Summary
Nous présentons ici un protocole pour améliorer transitoirement la fonction cardiaque chez les souris de dystrophie musculaire de Duchenne en transplantant des exosomes dérivée de cellules progénitrices myogéniques normal.
Abstract
Duchene de Duchenne (DMD) est une maladie génétique récessive liée à le X causée par un manque de protéine dystrophine fonctionnelle. La maladie ne peut pas être guérie, et que la maladie progresse, le patient développe des symptômes d’insuffisance cardiaque congestive, arythmie et une cardiomyopathie dilatée. Les souris mutantes DMDMDX n’expriment pas la dystrophine et sont couramment utilisés comme un modèle murin de DMD. Dans notre étude récente, nous avons observé que l’injection intramyocardique de type large (WT)-exosomes de dérivés de cellules progéniteurs myogéniques (MPC-Exo) restauré transitoirement l’expression de la dystrophine dans le myocarde de souris mutantes DMDMDX , qui a été associé avec une amélioration transitoire en suggérant que la fonction cardiaque WT-MPC-Exo peut fournir une option pour soulager les symptômes cardiaques de DMD. Cet article décrit la technique de purification MPC-Exo et la transplantation dans les cœurs des souris mutantes DMDMDX .
Introduction
Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une lié à le X récessive, progressive maladie neuromusculaire due à une mutation dans le gène DMD et la perte de la dystrophine fonctionnelle1. La dystrophine est exprimée principalement dans le myocarde et le muscle squelettique et est moins exprimée dans le muscle lisse, les glandes endocrines et les neurones2,3. DMD est le type le plus commun de la dystrophie musculaire avec une fréquence d’un par 3 500 à 5 000 garçons nouveau-nés dans le monde entier4,5. Individus développent généralement une nécrose musculaire progressive, perte de la marche indépendante de début de l’adolescence et la mort dans les décennies de deuxième et troisième de leur vie en raison de l’insuffisance cardiaque et insuffisance respiratoire6.
Cardiomyopathie dilatée, arythmies et insuffisance cardiaque congestive sont des manifestations cardiovasculaires courantes de DMD7,8. La maladie ne peut pas être guérie, un traitement de soutien peut améliorer les symptômes ou retarder la progression de l’insuffisance cardiaque, mais il est très difficile d’améliorer le cœur fonction9,10.
Similaires aux patients DMD, la dystrophie musculaire liée à le X (MDX) souris sont déficientes en protéine dystrophine et les symptômes présents de cardiomyopathie11et sont donc largement utilisés dans la recherche de cardiomyopathie DMD associé. Afin de rétablir la dystrophine dans les muscles affectés, la thérapie de cellules souches allogéniques s’est avéré pour être un traitement efficace pour la DMD12,13,14. Exosomes, vésicules de membrane de 30-150 nm sécrétées par divers types de cellules, jouent un rôle clé dans la communication de cellule-cellule par l’intermédiaire de transport de matériel génétique, telles que l’ARN messager (ARNm) et non-codantes RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Nos études antérieures ont montré qu’exosomes dérivé de progéniteurs myogéniques (MPC), tels que la lignée C2C12, peut transférer la dystrophine ARNm d’hôte cardiomyocytes après injection cardiaque directe22, indiquant que la livraison allogénique de Les exosomes dérivé de MPC (MPC-Exo) peut restaurer transitoirement l’expression des gènes chez les souris MDX DMD. Cet article se concentre sur les techniques de purification et de la transplantation MPC-Exo.
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Protocol
Les animaux ont été traités conformément aux protocoles approuvés et règlements de bien-être des animaux du comité d’utilisation de la Medical College of Georgia, à Augusta université et animalier institutionnel.
1. isolement et Purification des Exosomes dérivé de MPC
- Cellules6 C2C12 semences 5 x 10 dans une boîte de Petri de cellule de 15 cm avec de Dulbecco complet 20 mL aigle modifié (DMEM) contenant 10 % sérum fœtal (SVF), 100 U/mL de pénicilline G et 100 μg/mL de streptomycine. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO2.
