Summary
在这里, 我们提出了一个方案, 以过渡改善心脏功能的杜氏肌营养不良小鼠移植从正常的肌原细胞外周肌。
Abstract
杜琴肌肉营养不良 (DMD) 是一种由缺乏功能性营养不良蛋白引起的 x 连锁隐性遗传病。这种疾病无法治愈, 随着病情的发展, 患者会出现扩张型心肌病、心律失常和充血性心力衰竭的症状。DMD Mdx突变体小鼠不表达营养不良蛋白, 常被用作 DMD 的小鼠模型。在我们最近的研究中, 我们观察到大类型 (WT)-肌原体细胞衍生外显子 (MPC-Exo) 的心肌内注射短暂地恢复了 DMDMdx突变体小鼠心肌中营养不良蛋白的表达, 这与之相关心脏功能的短暂改善表明 WT-MPC-Exo 可以提供一个选项来缓解 DMD 的心脏症状。本文介绍了 MPC-Exo 纯化并移植到dmd Mdx 突变体小鼠心脏中的技术。
Introduction
杜氏肌营养不良症 (DMD) 是一种 x 连锁隐性、进行性神经肌肉疾病, 由 DMD 基因突变和功能性营养不良蛋白 1的丧失引起。肌营养蛋白主要表现在骨骼肌和心肌中, 在平滑肌、内分泌腺体和神经元2,3中表达较少。Dmd 是最常见的肌肉营养不良症, 发病率为每3, 500 至 5,000名新生男孩1人。个人通常会出现进行性肌肉坏死, 在青春期早期失去独立行走, 以及在生命的第二至第三年死于心力衰竭和呼吸衰竭.
扩张型心肌病、心律失常和充血性心力衰竭是 dmd7,8的常见心血管表现。这种疾病无法治愈, 支持性治疗可能会改善症状或延缓心力衰竭的进展, 但很难改善心脏功能9,10.
与 DMD 患者类似, x 连锁肌营养不良症 (MDX) 小鼠缺乏营养不良蛋白, 并出现心肌病11的症状, 因此被广泛用于 DMD 相关心肌病的研究。为了恢复受影响肌肉中的营养不良蛋白, 异基因干细胞治疗已被证明是治疗 dmd12、13、14的有效方法。外体, 30-150nm 膜囊泡分泌的各种细胞类型, 发挥关键作用, 通过遗传物质运输细胞间的通信, 如信使 rna (mrna) 和非编码 rna15,16,17 ,18,19,20,21。
我们以前的研究表明, 从肌源性祖细胞 (MPC) 中提取的外显子, 如 C2C12 细胞系, 可以转移营养不良素 mRNA 到宿主心肌细胞后, 直接心脏注射22, 这表明同种异体传递Mpc 衍生外显子 (MPC-Exo) 可以短暂恢复 MDX 小鼠的 DMD 基因表达。本文的重点是 MPC-Exo 纯化和移植技术。
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Protocol
动物是根据奥古斯塔大学佐治亚医学院动物护理和使用机构委员会批准的协议和动物福利条例处理的。
1. mpc 衍生的外显子的分离和纯化
- 种子 5 x10 6 c2c12 细胞在一个15厘米的细胞培养盘与20毫升完成 dulbecco 的改性鹰的培养基 (dmem) 含有10% 的胎儿牛血清 (fbs), 100 Uml 青霉素 g 和100μgml 链霉素。在37°c 和 5% co 2 下孵化.
