Summary
Galleria mellonella fungerer som en virvelløse modell for spres candidiasis. Her vi detalj infeksjon protokollen og gi støttedata for modellens effektivitet.
Abstract
Candida arter er vanlig sopp commensals mennesker kolonisere huden, mucosal overflater, og mage-tarmkanalen. Under visse forhold kan Candida overgrow deres naturlige nisjene som resulterer i ødeleggende mucosal infeksjoner som vel som livstruende systemisk infeksjoner, som er av undersøkelse på grunn av deres tilknyttede høy dødelighet. Dyr modeller av spres infeksjonen eksisterer for å studere sykdomsprogresjon og dissekere karakteristikkene av Candida virusets. Av disse gir Galleria mellonella waxworm infeksjon modellen en kostnadseffektiv eksperimentelle verktøyet for høy gjennomstrømming undersøkelser av systemisk virulens. Mange andre bakterielle og eukaryotic smittsomme stoffer har vært effektivt studerte G. mellonella å forstå virusets, gjør det en allment akseptert modellsystem. Likevel, variasjon i måten du infisere G. mellonella kan endre fenotypiske resultater og komplisere tolkning av resultatene. Her skissere vi fordelene og ulempene av waxworm modellen å studere systemisk Candida patogenesen og detalj en tilnærming for å forbedre reproduserbarhet. Våre resultater markere utvalget av dødelighet kinetics i G. mellonella og beskriver variabler som kan modulerer disse kinetics. Til slutt, denne metoden står som en etisk, rask og kostnadseffektiv tilnærming til å studere virulens i en modell av spres candidiasis.
Introduction
Candida arter er vanlig menneskelige commensals som kan fremstår som opportunistisk patogener i alvorlig nedsatt immunforsvar og dysbiotic pasienter. Selv om mange Candida arter kan forårsake sykdom, er C. albicans den mest utbredte årsaken til spres candidiasis1,2. Systemisk sykdom skyldes C. albicans tilgang til blodet gjennom enten direkte gjennomtrengning av tidligere restriktive vert barrierer eller introduksjon kirurgiske områder og andre brudd på kroppen3. Candida arter benytte et spekter av patogene prosesser til systemisk sykdom i verten inkludert filamentation, biofilm formasjon, immun celle evasion og flukt og jern scavenging4. In vitro tilnærminger eksisterer for å undersøke personlige patogene mekanismer, men dyremodeller fortsette å tilby det beste alternativet å undersøke hele sykdom utfallet5,6. Tidligere forskning har detaljert mange forekomster av lovende i vitro undersøkelser av virulens unnlater å reprodusere i vivo7,8. Dermed dyremodeller er fortsatt nødvendig for å vurdere virulens i vivo. De fleste sykdom modeller er avhengige av mus som et surrogat for menneskelige infeksjoner tross C. albicans manglende evne til å kolonisere naturlig murine systemer som commensal9. Virvelløse modeller av spres candidiasis inkludere Rundormer Caenorhabditis elegans, frukt fly Drosophila melanogaster, og waxworm Galleria mellonella, selv om bekymringer om grunnleggende forskjeller i grunnleggende anatomi har vert kroppen temperaturer og eksponeringsmåter hemmet deres bred aksept10,11.
Mest nylig er G. mellonella waxworm infeksjon modellen vedtatt å modell virusets av en rekke bakterier og sopp patogener12,13,14. Fordelene med denne modellen inkluderer dens relativt lav pris, økt gjennomstrømning, brukervennlighet og redusert Etiske bekymringene om dyr godgjørenhet sammenlignet med murine modeller. For forskere gir dette økt evne til å teste flere variabler, sterkere konfidensintervaller, raskere eksperimentering og omkjøringsvei dyr protokoller. G. mellonella har fungert som en plattform for å raskt vurdere C. albicans virulens etter forstyrrelsene av gener kreves for biofilm formasjon, filamentation og gene regulering over kliniske isolater11,15 ,16. Nyere studier har innarbeidet undersøkelse av soppdrepende effekt bruke G. mellonella å vurdere farmakokinetikken av narkotika aktivitet og motstand under i vivo innstillinger som ellers utfordrende og tidkrevende 17,18. Ennå, studier av C. albicans virulens i G. mellonella har blitt komplisert med angivelig høye nivåer av variasjon i eksperimenter og inkonsekvent protokoller flerfaglig som produserer ulike virulens fenotyper mellom mus og waxworms11,13,19,20,21. Her skissere vi en G. mellonella protokoll for å standardisere C. albicans infeksjoner, øke reproduserbarhet virulens eksperimenter og demonstrere samsvar med beskrevet tidligere studier av virulens i Trouble modeller.