- Préparer le milieu appauvri en exosome par ultracentrifugation de FBS à 100 000 x g pendant 18 heures à 4 ° C à l’aide d’un rotor oscillant de seau. Jeter le culot.
- Remplacer le DMEM complet avec milieu appauvri en exosome lorsque monocouche cellules atteignent 80 % confluent dans la boîte de pétri.
- Utiliser une pipette de transfert pour recueillir le surnageant de la boîte de Petri de cellule toutes les 48 h pour un total de trois fois. Recueillir le liquide surnageant dans les tubes à centrifuger 50 mL et centrifuger à 150 x g pendant 10 min enlever les cellules restantes.
- Filtrer le liquide surnageant à travers un filtre de 0,22 μm pour éliminer les débris cellulaires. Ultracentrifugeuse le milieu filtré dans des tubes ultra claires par le rotor de seau se balançant à 100 000 x g pendant 120 min à 4 ° C à précipiter les exosomes.
- Resuspendre le culot contenant de l’exosome dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et remplir le tube ultra clair ensemble avec du PBS. Effectuer ultracentrifugation de cette suspension à 100 000 x g pendant 120 min à 4 ° C pour éliminer les protéines contaminantes.
- Jeter le surnageant et resuspendre le culot de l’exosome dans 100 µL de PBS. Stocker à-80 ° C pour une utilisation future.
- Pour une analyse au microscope électronique, placez 3 µL de suspension exosomal sur une grille de formvar revêtus de cuivre au microscope électronique de 200 mailles pendant 5 min à température ambiante. Continuer avec l’acétate d’uranyle standard23de coloration. Examiner la grille semi sèche par microscopie électronique à transmission.
2. Intramyocardique Exosome livraison
Remarque : Nous avons utilisé des six souris dans chaque groupe.
- D’offrir une souris DBA/2J-DMDMDX (mâle, âge > 10 mois ; poids corporel (PC) > 18 g) avec l’injection intrapéritonéale (i.p.) de 100 mg/kg de poids vif de la kétamine combinée à 10 mg/kg de poids vif de xylazine et confirmer la profondeur de l’anesthésie par pincement de l’orteil.
- Fixer chaque souris en décubitus dorsal sur une plate-forme chirurgicale à l’aide de ruban adhésif pour fixer chaque branche et placer une suture de 3-0 horizontalement sous les dents du haut pour tenir la mâchoire supérieure en place.
- Appliquer la crème dépilatoire sur le côté gauche de la poitrine de souris pour enlever la fourrure de la peau.
- Effectuer une intubation endotrachéale via la cavité buccale à l’aide d’un cathéter de 24 G et Ventilez la souris avec l’air ambiant à un taux de 195 respirations/min à l’aide d’un ventilateur de rongeur (voir la Table des matières).
- Désinfecter la peau avec l’alcool à 75 % et 10 % polyvidone iodée.
- Faire une incision oblique de 10\u201215 mm entre le bord gauche du sternum à l’aisselle gauche, couper le pectoral et pectoralis minor de ciseaux, puis effectuez une thoracotomie gauche par le quatrième espace intercostal. Insérer délicatement les bandes de rétracteur pour répandre la cavité thoracique pour une largeur de 10 mm. Prenez soin de ne pas endommager le poumon gauche.
- Utiliser deux pinces droites pour enlever le péricarde, les separer et placez-les derrière les conseils de rétracteur pour exposer le cœur. Injecter le MPC-Exo (50 μg dans 30 µL de PBS) ou 30 μL PBS (comme un contrôle) intramyocardially dans la paroi antérieure du ventricule gauche en utilisant une aiguille de l’insuline de 31 G à un site.
- Utiliser des sutures de nylon 6-0 pour fermer la cavité thoracique, muscles pectoraux et la peau en séquence.
- Récupérer la souris. Présence d’une respiration rythmique, spontanée, retirer les souris du ventilateur et extuber. Observer et enregistrer l’état de la souris après la chirurgie.
3. Echocardiographie
Remarque : Un seul observateur aveuglé aux groupes expérimentaux effectue une analyse échocardiographie et données.
