Summary
Aquí, presentamos un protocolo para mejorar transitoriamente la función cardiaca en ratones de la distrofia muscular de Duchenne mediante el trasplante de exosomas derivados de células progenitoras miógena normal.
Abstract
Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad genética recesiva x-ligada causada por una carencia de la proteína distrofina funcional. No se puede curar la enfermedad, y conforme avanza la enfermedad, el paciente desarrolla síntomas de insuficiencia cardíaca congestiva, miocardiopatía dilatada y arritmias. Los ratones mutantes DMDMDX no expresan distrofina y se utilizan comúnmente como un modelo de ratón de la DMD. En nuestro reciente estudio, se observó que la inyección intramiocárdica de tipo ancho (WT)-progenitor miógena exosomas derivados de células (MPC-Exo) transitoriamente restauran la expresión de distrofina en el miocardio de ratones mutantes DMDMDX , asociada con una mejora transitoria de la función cardiaca, lo que sugiere que WT-MPC-Exo puede proporcionar una opción para aliviar los síntomas cardiacos de la DMD. Este artículo describe la técnica de purificación de MPC-Exo y el trasplante en corazones de ratones mutantes DMDMDX .
Introduction
Distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una X-ligado recesiva, progresiva enfermedad neuromuscular causada por una mutación en el gen de la DMD y la pérdida de distrofina funcional1. Distrofina se expresa principalmente en el miocardio y músculo esquelético y menos se expresa en el músculo liso, glándulas endocrinas y neuronas2,3. DMD es el tipo más común de distrofia muscular con una incidencia de uno por cada 3.500 a 5.000 niños recién nacidos en todo el mundo4,5. Individuos suelen desarrollan necrosis muscular progresiva, pérdida de independiente a pie en la adolescencia temprana y la muerte en las décadas de segunda a tercera de sus vidas debido a la insuficiencia cardíaca y la insuficiencia respiratoria6.
Miocardiopatía dilatada, arritmias e insuficiencia cardíaca congestiva son manifestaciones cardiovasculares comunes de DMD7,8. No se puede curar la enfermedad, tratamiento de apoyo puede mejorar los síntomas o retrasar la progresión de la insuficiencia cardíaca, pero es muy difícil mejorar la función de corazón9,10.
Similares para los pacientes con DMD distrofia muscular X-ligado (MDX) ratones son deficientes en la proteína de distrofina y presente síntomas de cardiomiopatía11y por lo tanto son ampliamente utilizados en la investigación DMD asociado miocardiopatía. Con el fin de restaurar la distrofina en los músculos afectados, terapia de células madre alogénico ha demostrado para ser un eficaz tratamiento para la DMD12,13,14. Exosomas, vesículas de membrana 30-150 nm secretadas por varios tipos celulares, juegan un papel clave en la comunicación de célula a célula a través de transporte de material genético, ARN mensajero (ARNm) como no-codificación RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Nuestros estudios previos han demostrado que los exosomas derivados de células progenitoras miógeno (MPC), como línea de celular C2C12, pueden transferir dystrophin mRNA al host cardiomiocitos después de inyección cardiaca directa22, indicando que entrega alogénico de Exosomas derivados de MPC (MPC-Exo) transitorio pueden restaurar la expresión del gen DMD en ratones MDX. Este artículo se centra en técnicas de purificación y trasplante MPC-Exo.
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Protocol
Los animales fueron tratados según protocolos aprobados y normas de bienestar animal del institucional cuidado Animal y del Comité de uso del colegio médico de Georgia en la Universidad de Augusta.
1. aislamiento y purificación de exosomas derivados de MPC
- Semilla 5 x 106 C2C12 células en una placa de cultivo celular de 15 cm con 20 mL completa Dulbecco modifican medio del águila (DMEM) con 10% suero bovino fetal (FBS), 100 U/mL de penicilina G y estreptomicina 100 de μg/mL. Incubar a 37 ° C y 5% CO2.
- Preparar medio agotado de exosomas por ultracentrifugación de FBS a 100.000 x g de 18 h a 4 ° C utilizando un rotor oscilante de cubo. Deseche los pellets.
- Reemplazar el DMEM completo con medio exosomas-agotado cuando las células de la capa monomolecular a 80% de confluencia en la placa de cultivo.
- Utilizar una pipeta para recoger el sobrenadante de la placa de cultivo celular cada 48 h para un total de tres veces. Recoger el sobrenadante en tubos de centrífuga de 50 mL y centrifugar a 150 x g durante 10 min eliminar las células restantes.
- Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar restos celulares. Ultracentrífuga el medio filtrado en tubos ultra claros usando el rotor oscilante de cubo a 100.000 x g durante 120 min a 4 ° C para precipitar exosomas.
