Summary
Qui, presentiamo un protocollo per migliorare la funzione cardiaca nei topi di distrofia muscolare di Duchenne transitoriamente trapiantando esosomi derivati da cellule progenitrici myogenic normale.
Abstract
Duchene distrofia muscolare (DMD) è una malattia genetica recessiva legata al X causata da una mancanza di distrofina funzionale. La malattia non può essere curata, e come la malattia progredisce, il paziente sviluppa sintomi di scompenso cardiaco, aritmia e cardiomiopatia dilatativa. I topi mutanti DMDMDX non esprimono distrofina e sono comunemente usati come un modello murino di DMD. Nel nostro recente studio, abbiamo osservato che l'iniezione intramiocardica di tipo largo (WT)-esosomi derivato da cellule progenitrici myogenic (MPC-Exo) ripristino transitoriamente l'espressione di distrofina nel miocardio dei topi mutanti DMDMDX , che è stato associato con un miglioramento transitorio nella funzione cardiaca suggerendo che WT-MPC-Exo può fornire un'opzione per alleviare i sintomi cardiaci di DMD. Questo articolo descrive la tecnica di purificazione di MPC-Exo e trapianto nei cuori dei topi mutanti DMDMDX .
Introduction
Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una X-linked recessiva neuromuscolare malattia progressiva causata da una mutazione nel gene DMD e la perdita di distrofina funzionale1. Distrofina è espresso principalmente nel miocardio e nel muscolo scheletrico e meno è espressa nel muscolo liscio, ghiandole endocrine e neuroni2,3. DMD è il tipo più comune di distrofia muscolare con un'incidenza di uno per 3.500 a 5.000 ragazzi neonato in tutto il mondo4,5. Gli individui si sviluppano tipicamente necrosi progressiva del muscolo, perdita della deambulazione indipendente dalla prima adolescenza e morte nei decenni della loro vita a causa di scompenso cardiaco e insufficienza respiratoria6secondo al terzo.
Cardiomiopatia dilatativa, aritmie e scompenso cardiaco sono manifestazioni comuni cardiovascolare di DMD7,8. La malattia non può essere curata, trattamento di supporto può migliorare i sintomi o ritardare la progressione dell'insufficienza cardiaca, ma è molto difficile migliorare il cuore funzione9,10.
Simile ai pazienti di DMD, distrofia muscolare X-collegata (MDX) topi sono carenti di distrofina e presenti sintomi di cardiomiopatia11e di conseguenza sono ampiamente usati nella DMD associata cardiomiopatia ricerca. Al fine di ripristinare la distrofina in muscoli commoventi, terapia di trapianto allogeneic della cellula formativa ha dimostrato di essere un efficace trattamento per DMD12,13,14. Esosomi, vescicole di membrana di 30-150 nm secernute da vari tipi cellulari, svolgono un ruolo chiave nella comunicazione cellula--cellula attraverso il trasporto di materiale genetico, come RNA messaggero (mRNA) e non-codificazione RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Nostri studi precedenti hanno dimostrato che gli esosomi derivati da cellule progenitrici myogenic (MPC), ad esempio linea di cellule C2C12, possono trasferire dystrophin mRNA a host cardiomiociti dopo iniezione cardiaca diretta22, che indica quella consegna allogenico di MPC-derivato esosomi (MPC-Exo) possono ripristinare transitoriamente DMD espressione genica nei topi MDX. Questo articolo si concentra su tecniche di purificazione e trapianto di MPC-Exo.
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Protocol
Gli animali sono stati gestiti secondo protocolli approvati e le norme sul benessere degli animali del Comitato uso il Medical College della Georgia all'Università di Augusta e istituzionali Animal Care.
1. isolamento e purificazione di esosomi MPC-derivato
- Seme 5 x 106 C2C12 celle in una piastra di coltura cellulare di 15cm con 20ml completo Dulbecco modificate, mezzo di Eagle (DMEM) contenente 10% siero bovino fetale (FBS), 100 U/mL di penicillina G e 100 μg/mL di streptomicina. Incubare a 37 ° C e 5% CO2.