Tidligere studier viste at C. albicans parring type-lignende (MTL) locus på kromosom 5 regulerer celle identitet og mating kompetanse Saccharomyces cerevisiae og andre Ascomycete sopp22. Flertallet av C. albicans isolerer er heterozygote på MTL locus, koding av hver av de MTLen og MTLα alleler(MTLi /α), og er derfor bakteriefri15, 23 , 24. tapet av en av MTL alleler gjennom tap av heterozygosity (LOH) eller mutasjon fører til homozygous MTLen eller MTLα stammer som kan gjennomgå en fenotypiske bryter fra sterilt "hvit" staten til den parring kompetent "ugjennomsiktig" state25. Tidligere arbeid har understreket at tap av MTL heterozygosity også reduserer virulens i murine modeller av systemisk smitte over forskjellige belastning bakgrunner26. Her detalj vi G. mellonella modell for spres candidiasis med en genetisk like eksperimentelle for å skildre bidrag av MTL heterozygosity til virulens i G. mellonella. Vi viser at MTL konfigurasjon påvirket C. albicans virusets, hvor MTLα stammer var mindre virulente med hensyn til både MTLi /αog MTLen celler, ligner på funn modell26i murine infeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene beskrevet stole på bruk av virvelløse verter og krever ikke at institusjonell Animal Care og bruke Committee (IACUC) godkjenning.
1. galleria mellonella Waxworm larver
- Bestill larver fra grossister og leverandører som ikke innføre hormoner, antibiotika eller andre behandlinger til larvene og som er i stand til å sende og levere levende prakteksemplarer.
- Husk å kjøpe alle larver fra samme leverandør i løpet av eksperimentering. Vær forsiktig når du bestiller Larvene sommermånedene som temperaturer over 30 ° C redusere Larvene levedyktighet.
- Overvåke temperaturer over forventet levering ruten og planlegge skipsfart og levering deretter eller velg rask levering å redusere sin eksponering til miljøforhold.
- Når larvene kommer, sjekk hver beholder for å sikre levedyktig, sunn Larvene finnes. Sunn Larvene vil være helt neddykket under det bedding, flytting, og har en lys gul/tan farge med noen larver som inneholder svarte merker eller misfarging langs kroppen.
- Lagre larver i sine beholder i en ventilert plass ved omgivelsestemperatur (25 ° C). Avhengig av den opprinnelige tilstanden næringsplante, kan de brukes i opptil to uker.
2. kultur forberedelse til Galleria mellonella infeksjon
Merk: Riktig lab antrekk bør brukes i hele denne delen av protokollen inkludert hansker, laboratoriefrakk og vernebriller.
- Gjør gjær pepton druesukker (YPD) flytende og agar plater. Forberede 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) og 70% etanol løsninger.
- Vokse C. albicans stammer skal injiseres overnatting i 3 mL fersk YPD i standard kultur rør på en roterende trommel på middels hastighet og 30 ° C.
- Nedspinning celler 2500 x g i 5 minutter i en tabletop sentrifuge. Hell av nedbryting, pass på ikke å forstyrre celle pellets.
- Resuspend celler fullt i 5 mL 1 x PBS gjentatte pipettering eller vortexing. Gjenta sentrifugering og rørets celleområde i PBS to ganger mer å sikre fjerning av alle kultur-medier.
- Etter en siste vask, resuspend celler i 1 mL av PBS og overføre dem til et microcentrifuge rør.
- Utføre et sett med serielle fortynninger i PBS generere en 1: 100, 1:1, 000, og 1:100,000 fortynning serien.
