Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um vorübergehend verbessern Herzfunktion bei Duchenne-Muskeldystrophie Mäusen durch die Transplantation von Exosomen von normalen myogen Vorläuferzellen abgeleitet.
Abstract
Duchene Muskeldystrophie (DMD) ist eine X-chromosomal rezessive genetische Krankheit verursacht durch einen Mangel an funktionalen Dystrophin-Protein. Die Krankheit kann nicht geheilt werden, und wenn die Krankheit fortschreitet, entwickelt der Patient Symptome einer dilatative Kardiomyopathie, Herzrhythmusstörungen und Herzinsuffizienz. Die DMDMDX mutierte Mäuse Dystrophin nicht ausdrücklich und werden häufig als ein Maus-Modell der DMD verwendet. In unserer aktuellen Studie beobachteten wir, dass Intramyocardial Injektion von breite Ausführung (WT)-myogen Progenitor Zellen abgeleitet Exosomen (MPC-Exo) vorübergehend restauriert die Expression von Dystrophin im Myokard von DMDMDX mutierten Mäusen, die verbunden WT-MPC-Exo kann eine vorübergehende Verbesserung der Herzfunktion, die darauf hindeutet, dass eine Option, um die kardiale Symptome von DMD zur Verfügung. Dieser Artikel beschreibt die Technik der MPC-Exo-Reinigung und Transplantation in Herzen von DMDMDX mutierten Mäusen.
Introduction
Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine X-chromosomal rezessiv, progressive neuromuskuläre Erkrankungen verursacht durch eine Mutation in DMD gen und den Verlust der funktionellen Dystrophin-1. Dystrophin drückt sich vor allem im Skelettmuskel und Myokard und weniger drückt sich in endokrinen Drüsen, glatte Muskulatur und Neuronen2,3. DMD ist die häufigste Form der Muskeldystrophie mit einer Inzidenz von 1 pro 3.500 bis 5.000 Neugeborenen jungen weltweit4,5. Menschen entwickeln in der Regel progressive Muskelentspannung Nekrose, Verlust des unabhängigen Gehens von frühen Jugend und Tod in der zweiten bis dritten Jahrzehnte ihres Lebens durch Herzversagen und Atemstillstand6.
Dilatative Kardiomyopathie, Herzrhythmusstörungen und Herzinsuffizienz sind gemeinsame kardiovaskuläre Manifestationen von DMD7,8. Die Krankheit kann nicht geheilt werden, unterstützende Behandlung kann Symptome verbessern oder das Fortschreiten der Herzinsuffizienz zu verzögern, aber es ist sehr schwierig, die Herz-Funktion9,10zu verbessern.
Ähnlich wie bei DMD-Patienten, X-chromosomale Muskeldystrophie (MDX) Mäuse haben einen Mangel an Dystrophin-Protein und vorliegenden Symptome einer Kardiomyopathie11und werden daher häufig in DMD verbundenen Kardiomyopathie Forschung eingesetzt. Um das Dystrophin in den betroffenen Muskeln wiederherzustellen, erweist allogene Stammzell-Therapie sich eine wirksame Behandlung für DMD12,13,14. Exosomen, 30-150 nm Membranvesikel abgesondert von verschiedenen Zelltypen, spielen eine wichtige Rolle in der Zell-Zell-Kommunikation durch genetische Materialtransport wie Boten-RNA (mRNA) und nicht-kodierende RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Unsere frühere Studien haben gezeigt, dass Exosomen abgeleitet myogen Vorläuferzellen (MPC), wie z. B. C2C12 Zelllinie Dystrophin übertragen können mRNA zu Host Kardiomyozyten nach kardialen Direkteinspritzung22, darauf hinweist, dass die allogene Lieferung von MPC-abgeleitete Exosomen (MPC-Exo) können vorübergehend DMD Genexpression in MDX-Mäuse wiederherstellen. Dieser Artikel konzentriert sich auf MPC-Exo-Reinigung und Transplantation-Techniken.
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Protocol
Tiere wurden entsprechend zugelassene Protokolle und Tierschutzvorschriften der institutionellen Animal Care and Use Committee des Medical College of Georgia Augusta Universität behandelt.
1. Isolierung und Reinigung der MPC-abgeleitete Exosomen
- Samen 5 x 106 C2C12 Zellen in der Kulturschale 15 cm Zelle mit 20 mL komplette Dulbecco geändert Adlers Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 100 U/mL Penicillin G und 100 μg/mL Streptomycin. Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2.