- Preparare il supporto di esosomi-vuotati dall'ultracentrifugazione di FBS a 100.000 x g per 18 ore a 4 ° C, utilizzando un rotore oscillante. Scartare il pellet.
- Sostituire il DMEM completo con esosomi-vuotati medio quando le cellule dello strato monomolecolare raggiungono 80% confluenza nella piastra di coltura.
- Utilizzare una pipetta di trasferimento per raccogliere il surnatante da piastra di coltura cellulare ogni 48 h per un totale di tre volte. Raccogliere il surnatante in provette centrifuga da 50 mL e centrifugare a 150 x g per 10 min rimuovere le cellule rimanenti.
- Filtrare il surnatante attraverso un filtro di 0,22 μm per eliminare i detriti cellulari. Ultracentrifuga il mezzo filtrato in ultra-chiari tubi utilizzando il rotore oscillante a 100.000 x g per 120 min a 4 ° C per precipitare esosomi.
- Risospendere il pellet contenente esosomi in tampone fosfato salino (PBS) e riempire l'intero tubo ultra-trasparente con PBS. Eseguire ultracentrifugazione di questa sospensione a 100.000 x g per 120 min a 4 ° C per eliminare le proteine contaminanti.
- Eliminare il supernatante e risospendere il pellet di esosomi in 100 µ l PBS. Conservare a-80 ° C per un uso futuro.
- Per analisi di microscopia elettronica, posto 3 µ l di sospensione exosomal su una griglia di formvar-rivestito rame microscopio elettronico 200 mesh per 5 min a temperatura ambiente. Continuare con acetato di uranile standard colorazione23. Esaminare la griglia semi-secca di microscopia elettronica di trasmissione.
2. intramiocardico esosomi consegna
Nota: Abbiamo usato i sei topi in ogni gruppo.
- Anestetizzare topi DBA/2J-DMDMDX (maschio; età > 10 mesi; peso corporeo (BW) > 18 g) con l'iniezione intraperitoneale (i.p.) di 100 mg/kg BW di ketamina combinato con 10 mg/kg BW di xilazina e confermare la profondità dell'anestesia con pizzico di punta.
- Difficoltà ogni mouse in posizione supina su una piattaforma chirurgica utilizzando nastro per fissare ogni arto e collocare una sutura 3-0 orizzontalmente sotto i denti superiori per tenere la mascella superiore in posizione.
- Applicare la crema depilatoria sul lato sinistro del petto del mouse per rimuovere il pelo dalla pelle.
- Eseguire l'intubazione endotracheale tramite cavità orale utilizzando un catetere 24G e ventilare il mouse con l'aria ambiente a una velocità di 195 respiri/min utilizzando un ventilatore del roditore (Vedi la Tabella materiali).
- Disinfettare la pelle con alcool di 75% e 10% povidone iodio.
- Fare una 10\u201215 incisione obliqua mm dal bordo sternale sinistro per l'ascella sinistra, tagliato il pettorale e il pettorale minore di una forbice, poi fare un thoracotomy di sinistra attraverso il quarto spazio intercostale. Inserire delicatamente le bande di riavvolgitore per diffondere la cavità toracica ad una larghezza di 10 mm. Prestare attenzione per evitare danni al polmone sinistro.
- Utilizzare due dritto pinzette per rimuovere il pericardio, li separano e metterli dietro le punte del divaricatore per esporre il cuore. Iniettare MPC-Exo (50 μg in 30 µ l PBS) o 30 μL PBS (come controllo) intramyocardially nella parete anteriore del ventricolo sinistro usando un ago da insulina 31G presso un unico sito.
- Utilizzare suture in nylon 6-0 per chiudere la cavità toracica, muscoli pettorali e la pelle in sequenza.
- Recuperare i topi. Una volta che la respirazione ritmica, spontanea è presente, è possibile rimuovere i topi dal ventilatore ed estubare. Osservare e registrare la condizione di topi dopo l'intervento chirurgico.
3. l'ecocardiografia
Nota: Un singolo osservatore cieco per i gruppi sperimentali esegue ecocardiografia e analisi dei dati.