Merk: Alternative fortynninger kan være nødvendig for å nå ønsket celletall.- Bruker en hemocytometer, telle celler fra den 1: 100 eller 1:1,000 fortynning. Oftest gir 1:1,000 fortynning den aktuelle cellen teller C. albicans kulturer.
- Beregne totale konsentrasjonen av celler i den opprinnelige kulturen med rutenett matte av hemocytometer, satsing for mellom 30-300 celler telles i det sentrale 5 x 5-rutenettet. En automatisert celle teller kan brukes som et alternativ. men kan bruk av optisk densitet å bestemme celletall er motløs som cellen morfologi (størrelse, form, etc.) påvirke nøyaktigheten.
- Bruke de målte celletall, lage en ny fortynning av 2.5x107 celler/mL i 1 x PBS i et microcentrifuge rør. Dette fortynning vil tjene som grunnlag for hver vaksinasjon av G. mellonella med C. albicans. Hver injeksjon krever 10 µL av denne inoculum for en smittsomme dose av 250.000 C. albicans celler.
- Bekreft nøyaktigheten av smittsomme dosen ved plating riktig volum av 1:100,000 fortynning på 100 kolonien danner enheter (CFUs) på YPD agar for hver kultur i infeksjon.
- Inkuber celle antall plater fra steg 2,7 i 48 timer (h) på 30 ° C og antall kolonier per plate. Mellom 80 og 120 kolonier utgjør et akseptabelt område for nøyaktighet i inoculum.
3. infeksjon av Galleria mellonella Larvene med Candida kulturer
Merk: Riktig lab antrekk bør brukes i hele denne delen av protokollen inkludert hansker, laboratoriefrakk og vernebriller.
- Legge til 1 mL av 100% etanol og 1 mL 1 x PBS to separate microcentrifuge rør. Etanol og PBS brukes å vaske injeksjon nålen mellom infeksjoner.
- Spre litt waxworm sengetøy i et tomt, 100 x 15 mm sterilt Petriskål, som vil huse Larvene etter vaksinering for hver uavhengige stamme. Tillegg av sengetøy begrenser av døde G. mellonella Larvene til Petriskål overflaten.
- Sterilisere en 26 G, 10 µL sprøyten ved å ta og expunging 10 µL av 70% etanol tre ganger etterfulgt av tre vasker med 10 µL av 1 x PBS. Vortex inoculation fortynning av C. albicans og ta opp 10 µL av kultur. Kontroller at det er ingen luftbobler i sprøyten som luft fremmer død og vil komplisere nedstrøms.
- Åpne en beholder holde G. mellonella larvene og nøye snu sengetøy med en finger å avdekke larver. Velg larver som er i god helse som identifiseres av aktiv bevegelse, en lys gul/tan farge og mangel på svart pigmentering på Larvene kroppen. Disse Larvene settes av samme størrelse over hele eksperimentelle.
- Plukke opp en enkelt larver og hold den forsiktig mellom indeks/midterste finger og tommel ligner holde en blyant. Rulle Larvene på ryggen så bena er vendt oppover. Hold hele lengden av kroppen mellom fingrene og tommelen slik at larvene er ikke krøller seg eller trekke fra injeksjon.
Merk: Eventuelt sterilisere injeksjonsstedet med en bomullspinne dynket i 100% etanol. - Rotere sprøyten slik nålens skråkanten vender og sakte stikk nålen inkludert lengden på skråkant i kroppen i krysset med bakerste venstre beinet. Kontroller at nålen trenger inn i kroppen og ikke bare presse kroppen til Larvene innover. Ikke bruk makt i gjennomtrengende kroppen som nålen kan pierce helt gjennom Larvene raskt. Løfte forsiktig med nålen vil bekrefte riktig penetrasjon. Injisere full 10 µL Candida inoculum og ekstra nålen.
- Gjenta trinn 3.3-3,5 for hver larver. Å hindre celle bosetting, vortex Candida kulturer for vaksinering etter hver tredje injeksjon. Som en kontroll, injisere en rekke G. mellonella med 10 µL av 1 X PBS.
- Co house 10 Larvene injiseres fra samme Candida kulturen i hver 100 x 15 mm Petriskål etter vaksinering. Inkuber larver på 37 ° C i åtte dager, sjekke Larvene hver 24 timer for å overvåke død.
