Use of Galleria mellonella as a model organism to study Legionella pneumophila infection. Journal of Visualized Experiments. (81), e50964 (2013).
- Jacobsen, I. D. Galleria mellonella as a model host to study virulence of Candida. Virulence. 5 (2), 237-239 (2014).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
- Hirakawa, M. P., et al. Genetic and phenotypic intra-species variation in Candida albicans. Genome Research. 25 (3), 413-425 (2015).
- Dunn, M. J., Kinney, G. M., Washington, P. M., Berman, J., Anderson, M. Z. Functional diversification accompanies gene family expansion of MED2 homologs in Candida albicans. PLoS Genetics. 14 (4), 1007326 (2018).
- Astvad, K. M. T., Meletiadis, J., Whalley, S., Arendrup, M. C. Fluconazole Pharmacokinetics in Galleria mellonella Larvae and Performance Evaluation of a Bioassay Compared to Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry for Hemolymph Specimens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).
- Mesa-Arango, A. C., et al. The non-mammalian host Galleria mellonella can be used to study the virulence of the fungal pathogen Candida tropicalis and the efficacy of antifungal drugs during infection by this pathogenic yeast. Med Mycol. 51 (5), 461-472 (2013).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Fuchs, B. B., O'Brien, E., Khoury, J. B., Mylonakis, E. Methods for using Galleria mellonella as a model host to study fungal pathogenesis. Virulence. 1 (6), 475-482 (2010).
- Kavanagh, K., Fallon, J. P. Galleria mellonella larvae as models for studying fungal virulence. Fungal Biology Reviews. 24 (1-2), 79-83 (2010).
- Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285 (5431), 1271-1275 (1999).
- Legrand, M., et al. Homozygosity at the MTL locus in clinical strains of Candida albicans: karyotypic rearrangements and tetraploid formation. Molecular Microbiology. 52 (5), 1451-1462 (2004).
- Lockhart, S. R., et al. In Candida albicans, white-opaque switchers are homozygous for mating type. Genetics. 162 (2), 737-745 (2002).
- Miller, M. G., Johnson, A. D. White-opaque switching in Candida albicans is controlled by mating-type locus homeodomain proteins and allows efficient mating. Cell. 110 (3), 293-302 (2002).
- Wu, W., Lockhart, S. R., Pujol, C., Srikantha, T., Soll, D. R. Heterozygosity of genes on the sex chromosome regulates Candida albicans virulence. Molecular Microbiology. 64 (6), 1587-1604 (2007).
- Herrero, A. B., et al. KRE5 gene null mutant strains of Candida albicans are avirulent and have altered cell wall composition and hypha formation properties. Eukaryotic Cell. 3 (6), 1423-1432 (2004).
- Hall, R. A., et al. The Mnn2 mannosyltransferase family modulates mannoprotein fibril length, immune recognition and virulence of Candida albicans. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003276 (2013).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Journal of Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
- Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infection and Immunity. 73 (7), 4161-4170 (2005).
- Lange, A., et al. Genome Sequence of Galleria mellonella (Greater Wax Moth). Genome Announcements. 6 (2), (2018).
- Krappmann, S. Lightning up the worm: How to probe fungal virulence in an alternative mini-host by bioluminescence. Virulence. 6 (8), 727-729 (2015).
- Chowdhary, A., Voss, A., Meis, J. F. Multidrug-resistant Candida auris: 'new kid on the block' in hospital-associated infections. Journal of Hospital Infection. 94 (3), 209-212 (2016).
- Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. Adaptation of a Gaussia princeps Luciferase reporter system in Candida albicans for in vivo detection in the Galleria mellonella infection model. Virulence. 6 (7), 684-693 (2015).