- 利用摆动的桶式转子, 在 100, 000 x 克的 fbs 超离心条件下, 在4°c 下18小时的速度, 准备出孔耗尽介质。丢弃颗粒。
- 当单层细胞在培养皿中达到80% 的融合时, 用外细胞耗尽培养基代替完整的 DMEM。
- 使用转移移液器每48小时从细胞培养盘中收集一次上清液, 总共三次。收集50毫升离心管中的上清液, 并以 150 x g的离心机10分钟取出剩余的细胞。
- 通过0.22μm 过滤器过滤上清液, 以消除细胞碎片。在4°c 下, 使用 100, 000 x g 的摆动桶式转子在120分钟内沉淀外周体, 超离心过滤后的介质位于超透明管中。
- 在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中再沉淀含异位颗粒, 并用 PBS 填充整个超透明管。在 100, 000 x 克的温度下进行超离心 , 在4°C 下进行 120分钟, 以消除污染蛋白。
- 丢弃上清液, 在 100μl PBS 中重新悬浮外生体颗粒。存放在-80°c, 以备将来使用。
- 对于电子显微镜分析, 将体外悬浮液3Μl 放置在200目形式涂层铜电子显微镜网格上, 在室温下5分钟。继续使用标准醋酸铀染色23。用透射电子显微镜检查半干网格。
2. 心肌内外膜分娩
请注意:我们每组用六只老鼠。
- 酯化 DBAC/J-DMDMdx 小鼠 (雄性; 年龄 > 10个月; 体重 (bw) > 18 克) 与腹腔注射 100 mg/KG BW 的氯胺酮与 10 mg/kg bw 的木糖, 并通过脚趾夹紧确认麻醉的深度。
- 将每只老鼠固定在手术平台上的仰面位置, 使用胶带固定每个肢体, 并在上牙下方水平放置3-0 缝合, 以将上颌固定到位。
- 将脱毛霜涂在老鼠胸部的左侧, 去除皮肤上的皮毛。
- 使用 24 G 导管通过口腔进行气管插管, 并使用鼠洗呼吸机以195呼吸的速度用室内空气对小鼠进行通气 (见材料表)。
- 用75% 的酒精和10% 的聚维酮碘对皮肤进行消毒。
- 做一个 10\ u201215 mm 的斜切口, 从左胸骨边缘到左腋窝, 用剪刀切割胸大和胸小, 然后在第四个肋间空间进行左开胸手术。轻轻插入牵引器带, 将胸腔展开至10毫米的宽度。注意避免对左肺造成损害。
- 使用两个直的推拿器取出心包, 将其分开, 并将其放置在牵引器提示后面, 以暴露心脏。在一个位置使用 31 g 胰岛素针, 在心肌内将 MPC-Exo (30μl PBS 中的50微克) 或 30μl PBS (作为对照) 注入左心室前壁。
- 使用6-0 尼龙缝合线, 依次关闭胸腔、胸肌和皮肤。
- 恢复鼠标。一旦有节奏的、自发的呼吸出现, 将小鼠从呼吸机中取出, 然后取出。观察并记录小鼠术后的病情。
3. 超声心动图
请注意:一个对实验组视而不见的观察者进行超声心动图和数据分析。
- 在 Pbss/外显子移植两天后, 用1\2012% 异氟醚麻醉小鼠。
- 使用胶带将鼠标固定在仰视位置, 并将预热的声学凝胶应用于左侧胸部区域。
-
评估左心室功能的超声心动图前面描述的16,24。
- 在两个维度 ( B 模式 ) 中获得左心室 ( LV ) 的后向长轴视图 , 然后旋转超声探头90° , 以获得状肌肉水平的 LV 短轴视图。
- 记录 m 型超声心动图图像, 测量左心室舒张端直径 (LVEDD)、左心室室收缩端体积 (LVIESD)、左心室终末期体积 (LVEDV) 和左心室室室收缩体积 (LVESSV)。
请注意:分数缩短 (FS%) = [(LVEDD-LVESD)/LVEDD] x 100, 左心室射血分数 (LVEF%) = [(LVEDV-LVESV)/LVEDV] x 100。
4. 免疫组织化学
- 在 Pbss\ 外显子移植两天后, 麻醉小鼠 (见步骤 2.1), 并切开胸骨, 露出胸腔。解剖下腔静脉, 并通过左心室先端与3毫升 PBS, 其次是3毫升的4% 聚甲醛在室温下, 使用蝴蝶导管与 25 g 针连接到5毫升注射器的左心室先端。
- 将固定的心脏嵌入石蜡中, 切割成5微米厚的部分。
- 将二甲苯中的幻灯片和乙醇溶液中的再水合物按以下顺序进行分离: 100% 二甲苯 (3分钟)、100% 二甲苯 (3分钟)、100% 乙醇 (1分钟)、100% 乙醇 (1分钟)、95% 乙醇 (1分钟)、80% 乙醇 (1分钟)、h2o (1分钟).