- Vurdere dødelighet først av mørke pigmentering, dannelsen av sorte flekker eller organer, og mangel på bevegelse. For å bekrefte dødelighet, bruke pinsett for å forsiktig kast døende larver på ryggen og lett poke Larvens undersiden med pinsett. Ikke-respons som observert av mangel på synlig kroppen eller Ben bevegelse er scoret som døden og Larvene er fjernet fra Petriskål.
- Registrere Larvene dødelighet i gang løpet. Larver som begynner å forpuppe seg til møll kan inkluderes i analysen, men bør fjernes hvis de begynner å molt. Pupating larver kan bli sensurert fra endepunktet analyse som virulens forskjellene mellom larver og puppe er uklart.
- Vurdere statistisk signifikans bruker Mantel-Cox statistisk test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her viser vi en reproduserbar metode for bruk av G. mellonella waxworms å undersøke en spres candidiasis modell av infeksjon med C. albicans. Den oppbevaring, vedlikehold og utvalg av Larvene for infeksjon er kritisk komponent i opprettholde reproduserbarhet i G. mellonella dødelighet (figur 1A). Sunn larver som er aktive, har en lys gul/tan farge, og manglende svarte flekker på kroppen skal brukes for dette systemet og er vanligvis levedyktig infisert opptil to uker etter ankomst. For å minimere eventuelle potensielt forvirrende effekter av G. mellonella fysiologi, ble Larvene valgt av lignende størrelse og vekt. En godt blandet inoculum og konsekvent injeksjon på samme anatomiske området av Larvene kroppen også stå som viktige variabler å fremme reproduserbarhet mellom eksperimenter. Bilder vise vedlikehold av infiserte Larvene gjennom hele eksperimentering (figur 1B).
For å vurdere effekten av Larvene alder virulens, ble separat PBS kontrollere infeksjoner utført med larver enten null eller ti dager etter ankomst. Ingen signifikant forskjell i the kinetics av G. mellonella død eksisterte mellom disse gruppene (figur 2A). Karakteristiske underskriver av lidelsen oppsto i larver fra begge grupper som falt på infeksjonen; den opprinnelig gul/tan fargen næringsplante ble misfarget og banet vei for sorte flekker før totalt tap av motilitet og til slutt død (figur 2B). Infeksjon med C. albicans hastigheter opp denne prosessen med misfarging og sykelighet, men vesentlig endrer ikke kaskade av fenotypiske markører som fører til død sammenlignet med infisert larver eller PBS injisert Larvene (figur 2C).
Infeksiøs dosen påvirker også betydelig dødelighet kinetics av G. mellonella infeksjoner. For å vurdere effekten av C. albicans inoculum størrelse, vi infisert G. mellonella med fire forskjellige kliniske isolater (12 C, P60002, P75010 og SC5314: tabell 1) på tre forskjellige doser. Larvene infisert med SC5314 vises dødelighet ved alle doser, samsvar med økt virusets av denne isolere i forhold til de fleste andre brukes i eksperimentet (figur 2D). Flere Larvene døde av infeksjon med 1.0 x 105 SC5314 eller 12 C celler sammenlignet med 1,0 x 104 celler. Den høyeste dosen av 1.0 x 106 celler viste seg svært dødelige med larver dør etter infeksjon av alle stammer inkludert mindre virulente isolert, P60002 og 12 C. Larvene injisert med P75010 og SC5314 døde av infeksjon innen 24 timer, noe som tyder på en mer moderat smittsomme dose er egnet til å finne forskjellen i virulens. Derfor ble en smittsomme dose 2.5x105 brukt for alle etterfølgende eksperimenter.