- 18 h bei 4 ° C mit einem schwingenden Eimer Rotor bereiten Sie Exosom erschöpft Medium durch Ultrazentrifugation der FBS bei 100.000 X g vor . Entsorgen Sie das Pellet.
- Ersetzen Sie die komplette DMEM mit Exosom erschöpft Medium, wenn Monolage Zellen 80 % Zusammenfluss in der Kulturschale zu erreichen.
- Verwenden Sie ein Transferpipette, um den Überstand von der Zelle Kulturschale alle 48 h für insgesamt drei Mal zu sammeln. Sammeln des Überstands in 50 mL Zentrifuge Tuben und Zentrifuge bei 150 X g für 10 min in die restlichen Zellen zu entfernen.
- Filtern des Überstands durch einen 0,22-μm-Filter Zelle Trümmer zu beseitigen. Ultrazentrifugen der gefilterten Medium in ultra-klare Röhrchen mit der schwingenden Eimer-Rotor bei 100.000 X g 120 min bei 4 ° C, Exosomen auszufällen.
- Aufschwemmen Sie Exosom-haltigen Pellet in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und füllen Sie das gesamte ultra-klare Rohr mit PBS. Führen Sie Ultrazentrifugation dieser Suspension bei 100.000 X g für 120 min bei 4 ° C, kontaminierende Proteine zu beseitigen.
- Den Überstand verwerfen und das Exosom Pellet in 100 µL PBS Aufschwemmen. Bei-80 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern.
- 3 µL Exosomal Suspension Platz für Elektronenmikroskopie Analyse auf einem 200 Mesh Formvar beschichteten Kupfer Elektronenmikroskop Raster für 5 min bei Raumtemperatur. Fahren Sie mit standard Uranyl Acetat Färbung23. Untersuchen Sie die halbtrockene Raster, indem Transmissions-Elektronenmikroskopie.
2. Intramyocardial Exosom Lieferung
Hinweis: Wir haben sechs Mäuse in jeder Gruppe.
- Betäuben Sie DBA/2J-DMDMDX -Mäuse (männlich, > 10 Monate Alter, Körpergewicht (BW) > 18 g) mit intraperitoneal (i.p.) Injektion von 100 mg/kg BW von Ketamin in Kombination mit 10 mg/kg BW Xylazin zu, und bestätigen Sie die Tiefe der Narkose durch Zeh kneifen.
- Jede Maus in Rückenlage auf einer chirurgische Plattform zu beheben, mit Klebeband sichern jede Extremität und legen Sie eine 3: 0-Naht horizontal unterhalb der oberen Zähne Oberkiefer in Position gehalten.
- Wenden Sie die Enthaarungscreme auf der linken Seite der Maus Brust, das Fell von der Haut zu entfernen.
- Endotracheale Intubation über Mundhöhle mit einem 24 G Katheter durchführen, und lüften Sie die Maus mit Raumluft mit einer Rate von 195 Atemzüge/min mit einem Nagetier Ventilator (siehe die Tabelle der Materialien).
- Desinfizieren Sie die Haut mit 75 % Alkohol und 10 % Povidon-Jod.
- Machen Sie einen 10\u201215 mm schrägen Schnitt vom linken sternale Rand um die linke Achselhöhle, schneiden Sie großen Pectoralis und Pectoralis minor mit einer Schere, dann eine linke Thorakotomie durch den vierten Intercostalneuralgie Raum. Fügen Sie sanft die Aufrollvorrichtung Bands um die Brusthöhle auf eine breite von 10 mm zu verbreiten. Achten Sie darauf, um die linke Lunge Schaden zu vermeiden.
- Verwenden Sie zwei gerade Pinzette entfernen das Perikard, auseinander ziehen und legen Sie sie hinter die Aufrollvorrichtung Tipps, um das Herz aussetzen. MPC-Exo zu injizieren (50 μg in 30 µL PBS) oder 30 μl PBS (als Kontrolle) Intramyocardially in der vorderen Wand des linken Ventrikels mit einer 31 G-Insulin-Nadel an einem Standort.
- Verwenden Sie 6-0-Nylon-Fäden um die Brusthöhle, Pectoralis Muskeln und Haut in Reihenfolge zu schließen.
- Mäuse zu erholen. Nachdem rhythmische, spontane Atmung vorhanden ist, entfernen Sie die Mäuse aus den Ventilator und Extubate. Beobachten Sie und notieren Sie die Mäuse Zustand nach der Operation.
(3) Echokardiographie
Hinweis: Ein einzelner Beobachter zu den Versuchsgruppen geblendet führt Echokardiographie und Datenanalyse.