- Deux jours après la transplantation de PBS/exosome, anesthésier les souris à l’isoflurane 1\u20122%.
- Fixer une souris en décubitus dorsal à l’aide de ruban adhésif, puis appliquez le gel acoustique préchauffé sur la poitrine gauche.
-
Évaluer la fonction ventriculaire gauche par échocardiographie comme précédemment décrit16,24.
- Obtenir la vue parasternale grand axe du ventricule gauche (VG) en deux dimensions (mode B) et puis faire pivoter la sonde d’échographie 90° pour obtenir une vue d’axe court LV au niveau du muscle papillaire.
- Enregistrer des images échocardiographiques mode M et mesure gauche ventriculaire télédiastolique diamètre (LVEDD), volume télésystolique ventriculaire gauche (LVESD), volume télédiastolique ventriculaire gauche (préopératoire) et volume télésystolique ventriculaire gauche (LVESV).
Remarque : Fractionnaire raccourcissement (FS %) = [(LVEDD − LVESD) / LVEDD] x 100 et la fraction d’éjection ventriculaire gauche (FEVG %) = [(LVEDV − LVESV) / préopératoire] x 100.
4. immunohistochimie
- Deux jours après la transplantation de PBS/exosome, offrir une souris (reportez-vous à l’étape 2.1) et couper le sternum ouvert pour exposer la cavité thoracique. Disséquer la veine cave inférieure et perfuse le coeur dans l’apex du ventricule gauche avec 3 mL de PBS, puis 3 mL de paraformaldéhyde à 4 % à la température ambiante, à l’aide d’un cathéter de papillon avec une aiguille 25 G attachée à une seringue de 5 mL.
- Intégrer des coeurs fixe dans la paraffine et coupez-les en coupes épaisses de 5 μm.
- Déparaffiner diapositives de xylène et réhydrater en solutions d’éthanol dans l’ordre suivant : 100 % de xylène (3 min), 100 % xylène (3 min), 100 % d’éthanol (1 min), 100 % d’éthanol (1 min), éthanol à 95 % (1 min), 80 % d’éthanol (1 min), H2O (1 min).
- Difficulté des sections de tissu avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 8 min à température ambiante.
- Immerger les lames dans le citrate de sodium (0,01 M, pH 6,0) et d’effectuer la recherche d’antigène à l’aide d’un extracteur d’antigène.
- Permeabilize sections pendant 1 h à température ambiante avec éther de tert-octylphényle de polyéthylèneglycol de 1 % dans du PBS.
- Bloquer les sections avec 5 % de sérum de chèvre dans du PBS pendant 1 h à température ambiante.
- Incuber les sections avec l’anticorps primaire dilué (anticorps anti-dystrophine) dans du PBS (1/100) durant la nuit à 4 ° C, puis laver trois fois avec du PBS pendant 5 min.
- Incuber les sections avec un anticorps secondaire dilué (Alexa Fluor 488 conjugué chèvre anti-lapin IgG) dans du PBS (1 : 400) pendant 45 min à température ambiante.
- Contrôle en autofluorescence utilisant une trempe d’autofluorescence kit (voir la Table des matières).
- Milieu de montage utilisation contenant DAPI (voir la Table des matières) pour monter les diapositives.
- Observer les diapositives sous un microscope confocal.
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Representative Results
Un ordinogramme pour isoler et purifier les exosomes des cellules C2C12 est montré dans la Figure 1A. Pour confirmer la présence des exosomes, nous avons effectué analyse de microscopie électronique à transmission. Image de microscopie électronique à transmission (Figure 1B) montre la morphologie des vésicules forme rond et lumineux des exosomes C2C12 dérivé. Analyse par Western blot ont confirmé la présence de marqueurs de l’exosome, y compris de CD63 et TSG101 (Figure 1C).
Nous avons observé une zone translucide oedème après intramyocardique injection de PBS/MPC-Exo dans la paroi antérieure du ventricule gauche de souris MDX (Figure 2), ce qui indique l’injection réussie dans le myocarde.