For å demonstrere likhet i virulens mellom murint og G. mellonella modeller av systemisk sykdom, assayed vi virulens av SC5314-avledet C. albicans stammer koding enten heterozygote (en/α eller homozygous (en/eller Α /-) MTL loci. Infeksjon av G. mellonella med MTL heterozygotes fra SC5314 eller prototrophic avledede BWP17 genetisk bakgrunn produsert høy forekomst av dødeligheten sammenlignet med PBS-injisert dyr. Tre fjerdedeler av kontroll Larvene overlevde dag 8 sammenlignet tap av over halvparten av alle C. albicans injisert dyr innen 3 dager legge infeksjon (PPT) som ytterligere økt med 8 dpi (Figur 3A, 3B). Infeksjon med BWP17 dempet C. albicans dødelighet i denne modellen (27% overlevelse sammenlignet med 4% overlevelse i SC5314 MTL heterozygotes med 8 PPT; Figur 3 C, 3D). G. mellonella Larvene infisert med MTLα /-stammer overlevde betydelig lengre forhold til MTL heterozygote foreldrenes toner (Logg-rank test, SC5314, p = 0.0006, BWP17, p = 0.0002). Interessant, matchet virulens MTLen/C. albicans celler motparten MTL heterozygote i både SC5314 og BWP17 bakgrunner. Dermed har MTL en innflytelse på C. albicans virulens med MTLα /-stammer viser redusert drapet forhold til MTLen/α eller MTLen/-celler.
Figur 1 . Oversikt over infeksjon prosedyren. (A) et flytskjema høydepunkter de viktigste elementene i infeksjon prosedyren inkludert bestilling og lagring av larver infeksjon kultur forberedelse og injeksjon. (B) representant bilder viser sunn lagringsforhold, utarbeidelse av infeksjon plass, injeksjon og larver vedlikehold etter infeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Effekten av G. mellonella infeksjon prosedyrer. (A) PBS kontroller var infisert enten umiddelbart ved ankomst (PBS-D0, blå) eller etter 10 dager (PBS-D10, rød). (B) representant bilder markere Larvene misfarging og død. (C) en bildet serien av infeksjon plater detalj effekten av injeksjon med PBS (midten) eller med SC5314 (lavere) i forhold til uninfected Larvene (øverst) på dager 1, 3, 5 og 7 etter injeksjon. (D) effekter vises i en samling av kliniske isolater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . MTLen allelet fremmer C. albicans drapet på G. mellonella. MTL locus heterozygote (en/α) og homozygous (en/- og α /-) SC5314 (A) og BWP17 (C) derivater er plottet for Larvene dødelighet over åtte dager. Konfidensintervall tegnes for hver SC5314 (B) og BWP17 (D) avledede belastning å markere konsistens i the kinetics av Larvene dødelighet over eksperimenter. Gjennomsnittlig (heltrukket linje) er plottet med standardavvik (fylt i rommet) for tre biologiske gjenskapninger av 10 larver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Candida belastning | Foreldrenes stamme | Genotype | MTL | Referanse |
| MAY1 | SC5314 | Candida albicans kliniske isolere | en/α | Wu et al. 2007 |
| MAY6 | P60002 | Candida albicans kliniske isolere | a/en | Wu et al. 2007 |
| MAY11 | P75010 | Candida albicans kliniske isolere | en/α | Wu et al. 2007 |
| MAY15 | 12C | Candida albicans kliniske isolere | a/en | Wu et al. 2007 |
| MAY61 | SC5314 | MTLa:: SAT1 | Α /- | Denne studien |
| MAY71 | SC5314 | MTLα:: SAT1S tac1::TAC1-GFP-HYGR | en /- | Denne studien |
| MAY313 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-arg4-ura3-BN sir2::his1/sir2::dpl200 | en/α | Denne studien |
| MAY314 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-BN sir2::HIS1/sir2::dpl200 | Α /- | Denne studien |
| MAY315 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-BN sir2::HIS1/sir2::dpl200 | en /- | Denne studien |
Tabell 1. C. albicans stog brukt i denne studien.