- 在室温下用4% 的甲醛固定组织切片8分钟。
- 将滑块浸入柠檬酸钠 (0.01 M, pH 6.0) 中, 并使用抗原检索器进行抗原回收。
- 在室温下, 用1% 的聚乙二醇叔八丁醚在 PBS 中渗透 1 h 的切片。
- 在室温下, 在 PBS 中用5% 的山羊血清阻滞切片1小时。
- 在4°C 条件下, 用稀释的原代抗体 (抗营养不良素抗体) 在4°c 过夜的 PBS (1:100) 中培养切片, 然后用 PBS 清洗三次5分钟。
- 在 PBS (1:400) 中使用稀释的二级抗体 (亚历克莎 Fluor 488 共轭山羊抗兔 IgG) 在室温下培养45分钟。
- 使用自体荧光淬火试剂盒控制自荧光 (参见材料表)。
- 使用包含 DAPI 的安装介质 (请参阅材料表) 安装幻灯片。
- 在共聚焦显微镜下观察幻灯片。
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Representative Results
图 1a 显示了从 c2c12 细胞中分离和纯化外显体的流程图。为了确认外显子的存在, 我们进行了透射电子显微镜分析。透射电子显微镜图像 (图 1b) 显示了 c2c12 衍生外显子的明亮和圆形囊泡的形态。西方印迹分析证实存在外显子标记, 包括 CD63 和 TSG101 (图 1c)。
我们观察到心肌内 Pbsmpc-exo 注射到 MDX 小鼠左心室前壁后的半透明水肿区 (图 2), 表明心肌梗塞的注射成功。
为了确定心脏 MPC-Exo 分娩是否恢复了 MDX 心脏中的营养不良蛋白表达, 我们对营养不良蛋白进行了免疫荧光染色, 并使用共聚焦显微镜进行了成像。我们观察到部分肌细胞中的营养不良蛋白表达与膜定位的部分恢复 (图 3a)。为了确定 MPC-Exo 移植是否能改善 MDX 小鼠的心功能, 我们通过超声心动图测量心肌内 PBS/MPC-EXO 分娩2天后的心功能。如图 3b 所示, 与 pbs 相比, mpc-exo 治疗改善了前壁运动, 这表明 MPC-EXO 移植改善了 mdx 小鼠的心功能。
图 1: 电子显微镜的外显子纯化和表征.(A) 图表显示了 mpc-exo 的每一步分离和纯化。(B) 在电子显微镜下, 图像显示圆形和杯状囊泡。刻度条 = 100 纳米。(C) 西方印迹分析证实存在外显子标记 CD63 和 tsg101。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: PBS 或 MPC-Exo 的心肌内注射.在心肌内 pbsss1 外溶体分娩后的左心室前壁出现半透明水肿。(A) pbs 注射。(B) mpc-exo 注射。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: MPC-Exo 的心肌内分娩部分恢复 MDX 心脏中的肌营养不良蛋白表达, 并通过超声心动图改善心脏功能.(A) 共聚焦免疫荧光染色 mdx 小鼠心肌内 Pbs/mpc-exo 分娩2天后的心脏切片。蓝色 = DAPI, 绿色 = 抗营养不良蛋白抗体。(B) Pbssepc-exo 治疗2天后心功能的超声心动图测量。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
分离纯外质体的方法对于研究外显子的功能是必不可少的。外显子体分离的常用技术之一是聚乙二醇介导的沉淀17,18,25。外显子可以沉淀在 Peg 中, 并通过低速离心颗粒。Peg 介导的纯化非常方便, 成本低, 它不需要任何先进的设备, 但人们担心外显子的纯度, 因为其他脂蛋白可能沉淀在一起, 很难去除。超滤是一种常规的外显子分离方法, 基于分子量和排除大小限制 26。超滤隔离比超离心分离快, 但它可能会对大型囊泡造成结构损伤。外周膜上存在各种表位, 如 CD9、CD63 和 CD8127,提供了一种替代方法, 通过这些表位与磁珠结合抗体之间的免疫亲和力相互作用来分离外显子。虽然免疫隔离具有较高的特异性28, 但该技术的缺点是只分离总外生群体的一个子集, 并可能扭曲实验结果。因此, 超离心似乎更适合于本研究外显子功能。
本文提出了一种连续超离心纯化外显子体的方法。在 150 x克离心去除上清液中剩余的细胞后, 通过0.22 微米的过滤器将大于220纳米的细胞碎片、凋亡体和囊泡取出。然后用初始超离心法将外质体在 100, 000 x克的颗粒下。为了去除可能的蛋白质污染, 我们在 PBS 中重新悬浮外显体颗粒后进行了第二次 100, 000 x x 克的超离心。根据我们的经验, 顺序超离心的优点是生产纯度高、性价比高的外质体, 但具有产率低的缺点。
为了让注射的外质体覆盖大部分左心室并避免泄漏, 我们使用 31 G 胰岛素针进行了一次心肌内注射, 其尖端弯曲在约20°。这项技术是至关重要的成功传递到心肌的大多数外显子体, 并最大限度地暴露注射外膜宿主心肌细胞。此外, 我们建议将外周细胞注射到左心室前壁的中心区域。注射完成后, 我们通常在注射部位保持针头 1分钟, 以防止液体泄漏。注射部位周围存在半透明水肿, 证实了注射成功。