- Resuspender el precipitado que contiene los exosomas en tampón fosfato salino (PBS) y llenar el tubo muy claro todo con PBS. Realizar la ultracentrifugación de esta suspensión a 100.000 x g durante 120 min a 4 ° C para eliminar proteínas contaminantes.
- Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de exosomas en 100 μl PBS. Almacenar a-80 ° C para su uso futuro.
- Para el análisis de microscopia electrónica, colocar 3 μl de suspensión de exosomal en una cuadrícula de formvar recubierto cobre microscopio 200 malla por 5 min a temperatura ambiente. Continuar con acetato de uranilo estándar tinción23. Examinar la red semiseco por microscopía electrónica de transmisión.
2. intramiocárdica exosomas entrega
Nota: Utilizamos seis ratones de cada grupo.
- Anestesiar ratones DBA/2J-DMDMDX (hombre; > 10 meses de edad y peso corporal (PC) > 18 g) con la inyección intraperitoneal (i.p.) de 100 mg/kg P.C. de ketamina combinada con 10 mg/kg BW de xilacina y confirmar la profundidad de la anestesia por presión del dedo del pie.
- Fijar cada ratón en posición supina sobre una plataforma quirúrgica con cinta para sujetar cada miembro y colocar una sutura 3-0 horizontalmente por debajo de los dientes superiores para mantener la mandíbula superior en lugar.
- Aplicar la crema depilatoria en el lado izquierdo del pecho de ratón para quitar la piel de la piel.
- Realizar intubación endotraqueal a través de la cavidad bucal mediante un catéter 24 G y ventilar el ratón con aire a una velocidad de 195 respiraciones/min con un ventilador de roedor (véase la Tabla de materiales).
- Desinfectar la piel con alcohol al 75% y yodo povidona al 10%.
- Haga una incisión oblicua de 10\u201215 de mm desde el borde esternal izquierdo en la axila izquierda, corte de músculo pectoral mayor y pectoral menor por una tijera, luego realizar una toracotomía izquierda a través del cuarto espacio intercostal. Suavemente Introduzca las bandas retractor para separar la cavidad torácica en un ancho de 10 mm. Tenga cuidado para evitar daños en el pulmón izquierdo.
- Utilizar dos pinzas rectas para quitar el pericardio, los separe y colocarlos detrás de las puntas del separador para exponer el corazón. MPC-Exo de inyectar (50 μg en 30 μL PBS) o 30 μL PBS (como control) intramyocardially en la pared anterior del ventrículo izquierdo utilizando una aguja de insulina 31 G en un sitio.
- Use suturas de nylon 6-0 para cerrar la cavidad torácica, músculos pectorales y la piel en secuencia.
- Recuperar ratones. Una vez que la respiración espontánea rítmica está presente, quite los ratones del respirador y extubación. Observar y registrar la condición de ratones después de la cirugía.
3. ecocardiografía
Nota: Un único observador cegado a los grupos experimentales realiza ecocardiografía y análisis de datos.
- Dos días después del trasplante de PBS/exosomas, anestesiar los ratones con 1\u20122% isoflurano.
- Fijar un ratón en la posición supina con cinta y aplique el gel acústico precalentado en el área izquierda del pecho.
-
Evaluar la función ventricular izquierda por ecocardiografía como se describió anteriormente16,24.
- Obtener la vista de eje largo paraesternal de ventrículo izquierdo (LV) en dos dimensiones (modo B) y luego gire la sonda de ultrasonido 90° para obtener una vista de eje corto del LV a nivel del músculo papilar.
- Grabar imágenes ecocardiográficas modo M y medir diámetro telediastólico ventricular izquierdo (DDVI), volumen telesistólico ventricular izquierdo (LVESD), volumen telediastólico ventricular izquierdo (VTDVI) y el volumen telesistólico ventricular izquierdo (VTSVI).
Nota: Acortamiento fraccional (% FS) = [(LVEDD − LVESD) / DDVI] x 100 y fracción de eyección ventricular izquierda (FEVI %) = [(LVEDV − LVESV) / VTDVI] x 100.
4. inmunohistoquímica
- Dos días después del trasplante de PBS/exosomas, anestesiar ratones (véase el paso 2.1) y cortar el esternón abierto para exponer la cavidad torácica. Disecar la vena cava inferior e inundar el corazón por el ápice del ventrículo izquierdo con 3 mL de PBS, seguido de 3 mL de paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente, usando un catéter de mariposa con una aguja de 25 G conectada a una jeringa de 5 mL.
- Incorporar corazones fijos en parafina y cortadas en secciones de 5 μm de espesor.
- Desparafinizar portaobjetos en xileno y rehidratar en soluciones de etanol en el siguiente orden: xileno 100% (3 min), xileno 100% (3 min), 100% de etanol (1 min), etanol al 100% (1 minuto), etanol al 95% (1 minuto), etanol al 80% (1 minuto), H2O (1 min).