| Variabel del | Foreslåtte kontroll | Referanse |
| Larvene alder ved injeksjon | Minimere ormen ankomst og vaksinering | Denne studien |
| Larvene størrelse ved injeksjon | Konsekvens når ormer | Fuchs et al. 2010 |
| Larvene helse ved injeksjon | For ormer under moderat temperatur, bruke umiddelbart ved ankomst | Denne studien |
| Smittsomme dose med C. albicans | Velg en smittsomme konsentrasjon som presenterer bredeste utvalg av resultater | Denne studien |
| Larvene response til injeksjon | Gjennomføre PBS injeksjon kontroller sammen med ormer med ingen injeksjon | Hirakawa et al. 2015 |
Tabell 2. Betraktninger om G. mellonella infeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
G. mellonella waxworm modellen står som et effektivt verktøy for rask og reproduserbar analyse av C. albicans virulens. Denne detaljerte protokollen er avhengig av konsekvent levering av en definert smittsomme dose til det samme området over en gruppe med larver. Smittsomme dose har en betydelig innflytelse på G. mellonella dødelighet mens bruk av Larvene mellom første ankomst og ti dager etter mottak produsert lignende resultater. Tap av det C. albicansMTLen allelet resulterer i redusert virulens samsvar med tidligere eksperimenter i mus selv om avbrudd av MTLα allelet ikke endre Larvene død.
Utfallet av G. mellonella infeksjoner kan bli betydelig påvirket av eksperimentell design. I motsetning til vertebrate modeller av infeksjon, kan liten variasjon i injeksjonsstedet, inoculum volumet og inoculum størrelse påvirke tolkninger av dataene. Infeksjoner med økende antall C. albicans celler førte til større og raskere sykelighet av infiserte larver. På et visst punkt vises injisere for mange C. albicans i stand til overveldende vert forsvar fører til rask død på verten, potensielt gjennom toksisk sjokk. SC5314 var imidlertid konsekvent mest virulente belastning på alle doser, etterfulgt av 12C, og deretter de andre stammene. Dermed infeksjon parametere har en betydelig innflytelse på den absolutte kinetics av infeksjoner, men kan fortsatt tilby anslag over relative virulens. Tidligere arbeidet i disse eksperimentene videre demonstrerte betydningen av grundig vask Candida cellene. Gjenværende YPD inkludert i injeksjon bolusen betydelig reduserer Larvene overlevelse (data ikke vist).
Ormen helse er en viktig variabel når gjennomføre G. mellonella eksperimenter. Larver transporteres med standard frakt midt på sommeren ofte kommer tidlig alderen eller stresset, dekket med svarte flekker, med redusert levedyktighet. Noen betydelig rolle for Larvene størrelse på sykelighet er observert tidligere selv om eksperimenter beskrevet her fokusert på assaying larver av tilsvarer masse. Sunn larver og PBS kontroll larver skal alltid kjøres sammen med infeksjon grupper å ta hensyn til endringer i Larvene levedyktighet mellom biologiske gjentak utført på forskjellige dager. G. mellonella infisert ti dager etter ankomst matchet the kinetics av Larvene infisert umiddelbart ved mottak. Dermed kan én enkelt forsendelse av Larvene gir tilstrekkelig materiale og tid til å utføre full eksperimenter. Disse eksperimentene stole på 30 dyr per å finne forskjellen i virulente, som er betydelig flere dyr enn vanligvis benyttes i murine modeller, som resulterer i sterkere tillit observerte resultatene11,27 , 28. denne modellen også redusert Etiske bekymringene, tid og kostnader i forhold til vertebrate modeller av infeksjon. Dermed kan bruk av voks Larvene lette identifikasjon av mindre effekter på systemisk virulens enn i andre systemer.
Iboende begrensninger G. mellonella systemet finnes som begrenser dens nytte i å studere vert-patogen interaksjoner. Først G. mellonella mangler en adaptive immunsystemet og kan ikke brukes til å undersøke antigenicity eller immunologisk minne i høyere eukaryoter29. Kroppen av Larvene består av et enkelt kontinuerlig hulrom fylt med hemolymph, som funksjon for å sirkulere næringsstoffer, signalnettverk molekyler og immunceller antimikrobielle peptider. Disse immunceller, hemocytes, kan fungerer på samme måte nøytrofile og derfor phagocytose, generere oksidativt støt og skiller lytisk enzymer etter via ekstracellulære patogen anerkjennelse reseptorer30. Likevel, denne funksjonen er et delsett av medfødte immunforsvaret celleprosesser i Ryggstrengdyr systemer som ikke fullt gjenspeiler alle leukocytter aktiviteter. En annen stor påminnelse er mangelen på et genom montering for G. mellonella selv om genomet var nylig sekvensert31. Derfor omfanget av genotypic mangfold i arter er ukjent og de fleste leverandører sannsynlig skipet genetisk heterogene populasjoner som kan påvirke dødelighet over eksperimenter. Videre molekylær teknikker ikke finnes for organismen og komplisere ethvert forsøk å dissekere vert bidrag til patogenesen. Likevel, konsekvent virulens resultater etter infeksjon med C. albicans over eksperimenter, leverandører, tid og labs støtter deres nytte i grunnleggende spørsmål om virusets.