在我们的研究中, 我们发现同种异体 MPC-Exo 移植可以短暂地恢复 MDX 小鼠22的心脏营养不良蛋白表达, 改善心脏功能, 为 dmd 患者的症状缓解提供新的策略。由于我们观察到 MDX 小鼠心脏中恢复的营养不良蛋白蛋白表达, 我们假设这是改善心脏功能的机制, 但是, 我们不能排除其他机制, 如抗炎;最近的一份报告表明, 间充质干细胞衍生的外显子体改善了梗死心肌的微环境, 有助于血管生成和抗炎 29,此外, Aminzadeh 等人最近报告说:在 DMD 小鼠体内, 心足细胞 (Cdc) 及其外显子可以短暂恢复全长营养不良蛋白的表达。考虑到 DMD 是一种涉及多个器官的全身性疾病, 外生肌的局部心肌传递不适合治疗横隔膜肌病引起的呼吸衰竭。因此, 系统的外周菌, 如静脉注射, 具有治疗潜力, 然而, 主要的挑战是制定一个有效的策略, 针对多个肌肉组织外周菌。更重要的是, 外显子治疗对部分恢复营养不良蛋白表达和改善心脏功能仅有短暂的作用。需要更有效的长期 DMD 治疗。
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Disclosures
所有提交人都宣称, 他们没有利益冲突。
Acknowledgments
唐得到了美国心脏协会的部分支持: GRNT31430008、NIH-AR070029、NIH-HL086555、NIH-HL134354。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Filter | Fisherbrand | 09-720-004 | |
| 15 cm Cell Culture Dish | Thermo Fisher Scientific | 157150 | |
| 24 G catheter | TERUMO | SR-OX2419CA | |
| 31 G insulin needle | BD | 328291 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | AAJ19943K2 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| 6-0 suture | Pro Advantage by NDC | P420697 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Anti-Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | |
| Antigen retriever | Aptum Biologics | R2100-US | Antigen recovery |
| Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 | |
| C2C12 cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Centrifuge | Unico | C8606 | |
| Change-A-Tip High Temp Cauteries | Bovie Medical Corporation | HIT | |
| Confocal microscopy | Zeiss | Zeiss 780 Upright Confocal | |
| DBA/2J-mdx mice | The Jackson Laboratory | 013141 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| Goat serum | MP Biomedicals, LLC | 191356 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Henry Schein | 056344 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Mouse Retractor Set | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Rodent ventilator | Harvard Apparatus | 55-7066 | |
| SW-28 Ti rotor | Beckman | 342207 | |
| The Vevo 2100 Imaging Platform | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 2100 | Ultrasound System |
| Ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344058 | |
| Xylazine (XylaMed) | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 1XYL003 8XYL006 |
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