- Betäuben Sie zwei Tage nach der Transplantation PBS/Exosom, die Mäuse mit 1\u20122% Isoflurane.
- Fixieren Sie eine Maus in Rückenlage mit Klebeband, und tragen Sie das vorgewärmte akustische Gel auf den linken Brustbereich.
-
Bewerten Sie linken ventricular Funktion durch Echokardiographie, wie zuvor beschrieben16,24.
- Die Parasternal lange Achse Übersicht über dem linken Ventrikel (LV) in zwei Dimensionen (B-Modus), und dann die Ultraschallsonde 90° drehen, um eine LV kurze Achse papillären Muskel Ebene zu erhalten.
- M-Modus echokardiographischen Bilder und links ventrikulären End-diastolischen Durchmesser messen (LVEDD), linken ventricular Ende systolischen Volumen (LVESD) linken ventricular End-diastolischen Volumen (LVEDV) und linken ventricular Ende systolischen Volumen (LVESV).
Hinweis: Gebrochene Verkürzung (FS %) = [(LVEDD − LVESD) / LVEDD] X 100 und linken linksventrikulären Auswurffraktion (LVEF %) = [(LVEDV − LVESV) / LVEDV] X 100.
4. Immunhistochemie
- Zwei Tage nach der Transplantation PBS/Exosom, betäuben Sie Mäuse (siehe Punkt 2.1) zu und geschnitten Sie das Brustbein auf, der Brusthöhle verfügbar zu machen. Sezieren Sie der minderwertigen Vena Cava, und Durchspülen Sie das Herz durch den linken Ventrikel Apex mit 3 mL PBS, gefolgt von 3 mL 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur mit einem Schmetterling-Katheter mit einem 25 G Nadel eine 5 mL Spritze.
- Feste Herzen in Paraffin einbetten, und 5 μm dicke Abschnitte geschnitten.
- Deparaffinize Folien in Xylol und rehydrieren in Ethanol Lösungen in folgender Reihenfolge: 100 % Xylol (3 min), 100 % Xylol (3 min), 100 % igem Ethanol (1 min), 100 % igem Ethanol (1 min), 95 % igem Ethanol (1 min), 80 % Ethanol (1 min), H2O (1 min).
- Gewebeschnitte mit 4 % Paraformaldehyd für 8 min bei Raumtemperatur zu beheben.
- Folien in Natriumcitrat (0,01 M, pH 6.0) Tauchen und Antigen-Retrieval mit einem Antigen-Retriever durchführen.
- Permeabilize Abschnitte für 1 h bei Raumtemperatur mit 1 % Polyethylenglykol Tert-Octylphenyl Äther mit PBS-Puffer.
- Abschnitte mit 5 % Ziegenserum mit PBS-Puffer für 1 h bei Raumtemperatur zu blockieren.
- Abschnitte mit verdünnter primären Antikörper (Anti-Dystrophin Antikörper) mit PBS-Puffer (1: 100) über Nacht bei 4 ° C inkubieren, dann 5 min dreimal mit PBS waschen.
- Inkubieren Sie Abschnitte mit verdünnter Sekundärantikörper (Alexa Fluor 488 konjugiert Ziege Anti-Kaninchen IgG) mit PBS-Puffer (1: 400) für 45 Minuten bei Raumtemperatur.
- Autofluoreszenz mit einem Autofluoreszenz abschrecken kit (siehe die Tabelle der Materialien).
- Verwendung Eindeckmittel mit DAPI (siehe die Tabelle der Materialien), die Folien zu montieren.
- Folien unter einem confocal Mikroskop zu beobachten.
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Representative Results
Ein Flussdiagramm zur Isolierung und Reinigung von Exosomen aus C2C12 Zellen ist in Abbildung 1Adargestellt. Um das Vorhandensein von Exosomen zu bestätigen, haben wir Transmission Electron Microscopy Analyse durchgeführt. Transmission Electron Microscopy Bild (Abbildung 1B) zeigt die Morphologie der Vesikel hell und Runde Form von Exosomen C2C12 abgeleitet. Western-Blot Analyse bestätigte die Anwesenheit von Exosom Markierungen, einschließlich CD63 und TSG101 (Abbildung 1C).
Wir beobachteten einen transluzente Ödem Bereich nach Intramyocardial PBS/MPC-Exo-Injektion in der vorderen Wand des linken Ventrikels von MDX-Mäusen (Abbildung 2), zeigt die erfolgreiche Injektion in das Myokard.