- Due giorni dopo il trapianto di PBS/esosomi, anestetizzare i topi con isoflurano 1\u20122%.
- Difficoltà un mouse in posizione supina usando del nastro e applicare il gel acustico preriscaldato sulla zona sinistra del petto.
-
Valutare la funzione ventricolare di sinistra da ecocardiografia come precedentemente descritto16,24.
- Ottenere la visualizzazione di parasternale asse lungo del ventricolo sinistro (LV) in due dimensioni (modalità B) e quindi ruotare la sonda ad ultrasuoni 90° per ottenere una visione di breve-asse di LV a livello del muscolo papillare.
- Registrare le immagini ecocardiografiche M-mode e misura diametro in fine-diastolica ventricolare sinistra (LVEDD), volume telesistolico ventricolare sinistro (LVESD), volume end-diastolic ventricolare sinistra (LVEDV) e il volume telesistolico ventricolare sinistro (LVESV).
Nota: Riduzione frazionaria (% FS) = [(LVEDD − LVESD) / LVEDD] x 100 e frazione di eiezione ventricolare sinistra (LVEF %) = [(LVEDV − LVESV) / LVEDV] x 100.
4. Immunohistochemistry
- Due giorni dopo il trapianto di PBS/esosomi, anestetizzare topi (Vedi punto 2.1) e tagliare lo sterno aperto per esporre la cavità toracica. Sezionare la vena cava inferiore e irrorare il cuore attraverso l'apice del ventricolo sinistro con 3 mL di PBS, seguita da 3 mL di paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente, utilizzando un catetere di farfalla con un ago 25 G collegato ad una siringa da 5 mL.
- Incorpora cuori fissi in paraffina e tagliati in sezioni spesse di 5 μm.
- Deparaffinizzare xilene e reidratare in soluzioni di etanolo nel seguente ordine: 100% xilene (3 min), 100% xilene (3 min), etanolo al 100% (1 min), etanolo al 100% (1 min), etanolo al 95% (1 min), 80% di etanolo (1 min), H2O (1 min).
- Difficoltà sezioni di tessuto con paraformaldeide al 4% per 8 min a temperatura ambiente.
- Immergere i vetrini in citrato di sodio (0,01 M, pH 6.0) ed eseguire il ricupero dell'antigene utilizzando un documentalista di antigene.
- Permeabilize sezioni per 1 h a temperatura ambiente con 1% polietilene glicole etere tert-octylphenyl in PBS.
- Bloccare le sezioni con siero di capra del 5% in PBS per 1 h a temperatura ambiente.
- Incubare le sezioni con l'anticorpo primario diluito (anticorpo anti-distrofina) in PBS (1: 100) durante la notte a 4 ° C, quindi lavare tre volte con PBS per 5 min.
- Incubare le sezioni con anticorpo secondario diluito (Alexa Fluor 488 coniugato anti-coniglio di capra IgG) in PBS (1: 400) per 45 min a temperatura ambiente.
- Controllo autofluorescence utilizzando un'autofluorescenza tempra kit (vedere la Tabella materiali).
- Mezzo di montaggio uso contenente DAPI (Vedi la Tabella materiali) per montare le diapositive.
- Osservare vetrini al microscopio confocale.
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Representative Results
Un diagramma di flusso per isolare e purificare gli esosomi da cellule C2C12 è illustrato nella Figura 1A. Per confermare la presenza di esosomi, abbiamo effettuato l'analisi di microscopia elettronica di trasmissione. Immagine di microscopia elettronica di trasmissione (Figura 1B) Mostra la morfologia delle vescicole di forma rotonda e brillante degli esosomi C2C12 derivato. L'analisi Western blot ha confermato la presenza di marcatori di esosomi, tra cui CD63 e TSG101 (Figura 1C).
Abbiamo osservato un'area traslucida edema dopo intramiocardico PBS/MPC-Exo iniezione nella parete anteriore del ventricolo sinistro di topi MDX (Figura 2), che indica l'iniezione successo nel miocardio.