Tap av MTLen redusert virulens av C. albicans MTL heterozygotes og MTLα homozygote bakgrunner. Denne trenden er konsistent med tidligere arbeid utført ved hjelp av musen modeller systemisk virulens26. I motsetning til murine modeller, tap av MTLα ikke endre virulens i forhold til MTLen/α foreldrenes belastningen. Avviket mellom disse resultatene er uklart, men kan inneholde komponenter av adaptiv immunitet som mangler i virvelløse dyr. Alternativt, økt virulens tilknyttet MTL heterozygosity kan skyldes bare MTLα allelet i SC5314, potentiating behovet for vurdering over flere belastning bakgrunner. Derfor foreslår vi en differensiell rolle for virulens mellom de to MTL alleler.
Samlet fungerer G. mellonella modellen som en rask og reproduserbar modell for å vurdere systemisk candidiasis. Andre readouts av virulens kan være assayed med denne modellen inkludert sopp utbredelsen av plating Larvene homogenate for kolonien danner enheter (CFUs)11 eller bioluminescens, som også gir fungal lokalisering32. I fremtiden, denne modellen kan utvides for å vurdere virulens kjennetegner andre Candida arter som forhøyet resistens i den nylig emergent Candida auris arter33. Videre utvikling av verktøy for å visualisere lymfocytt innen G. mellonella samarbeidsstil infisere Candida, innavlet waxworm overleveringslinjer å redusere variasjon i infeksjoner resultater og visualisering av infeksiøs via reporter Candida linjer34 vil ytterligere avgrense denne modellen av sykdom og la dypere undersøkelser av in vivo vert-patogen interaksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne hjelp av Pamela Washington og Leah Anderson å skaffe Galleria mellonella for bruk i denne studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Snackworms.com | Buy twice as many worms as expected to use | |
| 10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe | Hamilton | 80000 | |
| Petri dish, 100X15 mm, 500 pack | Fisher | FB0875712 | |
| Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack | VWR | 87003-294 | |
| Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL | VWR | 97062-818 | |
| Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL | Millipore Sigma | EM-EX0276-1S | |
| autoclaved ddH2O |
References
- Kauffman, C. A., et al. Prospective multicenter surveillance study of funguria in hospitalized patients. The National Institute for Allergy and Infectious Diseases (NIAID) Mycoses Study Group. Clinical Infectious Diseases. 30 (1), 14-18 (2000).
- Horn, D. L., et al. Epidemiology and outcomes of candidemia in 2019 patients: data from the prospective antifungal therapy alliance registry. Clinical Infectious Diseases. 48 (12), 1695-1703 (2009).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clinical Microbiology Reviews. 20 (1), 133-163 (2007).
- Sardi, J. C., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 1 10-24 (2013).
- Segal, E., Frenkel, M. Experimental in Vivo Models of Candidiasis. J Fungi (Basel). 4 (1), (2018).
- Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L. Animal models for candidiasis. Current Protocols in Immunology. 105, 11-17 (2014).
- Heymann, P., et al. The siderophore iron transporter of Candida albicans (Sit1p/Arn1p) mediates uptake of ferrichrome-type siderophores and is required for epithelial invasion. Infection and Immunity. 70 (9), 5246-5255 (2002).
- Priest, S. J., Lorenz, M. C. Characterization of Virulence-Related Phenotypes in Candida Species of the CUG Clade. Eukaryotic Cell. 14 (9), 931-940 (2015).
- Savage, D. C., Dubos, R. J. Localization of indigenous yeast in the murine stomach. J Bacteriol. 94 (6), 1811-1816 (1967).