Um festzustellen, ob kardiale MPC-Exo Lieferung Dystrophin-Protein-Expression in MDX-Herzen wiederherstellt, führten wir immunofluorescent für Dystrophin Färbung und imaging mit einem konfokalen Mikroskop. Wir beobachteten Teilrestaurierung Dystrophin Ausdrucksform mit Membran-Lokalisierung in einigen der Herzmuskelzellen(Abbildung 3). Um festzustellen, ob die Transplantation von MPC-Exo verbessert die Herzfunktion in MDX-Mäuse, messen wir Herzfunktion durch Echokardiographie 2 Tage nach Intramyocardial PBS / MPC-Exo-Lieferung. Wie in Abbildung 3B, verbesserte MPC-Exo Behandlung vorderen Wand Bewegung im Vergleich mit PBS, was darauf hindeutet, dass MPC-Exo Transplantation Herzfunktion in MDX-Mäuse verbessert.
Abbildung 1 : Exosom Aufreinigung und Charakterisierung mittels Elektronenmikroskopie. (A) das Diagramm zeigt jeden Schritt der Isolierung und Reinigung des MPC-Exo. (B) das Bild zeigt rund und topfförmigen Vesikel unter Elektronenmikroskopie. Maßstabsleiste = 100 nm. (C) Western-Blot Analyse bestätigte die Anwesenheit von Exosom Marker CD63 und TSG101. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Intramyocardial Injektion von PBS oder MPC-Exo. Eine transluzente Ödem wurde in der linken vorderen Ventrikelwand nach Intramyocardial PBS/Exosom Lieferung beobachtet. (A) PBS Injektion. (B) MPC-Exo-Injektion. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Intramyocardial Lieferung von MPC-Exo teilweise erholt Dystrophin Ausdruck in MDX-Herzen, und verbessert die Herzfunktion gemessen durch Echokardiographie. (A) Confocal immunofluorescent Färbung die Herzen Abschnitte der MDX-Mäuse 2 Tage nach Intramyocardial PBS / MPC-Exo-Lieferung. Blau = DAPI, grün = Anti-Dystrophin-Antikörper. (B) echokardiographische Messungen der Herzfunktion nach 2 Tagen der PBS/MPC-Exo-Behandlung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die Methode der reinen Exosomen zu isolieren ist essentiell für die Funktion der Exosomen zu studieren. Eines der gemeinsamen Techniken für die Exosom Isolierung ist Polyethylen Glykole (PEGs) vermittelte Niederschlag17,18,25. Exosomen können Stifte ausgefällt, und pelleted durch langsame Zentrifugation. PEG-vermittelten Reinigung ist sehr bequem, Low Cost, es braucht keiner vorgerückte Ausrüstung, aber gibt es Bedenken über die Reinheit der Exosomen, da andere Lipoproteine zusammen ausgefällt werden können und sind schwer zu entfernen. Ultrafiltration ist ein Routineverfahren für Exosom Trennung, je nach Molekulargewicht und Ausgrenzung Größe Grenzen26. Ultrafiltration Isolation ist schneller als Ultrazentrifugation basierte Trennung, aber es kann dazu führen, dass strukturelle Schäden an große Bläschen. Das Vorhandensein von verschiedenen Epitope auf der Membran der Exosomen, z. B. CD9, CD63 und CD8127, bietet eine alternative Methode Exosomen durch Immunoaffinitäts Wechselwirkungen zwischen diesen Epitope und Antikörper gebunden, magnetische Beads zu isolieren. Obwohl Immunoisolation eine hohe Spezifität28hat, diese Technik hat Nachteile nur eine Teilmenge der gesamten Exosom Bevölkerung zu isolieren und möglicherweise verzerrt die Ergebnisse des Experiments. Ultrazentrifugation scheint daher besser geeignet für diese Studie auf Exosom Funktion sein.
In diesem Beitrag präsentieren wir eine Methode zur Reinigung von Exosomen durch sequentielle Ultrazentrifugation. Nach Entfernen der verbleibenden aus der Überstand durch Zentrifugation bei 150 x g, Zellenrückstand, apoptotischen Körper und Vesikel größer als 220 Zellen nm wurden durch die Übergabe des Überstands durch einen 0,22-μm-Filter entfernt. Exosomen wurden dann durch anfängliche Ultrazentrifugation bei 100.000 X g oelletiert. Um mögliche Protein Verschmutzung zu entfernen, haben wir eine zweite 100.000 x g Ultrazentrifugation nach resuspending das Exosom Pellet in PBS durchgeführt. Nach unserer Erfahrung der Vorteil der sequentiellen Ultrazentrifugation ist die Produktion von Exosomen mit hoher Reinheit und Wirtschaftlichkeit, jedoch hat es Nachteil geringer Ausbeute.