Per determinare se cardiaca MPC-Exo consegna ristabilisce l'espressione della proteina distrofina nei cuori MDX, abbiamo effettuato immunofluorescente macchiatura per distrofina e imaging con un microscopio confocale. Abbiamo osservato il ripristino parziale dell'espressione di distrofina con localizzazione in membrana in alcuni dei cardiomiociti (Figura 3A). Per determinare se il trapianto di MPC-Exo migliora la funzione cardiaca nei topi MDX, abbiamo misurato la funzione cardiaca mediante ecocardiografia 2 giorni dopo intramiocardico PBS / MPC-Exo consegna. Come illustrato nella Figura 3B, MPC-Exo trattamento ha migliorato il movimento della parete anteriore rispetto con PBS, suggerendo che il trapianto di MPC-Exo migliorato la funzione cardiaca nei topi MDX.
Figura 1 : Esosomi purificazione e caratterizzazione mediante microscopia. (A), il diagramma viene illustrato ogni passaggio di isolamento e purificazione di MPC-Exo. (B), l'immagine mostra vescicole rotonde e a forma di Coppa in microscopia elettronica. Barra della scala = 100 nm. (C) l'analisi Western blot ha confermato la presenza di marcatori di esosomi CD63 e TSG101. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Iniezione intramiocardica di PBS o MPC-Exo. Un edema traslucido è stato osservato nella parete anteriore ventricolare sinistra dopo intramiocardico PBS/esosomi consegna. Iniezione (A), PBS. (B) iniezione di MPC-Exo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Consegna intramiocardico di MPC-Exo parzialmente recupera espressione di distrofina nei cuori MDX e migliora la funzione cardiaca misurata da ecocardiografia. (A) confocale immunofluorescente macchiatura le sezioni di cuore di topi MDX 2 giorni dopo intramiocardico PBS / MPC-Exo consegna. Blu = DAPI, verde = anticorpo anti-distrofina. (B) misure ecocardiografica della funzione cardiaca dopo 2 giorni di trattamento di PBS/MPC-Exo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo di isolamento esosomi puri è essenziale per studiare la funzione di esosomi. Una delle tecniche comuni per l'isolamento di esosomi è polietilenglicoli (pioli) mediate precipitazioni17,18,25. Esosomi possono essere precipitati in pioli e pellettati mediante centrifugazione a bassa velocità. PEG-mediata di purificazione è molto conveniente, basso costo, non ha bisogno di qualsiasi attrezzatura avanzata, ma c'è preoccupazione per la purezza degli esosomi poiché altre lipoproteine possono essere precipitati insieme e sono difficili da rimuovere. Ultrafiltrazione è un metodo sistematico per la separazione di esosomi, sulla base del peso molecolare ed esclusione dimensioni limiti26. Isolamento di ultrafiltrazione è più veloce di ultracentrifugazione basata di separazione, ma può causare danni strutturali alle grandi vescicole. La presenza di vari epitopi sulla membrana di esosomi, quali CD9, CD63 e CD8127, fornisce un metodo alternativo di isolando gli esosomi con immunoaffinità interazioni tra questi epitopi e gli anticorpi legati a biglie magnetiche. Anche se immunoisolation ha un' alta specificità28, questa tecnica presenta svantaggi di isolare solo un sottoinsieme della popolazione totale esosomi e falsare i risultati dell'esperimento. Di conseguenza, ultracentrifugazione sembra essere più adatto per questo studio sulla funzione di esosomi.
In questa carta, presentiamo un metodo per la purificazione di esosomi dall'ultracentrifugazione sequenziale. Dopo rimozione le restanti cellule dal surnatante mediante centrifugazione a 150 x g, i detriti cellulari, corpi apoptotici e vescicole più grandi di 220 nm sono stati rimossi passando il surnatante attraverso un filtro di 0,22 μm. Esosomi erano quindi pellettati a 100.000 x g dall'ultracentrifugazione iniziale. Per rimuovere la contaminazione possibile della proteina, abbiamo effettuato una seconda 100.000 x g ultracentrifugazione dopo risospendere il pellet di esosomi in PBS. Secondo la nostra esperienza, il vantaggio di ultracentrifugazione sequenziale è la produzione di esosomi con elevata purezza e costo-efficacia, tuttavia, ha svantaggio di basso rendimento.