- Fijar las secciones de tejido con paraformaldehído al 4% por 8 min a temperatura ambiente.
- Sumerja los portaobjetos en citrato de sodio (0,01 M, pH 6.0) y realizar recuperación de antígeno utilizando un recuperador de antígeno.
- Permeabilizar las secciones por 1 h a temperatura ambiente con 1% polietilenglicol éter terc-Octylpheny PBS.
- Bloque de secciones con 5% de suero de cabra en PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
- Incubar las secciones con diluido de anticuerpo primario (anticuerpo anti-distrofina) en PBS (1: 100) durante la noche a 4 ° C, luego lavar tres veces con PBS durante 5 minutos.
- Incubar las secciones con diluido de anticuerpo secundario (Alexa Fluor 488 había conjugado anti-conejo de cabra IgG) en PBS (1: 400) por 45 min a temperatura ambiente.
- Control autofluorescence usando un amortiguamiento de Autofluorescencia kit (véase la Tabla de materiales).
- Medio de montaje de uso con DAPI (vea la Tabla de materiales) para montar las diapositivas.
- Observar diapositivas debajo de un microscopio confocal.
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Representative Results
Un diagrama de flujo para aislar y purificar exosomas de células C2C12 se muestra en la figura 1A. Para confirmar la presencia de exosomas, realizamos análisis de microscopia electrónica de transmisión. Imagen de microscopía electrónica de transmisión (figura 1B) muestra la morfología de las vesículas de forma brillante y redonda de exosomas C2C12 derivados. Mancha blanca /negra occidental análisis confirmaron la presencia de marcadores de exosomas, incluyendo CD63 y TSG101 (figura 1C).
Se observó un área de edema translúcido después intramiocárdica PBS/MPC-Exo la inyección en la pared anterior del ventrículo izquierdo de ratones MDX (figura 2), que indica la inyección acertada en el miocardio.
Para determinar si entrega MPC-Exo cardiaca restaura la expresión de la proteína distrofina en corazones MDX, realizamos la tinción para distrofina inmunofluorescente y proyección de imagen con un microscopio confocal. Observamos la restauración parcial de la expresión de distrofina con localización de la membrana en algunos de los cardiomiocitos (figura 3A). Para determinar si el trasplante de MPC-Exo mejora la función cardiaca en ratones MDX, medimos la función cardiaca por la ecocardiografía de 2 días después intramiocárdica PBS / MPC-Exo entrega. Como se muestra en la figura 3B, MPC-Exo el tratamiento mejoró en comparación con PBS, sugiriendo que MPC-Exo trasplante mejora la función cardiaca en ratones MDX del movimiento de la pared anterior.
Figura 1 : Exosomas purificación y caracterización por microscopia electrónica. (A) el diagrama muestra cada paso de aislamiento y purificación de MPC-Exo. (B) la imagen muestra las vesículas redondas y en forma de Copa bajo microscopía electrónica. Barra de escala = 100 nm. (C) análisis de Western blot confirman la presencia de marcadores de exosomas CD63 y TSG101. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Inyección intramiocárdica de PBS o MPC-Exo. Un edema translúcido se observó en la pared anterior del ventrículo izquierdo después de intramiocárdica PBS/exosomas entrega. (A) PBS la inyección. (B) inyección de MPC-Exo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Entrega intramiocárdica del MPC-Exo parcialmente recupera la expresión de distrofina en corazones MDX y mejora la función cardiaca medida por la ecocardiografía. (A) Confocal inmunofluorescente de coloración de las secciones de corazón de ratones MDX 2 días después intramiocárdica PBS / MPC-Exo entrega. Azul = DAPI, verde = anticuerpos anti-distrofina. (B) medición ecocardiográfica de la función cardiaca después de 2 días de tratamiento de PBS/MPC-Exo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El método de aislamiento de exosomas pura es esencial para el estudio de la función de exosomas. Una de las técnicas comunes para el aislamiento de exosomas es polietilenglicoles (PEGs) mediada por precipitación17,18,25. Exosomas pueden ser precipitada en las clavijas y peleteado por centrifugación a baja velocidad. Mediada por PEG purificación es muy conveniente y de bajo costo, no necesita ningún equipo avanzado, pero hay preocupación por la pureza de exosomas desde otras lipoproteínas pueden precipitar juntos y son difíciles de eliminar. La ultrafiltración es un método rutinario para la separación de exosomas, basado en el peso molecular y tamaño de exclusión límites26. Aislamiento de ultrafiltración es más rápido que la separación de ultracentrifugación basado, pero puede causar daños estructurales grandes vesículas. La presencia de diferentes epítopos en la membrana de exosomas, como CD63, CD9 y CD8127, proporciona un método alternativo de aislamiento de exosomas por inmunoafinidad interacciones entre estos epitopos y anticuerpos Unidos a bolas magnéticas. Aunque immunoisolation tiene una alta especificidad28, esta técnica tiene desventajas de aislar sólo un subconjunto de la población total de exosomas y puede distorsionar los resultados del experimento. Por lo tanto, ultracentrifugación parece ser más conveniente para este estudio en función de los exosomas.