- Ewbank, J. J., Zugasti, O. C. elegans: model host and tool for antimicrobial drug discovery. Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 300-304 (2011).
- Amorim-Vaz, S., Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. Examining the virulence of Candida albicans transcription factor mutants using Galleria mellonella and mouse infection models. Frontiers in Microbiology. 6, 367 (2015).
- Harding, C. R., Schroeder, G. N., Collins, J. W., Frankel, G. Use of Galleria mellonella as a model organism to study Legionella pneumophila infection. Journal of Visualized Experiments. (81), e50964 (2013).
- Jacobsen, I. D. Galleria mellonella as a model host to study virulence of Candida. Virulence. 5 (2), 237-239 (2014).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
- Hirakawa, M. P., et al. Genetic and phenotypic intra-species variation in Candida albicans. Genome Research. 25 (3), 413-425 (2015).
- Dunn, M. J., Kinney, G. M., Washington, P. M., Berman, J., Anderson, M. Z. Functional diversification accompanies gene family expansion of MED2 homologs in Candida albicans. PLoS Genetics. 14 (4), 1007326 (2018).
- Astvad, K. M. T., Meletiadis, J., Whalley, S., Arendrup, M. C. Fluconazole Pharmacokinetics in Galleria mellonella Larvae and Performance Evaluation of a Bioassay Compared to Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry for Hemolymph Specimens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).
- Mesa-Arango, A. C., et al. The non-mammalian host Galleria mellonella can be used to study the virulence of the fungal pathogen Candida tropicalis and the efficacy of antifungal drugs during infection by this pathogenic yeast. Med Mycol. 51 (5), 461-472 (2013).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Fuchs, B. B., O'Brien, E., Khoury, J. B., Mylonakis, E. Methods for using Galleria mellonella as a model host to study fungal pathogenesis. Virulence. 1 (6), 475-482 (2010).
- Kavanagh, K., Fallon, J. P. Galleria mellonella larvae as models for studying fungal virulence. Fungal Biology Reviews. 24 (1-2), 79-83 (2010).
- Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285 (5431), 1271-1275 (1999).
- Legrand, M., et al. Homozygosity at the MTL locus in clinical strains of Candida albicans: karyotypic rearrangements and tetraploid formation. Molecular Microbiology. 52 (5), 1451-1462 (2004).
- Lockhart, S. R., et al. In Candida albicans, white-opaque switchers are homozygous for mating type. Genetics. 162 (2), 737-745 (2002).
- Miller, M. G., Johnson, A. D. White-opaque switching in Candida albicans is controlled by mating-type locus homeodomain proteins and allows efficient mating. Cell. 110 (3), 293-302 (2002).
- Wu, W., Lockhart, S. R., Pujol, C., Srikantha, T., Soll, D. R. Heterozygosity of genes on the sex chromosome regulates Candida albicans virulence. Molecular Microbiology. 64 (6), 1587-1604 (2007).
- Herrero, A. B., et al. KRE5 gene null mutant strains of Candida albicans are avirulent and have altered cell wall composition and hypha formation properties. Eukaryotic Cell. 3 (6), 1423-1432 (2004).
- Hall, R. A., et al. The Mnn2 mannosyltransferase family modulates mannoprotein fibril length, immune recognition and virulence of Candida albicans. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003276 (2013).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Journal of Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
- Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infection and Immunity. 73 (7), 4161-4170 (2005).
- Lange, A., et al. Genome Sequence of Galleria mellonella (Greater Wax Moth). Genome Announcements. 6 (2), (2018).
- Krappmann, S. Lightning up the worm: How to probe fungal virulence in an alternative mini-host by bioluminescence. Virulence. 6 (8), 727-729 (2015).
- Chowdhary, A., Voss, A., Meis, J. F. Multidrug-resistant Candida auris: 'new kid on the block' in hospital-associated infections. Journal of Hospital Infection. 94 (3), 209-212 (2016).
- Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. Adaptation of a Gaussia princeps Luciferase reporter system in Candida albicans for in vivo detection in the Galleria mellonella infection model. Virulence. 6 (7), 684-693 (2015).