Pour déterminer que si cardiaque MPC-Exo livraison restaure expression de la protéine dystrophine dans les coeurs MDX, nous avons exécuté par immunofluorescence souillant pour la dystrophine et d’imagerie avec un microscope confocal. Nous avons observé un rétablissement partiel de l’expression de la dystrophine avec localisation de membrane dans certains des cardiomyocytes (Figure 3A). Pour déterminer si la transplantation de MPC-Exo améliore la fonction cardiaque chez la souris MDX, nous avons mesuré la fonction cardiaque par échocardiographie 2jours après intramyocardique PBS / MPC-Exo livraison. Comme le montre la Figure 3B, MPC-Exo traitement amélioré mouvement paroi antérieure par rapport à PBS, suggérant que la MPC-Exo transplantation amélioré la fonction cardiaque chez les souris MDX.
Figure 1 : Exosome purification et caractérisation par microscopie électronique. (A), le diagramme affiche chaque étape de l’isolement et la purification du MPC-Exo. (B), l’image montre des vésicules rondes et en forme de coupe sous microscopie électronique. Echelle = 100 nm. Analyse par Western blot (C) a confirmé la présence de marqueurs de l’exosome CD63 et TSG101. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Injection Intramyocardique de PBS ou MPC-Exo. Un oedème translucide a été observé dans la paroi antérieure ventriculaire gauche après intramyocardique PBS/exosome livraison. (A) PBS injection. (B) injection MPC-Exo. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Livraison Intramyocardique du MPC-Exo partiellement récupère l’expression de la dystrophine dans les coeurs MDX et améliore la fonction cardiaque mesurée par échocardiographie. (A) Confocal par immunofluorescence souillant les sections coeur de souris MDX 2jours après intramyocardique PBS / MPC-Exo livraison. Bleu = DAPI, vert = anticorps anti-dystrophine. (B) des mesures échocardiographiques de la fonction cardiaque après 2 jours de traitement PBS/MPC-Exo. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La méthode consistant à isoler les exosomes pure est essentielle pour l’étude de la fonction des exosomes. Une des techniques communes pour l’isolement de l’exosome est polyéthylène glycols (PEG) médiée par précipitation17,18,25. Exosomes peut être précipité dans les chevilles et granulés par centrifugation à basse vitesse. PEG-mediated purification est très pratique et peu coûteux, il n’a pas besoin des équipements de pointe, mais on s’inquiète de la pureté des exosomes puisque les autres lipoprotéines peuvent être précipités ensemble et sont difficiles à enlever. L’ultrafiltration est une méthode de routine pour la séparation de l’exosome, basée sur le poids moléculaire et exclusion dimensions limites26. Isolement d’ultrafiltration est plus rapide que la séparation de l’ultracentrifugation basée, mais elle peut causer des dommages structurels à grosses vésicules. La présence d’épitopes différents sur la membrane des exosomes, tels que CD9, CD63 et CD8127, fournit une méthode alternative d’isoler les exosomes par immunoaffinité des interactions entre ces épitopes et les anticorps liés à billes magnétiques. Bien qu’immunoisolation ait une spécificité élevée28, cette technique présente des inconvénients d’isoler uniquement un sous-ensemble de la population totale exosome et susceptibles de fausser les résultats de l’expérience. Par conséquent, ultracentrifugation semble être plus approprié pour cette étude sur la fonction de l’exosome.
Dans cet article, nous présentons une méthode pour la purification des exosomes par ultracentrifugation séquentielle. Après avoir enlever les autres cellules du surnageant par centrifugation à 150 x g, les débris cellulaires, corps apoptotiques et vésicules supérieure à 220 nm ont été supprimés en passant le surnageant à travers un filtre de 0,22 µm. Exosomes étaient ensuite granulées à 100 000 x g par ultracentrifugation initiale. Salissures de protéine possible, nous avons effectué un deuxième 100 000 x g ultracentrifugation après resuspendant le culot de l’exosome dans du PBS. Selon notre expérience, l’avantage d’ultracentrifugation séquentielle est la production des exosomes avec haute pureté et rapport coût-efficacité, toutefois, elle a désavantage de faible rendement.