Damit können die injizierten Exosomen decken den größten Teil des linken Ventrikels und Leckagen zu vermeiden, haben wir eine Intramyocardial Injektion mit einer 31 G-Insulin-Nadel mit der Spitze gebogen bei ca. 20 ° c durchgeführt. Diese Technik ist entscheidend für die erfolgreiche Durchführung der meisten Exosomen in das Myokard und maximiert die Exposition des injizierten Exosomen zu Host Kardiomyozyten. Darüber hinaus empfehlen wir, Einspritzen Exosomen in der zentralen Region von der vorderen Wand des linken Ventrikels. Nach die Injektion abgeschlossen ist, halten wir in der Regel die Nadel an der Injektionsstelle für 1 min Flüssigkeit auslaufen zu verhindern. Erfolgreiche Injektionen wurden durch die Anwesenheit von einer durchscheinenden Ödem um die Injektionsstelle herum bestätigt.
In unserer Studie fanden wir, dass allogene MPC-Exo-Transplantation kann vorübergehend Dystrophin Ausdruck im Herzen wiederherstellen und Verbesserung der Herzfunktion in MDX-Mäuse22, in dem neue Strategien zur Linderung der Symptome bei DMD-Patienten geben können. Da wir wiederhergestellten Dystrophin-Protein-Expression in MDX Mäuseherzen beobachten, gehen wir davon aus, dass dies ist der Mechanismus für die verbesserte Herzfunktion, aber wir können nicht ausschließen, andere Mechanismen, wie z. B. Anti-Entzündung; ein kürzlich veröffentlichter Bericht zeigte, dass mesenchymale Stammzellen abgeleitet Exosomen verbessern die Mikroumgebung Infarzierte Myokard zur Angiogenese und Anti-Entzündung29, darüber hinaus Aminzadeh Et Al.30 vor kurzem berichtet, dass Cardiosphere-abgeleitete Zellen (CDCs) und ihre Exosomen könnte Ausdruck voller Länge Dystrophin bei DMD Mäusen vorübergehend wiederherstellen. Da DMD einer systemischen Erkrankung unter Beteiligung mehrerer Organe ist, ist die lokale myokardiale Lieferung von Exosom nicht eignet sich zur Behandlung respiratorischen Insuffizienz aufgrund Zwerchfell Myopathie. So systemischen Verabreichung von Exosomen, z. B. intravenöse Injektion hat therapeutisches Potenzial, aber die größte Herausforderung ist, eine wirksame Strategie für die Ausrichtung von Exosomen zu mehreren Muskelgewebe zu entwickeln. Darüber hinaus hat Exosom Behandlung nur eine vorübergehende Wirkung auf die teilweise Wiederherstellung Dystrophin Ausdruck, und Verbesserung der Herzfunktion. Mehr effektive, langfristige DMD Behandlung erforderlich ist.
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Disclosures
Alle Autoren erklärt, dass sie keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Tang waren teilweise unterstützt von der American Heart Association: NIH-AR070029, NIH-HL086555, GRNT31430008, NIH-HL134354.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Filter | Fisherbrand | 09-720-004 | |
| 15 cm Cell Culture Dish | Thermo Fisher Scientific | 157150 | |
| 24 G catheter | TERUMO | SR-OX2419CA | |
| 31 G insulin needle | BD | 328291 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | AAJ19943K2 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| 6-0 suture | Pro Advantage by NDC | P420697 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Anti-Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | |
| Antigen retriever | Aptum Biologics | R2100-US | Antigen recovery |
| Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 | |
| C2C12 cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Centrifuge | Unico | C8606 | |
| Change-A-Tip High Temp Cauteries | Bovie Medical Corporation | HIT | |
| Confocal microscopy | Zeiss | Zeiss 780 Upright Confocal | |
| DBA/2J-mdx mice | The Jackson Laboratory | 013141 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| Goat serum | MP Biomedicals, LLC | 191356 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Henry Schein | 056344 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Mouse Retractor Set | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Rodent ventilator | Harvard Apparatus | 55-7066 | |
| SW-28 Ti rotor | Beckman | 342207 | |
| The Vevo 2100 Imaging Platform | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 2100 | Ultrasound System |
| Ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344058 | |
| Xylazine (XylaMed) | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 1XYL003 8XYL006 |
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