En este trabajo presentamos un método para la purificación de exosomas por ultracentrifugación secuencial. Después de retirar el resto de células del sobrenadante por centrifugación a 150 x g, restos celulares, cuerpos apoptóticos y vesículas mayores de 220 nm fueron quitados por pasar el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 μm. Exosomas fueron entonces peleteados a 100.000 x g por ultracentrifugación inicial. Para eliminar la contaminación de proteína posible, realizamos una segunda 100.000 x g ultracentrifugación después Resuspender el pellet de exosomas en PBS. Según nuestra experiencia, la ventaja de ultracentrifugación secuencial es la producción de los exosomas con alta pureza y eficiencia, sin embargo, tiene desventaja de bajo rendimiento.
Para permitir que los exosomas inyectados cubrir la mayor parte del ventrículo izquierdo y evitar fugas, se realizó una inyección intramiocárdica utilizando una aguja de insulina 31 G con la punta doblada a unos 20 °. Esta técnica es fundamental para la entrega exitosa de mayoría exosomas en el miocardio y maximiza la exposición de exosomas inyectado a cardiomiocitos de host. Además, se recomienda inyectar exosomas en la región central de la pared anterior del ventrículo izquierdo. Una vez finalizada la inyección, generalmente tenemos la aguja en el sitio de inyección durante 1 min evitar fugas de líquido. Las inyecciones de éxito fueron confirmadas por la presencia de un edema translúcido alrededor del sitio de inyección.
En nuestro estudio, encontramos que MPC-Exo del trasplante allogeneic transitorio puede restaurar la expresión de distrofina en el corazón y mejorar la función cardiaca en MDX ratones22, que puede proporcionar nuevas estrategias para el alivio de los síntomas en pacientes DMD. Ya que se observó la expresión de la proteína distrofina recuperados en corazones de ratón MDX, suponemos que este es el mecanismo para la función cardíaca mejorada, sin embargo, no podemos excluir otros mecanismos, como antiinflamatorio; un informe reciente demostrado que exosomas derivados de células madre mesenquimales mejoran el microambiente del miocardio infartado, contribuir a la angiogénesis y antiinflamatoria29, por otra parte, Aminzadeh et al.30 informó recientemente las células derivadas de CARDIOsphere (CDC) y los exosomas podrían recuperar transitoriamente la expresión de la longitud completa de distrofina en ratones DMD. Considerando que la DMD es una enfermedad sistémica que involucra múltiples órganos, la administración local del miocardio de exosomas no es adecuado para el tratamiento de la insuficiencia respiratoria debido a miopatía del diafragma. Así, la administración sistémica de exosomas, tales como inyección intravenosa, tiene potencial terapéutico, sin embargo, el mayor reto es desarrollar una estrategia efectiva para apuntar exosomas a varios tejidos finos del músculo. Lo más importante, tratamiento de exosomas tiene sólo un efecto transitorio en parcialmente restablecer la expresión de distrofina y mejorar la función cardíaca. Más eficaz, a largo plazo tratamiento de la DMD es necesario.
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Disclosures
Todos los autores declara que tienen no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
Tang fue parcialmente financiado por la American Heart Association: NIH-AR070029, NIH-HL086555, GRNT31430008, HL134354 de NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Filter | Fisherbrand | 09-720-004 | |
| 15 cm Cell Culture Dish | Thermo Fisher Scientific | 157150 | |
| 24 G catheter | TERUMO | SR-OX2419CA | |
| 31 G insulin needle | BD | 328291 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | AAJ19943K2 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| 6-0 suture | Pro Advantage by NDC | P420697 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Anti-Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | |
| Antigen retriever | Aptum Biologics | R2100-US | Antigen recovery |
| Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 | |
| C2C12 cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Centrifuge | Unico | C8606 | |
| Change-A-Tip High Temp Cauteries | Bovie Medical Corporation | HIT | |
| Confocal microscopy | Zeiss | Zeiss 780 Upright Confocal | |
| DBA/2J-mdx mice | The Jackson Laboratory | 013141 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| Goat serum | MP Biomedicals, LLC | 191356 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Henry Schein | 056344 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Mouse Retractor Set | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Rodent ventilator | Harvard Apparatus | 55-7066 | |
| SW-28 Ti rotor | Beckman | 342207 | |
| The Vevo 2100 Imaging Platform | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 2100 | Ultrasound System |
| Ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344058 | |
| Xylazine (XylaMed) | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 1XYL003 8XYL006 |
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