Afin de permettre les exosomes injectée couvrir la majeure partie du ventricule gauche et éviter les fuites, nous avons réalisé une intramyocardique injection à l’aide d’une aiguille de l’insuline de 31 G avec le bout plié à environ 20 °. Cette technique est essentielle pour la réalisation de la plupart des exosomes dans le myocarde et optimise l’exposition des exosomes injectée à hôte cardiomyocytes. En outre, nous vous recommandons d’injecter les exosomes dans la région centrale de la paroi antérieure du ventricule gauche. Une fois l’injection terminée, nous tiennent habituellement l’aiguille au point d’injection pendant 1 min éviter les fuites de liquide. Les injections réussies ont été confirmées par la présence d’un œdème translucide autour du site d’injection.
Dans notre étude, nous avons constaté que transplantation allogénique de MPC-Exo peut transitoirement restaurer l’expression de la dystrophine dans coeur et améliorer la fonction cardiaque dans MDX souris22, qui peuvent fournir de nouvelles stratégies pour le soulagement des symptômes chez les patients DMD. Étant donné que nous avons observé l’expression de la protéine dystrophine récupérés dans les coeurs de souris MDX, nous supposons que c’est le mécanisme de la fonction cardiaque améliorée, toutefois, nous ne pouvons exclure d’autres mécanismes, tels que les anti-inflammatoires ; un rapport récent a démontré qu’exosomes de dérivés de cellules souches mésenchymateuses améliorer le microenvironnement du myocarde infarci contribuant aux processus angiogénique et anti-inflammatoire29, en outre, Aminzadeh et coll.30 a récemment rapporté que cellules dérivées de cardiosphere (CDCs) et leur exosomes pourrait rétablir transitoirement l’expression de la dystrophine pleine longueur chez les souris de la DMD. Considérant que le DMD est une maladie systémique, impliquant plusieurs organes, la remise locale myocardique de l’exosome n’est pas apte à traiter une insuffisance respiratoire à cause de la myopathie de diaphragme. Ainsi, l’administration systémique d’exosomes, telles que l’injection par voie intraveineuse, a un potentiel thérapeutique, cependant, le défi majeur est de développer une stratégie efficace pour cibler les exosomes de multiples tissus musculaires. Plus important encore, traitement de l’exosome n'a qu’un effet transitoire sur partiellement restaurer l’expression de la dystrophine et améliorer la fonction cardiaque. Traitement de DMD plus efficace, à long terme est nécessaire.
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Disclosures
Tous les auteurs déclare qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêt.
Acknowledgments
Tang ont été partiellement pris en charge par l’American Heart Association : NIH-AR070029, NIH-HL086555, GRNT31430008, NIH-HL134354.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Filter | Fisherbrand | 09-720-004 | |
| 15 cm Cell Culture Dish | Thermo Fisher Scientific | 157150 | |
| 24 G catheter | TERUMO | SR-OX2419CA | |
| 31 G insulin needle | BD | 328291 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | AAJ19943K2 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| 6-0 suture | Pro Advantage by NDC | P420697 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Anti-Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | |
| Antigen retriever | Aptum Biologics | R2100-US | Antigen recovery |
| Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 | |
| C2C12 cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Centrifuge | Unico | C8606 | |
| Change-A-Tip High Temp Cauteries | Bovie Medical Corporation | HIT | |
| Confocal microscopy | Zeiss | Zeiss 780 Upright Confocal | |
| DBA/2J-mdx mice | The Jackson Laboratory | 013141 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| Goat serum | MP Biomedicals, LLC | 191356 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Henry Schein | 056344 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Mouse Retractor Set | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Rodent ventilator | Harvard Apparatus | 55-7066 | |
| SW-28 Ti rotor | Beckman | 342207 | |
| The Vevo 2100 Imaging Platform | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 2100 | Ultrasound System |
| Ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344058 | |
| Xylazine (XylaMed) | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 1XYL003 8XYL006 |
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