Al fine di consentire gli esosomi iniettati coprire la maggior parte del ventricolo sinistro ed evitare perdite, abbiamo effettuato una iniezione intramiocardica utilizzando un ago da insulina 31G con la punta piegata a circa 20 °. Questa tecnica è fondamentale per il successo della fornitura di esosomi maggior parte nel miocardio e massimizza l'esposizione degli esosomi iniettati a host cardiomyocytes. Inoltre, si consiglia di iniettare esosomi nella regione centrale della parete anteriore del ventricolo sinistro. Una volta completata l'iniezione, siamo di solito tenere l'ago al sito di iniezione per 1 min evitare perdite di liquida. Iniezioni di successo sono state confermate dalla presenza di un edema traslucido intorno al sito di iniezione.
Nel nostro studio, abbiamo trovato che il trapianto allogenico di MPC-Exo può transitoriamente ripristinare espressione di distrofina nel cuore e migliorare la funzione cardiaca in MDX topi22, che potrebbero fornire nuove strategie per alleviare i sintomi in pazienti DMD. Poiché abbiamo osservato l'espressione della proteina distrofina recuperati nei cuori del topo MDX, ci assumiamo che questo è il meccanismo per la funzione del cuore migliore, tuttavia, non possiamo escludere altri meccanismi, come anti-infiammatorio; un rapporto recente ha dimostrato che gli esosomi derivati da cellule staminali mesenchimali migliorare il microambiente del miocardio infartuato contribuendo all'angiogenesi e anti-infiammatorio29, inoltre, Aminzadeh et al.30 recentemente riferito che cellule derivate da cardiosfere (CDCs) e loro esosomi transitoriamente potrebbero ripristinare l'espressione di distrofina integrale nei topi di DMD. Considerando che la DMD è una malattia sistemica che coinvolge gli organi multipli, la consegna locale del miocardio di esosomi non è adatta per il trattamento di insufficienza respiratoria dovuto myopathy del diaframma. Così, la somministrazione sistemica di esosomi, come iniezione endovenosa, ha potenziale terapeutico, tuttavia, la sfida principale è di sviluppare una strategia efficace per il targeting esosomi ai tessuti muscolari multipli. Ancora più importante, il trattamento di esosomi ha solo un effetto temporaneo sulla parzialmente il ristabilimento dell'espressione di distrofina e migliorare la funzione del cuore. È necessario un trattamento a lungo termine più efficace DMD.
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Disclosures
Tutti gli autori dichiara che non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Tang erano parzialmente supportato dall'associazione americana del cuore: NIH-AR070029, NIH-HL086555, GRNT31430008, NIH-HL134354.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Filter | Fisherbrand | 09-720-004 | |
| 15 cm Cell Culture Dish | Thermo Fisher Scientific | 157150 | |
| 24 G catheter | TERUMO | SR-OX2419CA | |
| 31 G insulin needle | BD | 328291 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | AAJ19943K2 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| 6-0 suture | Pro Advantage by NDC | P420697 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Anti-Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | |
| Antigen retriever | Aptum Biologics | R2100-US | Antigen recovery |
| Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 | |
| C2C12 cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Centrifuge | Unico | C8606 | |
| Change-A-Tip High Temp Cauteries | Bovie Medical Corporation | HIT | |
| Confocal microscopy | Zeiss | Zeiss 780 Upright Confocal | |
| DBA/2J-mdx mice | The Jackson Laboratory | 013141 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| Goat serum | MP Biomedicals, LLC | 191356 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Henry Schein | 056344 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Mouse Retractor Set | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Rodent ventilator | Harvard Apparatus | 55-7066 | |
| SW-28 Ti rotor | Beckman | 342207 | |
| The Vevo 2100 Imaging Platform | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 2100 | Ultrasound System |
| Ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344058 | |
| Xylazine (XylaMed) | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 1XYL003 8XYL006 |
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