Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para melhorar a função cardíaca em camundongos de distrofia muscular de Duchenne transitoriamente transplantando exosomes derivado de células progenitoras miogênico normal.
Abstract
Distrofia Muscular Duchene (DMD) é uma doença de genética recessiva ligada ao X causada pela falta da proteína distrofina funcional. A doença não pode ser curada, e como a doença progride, o paciente desenvolve sintomas de insuficiência cardíaca congestiva, arritmia e cardiomiopatia dilatada. Os ratos mutantes DMDMDX não expressam distrofina e são comumente usados como um modelo do rato da DMD. Em nosso estudo recente, observamos aquela injeção Intramiocárdica do tipo largura (WT)-exosomes de derivado de células progenitoras miogênico (MPC-Exo) restaurado transitoriamente a expressão da distrofina no miocárdio de ratos mutantes DMDMDX , que foi associado com uma melhoria transitória da função cardíaca, sugerindo que WT-MPC-Exo pode fornecer uma opção para aliviar os sintomas cardíacos de DMD. Este artigo descreve a técnica de purificação de MPC-Exo e transplante em corações de ratos mutantes DMDMDX .
Introduction
Distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma ligada ao X recessiva, progressiva doença neuromuscular causada por uma mutação no gene DMD e a perda de distrofina funcional1. Distrofina é expressa principalmente no miocárdio e músculo esquelético e manifesta-se menos no músculo liso, glândulas endócrinas e neurônios2,3. DMD é o tipo mais comum de distrofia muscular, com uma incidência de 1 por 3.500 a 5.000 meninos recém-nascidos em todo o mundo4,5. Indivíduos normalmente desenvolvem necrose muscular progressiva, perda de andar independente pelo início da adolescência e morte nas décadas de suas vidas devido a insuficiência cardíaca e insuficiência respiratória6segundo para terceiro.
Cardiomiopatia dilatada, arritmias e insuficiência cardíaca congestiva são manifestações cardiovasculares comuns de DMD7,8. A doença não pode ser curada, tratamento de suporte pode melhorar os sintomas ou retardar a progressão da insuficiência cardíaca, mas é muito difícil melhorar a função de coração9,10.
Semelhante aos pacientes DMD, distrofia ligada ao X (MDX) ratos são deficientes em proteína distrofina e os sintomas de cardiomiopatia11e, portanto, são amplamente utilizados na pesquisa de cardiomiopatia DMD associado. A fim de restaurar a distrofina em músculos afetados, terapia de células-tronco alogênico provou para ser um tratamento eficaz para DMD12,13,14. Exosomes, 30-150 vesículas de membrana nm secretadas por vários tipos de células, desempenham um papel fundamental na comunicação célula a célula através do transporte de material genético, como o ARN mensageiro (ARNm) e não-codificantes RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Nossos estudos anteriores mostraram que o exosomes, derivado de células progenitoras miogênico (MPC), tais como linha de celular C2C12, pode transferir distrofina mRNA para anfitrião cardiomyocytes após injeção direta cardíaca22, indicando que entrega alogênico de MPC-derivado exosomes (MPC-Exo) transitoriamente pode restaurar a expressão do gene DMD em camundongos MDX. Este artigo centra-se em técnicas de purificação e transplante de MPC-Exo.
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Protocol
Os animais foram tratados de acordo com protocolos aprovados e normas de bem-estar animal do Comité de utilização da faculdade médica de Geórgia na Universidade de Augusta e institucional Cuidado Animal.
1. isolamento e purificação de MPC-derivado Exosomes
- Semente de 5 x 106 C2C12 células em um prato de cultura de célula 15 cm com de 20 mL Dulbecco completa modificado médio da águia (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 de U/mL penicilina G e 100 estreptomicina μg/mL. Incube a 37 ° C e 5% de CO2.
- Prepare-se empobrecido exossomo médio por ultracentrifugação de FBS a 100.000 x g por 18 h a 4 ° C, utilizando um rotor de balde oscilante. Descarte a pelota.
- Substitua o DMEM completo médio exossomo empobrecido quando células monocamadas alcançar 80% de confluência da placa de cultura.
- Use uma pipeta de transferência para recolher o sobrenadante do prato cultura celular cada 48 h para um total de três vezes. Recolha o sobrenadante em tubos de centrífuga de 50 mL e centrifugar a 150 x g durante 10 minutos remover as células restantes.
- Filtre o sobrenadante através de um filtro de 0,22 μm para eliminar detritos celulares. Se o meio filtrado em tubos ultra claros usando o rotor balde balançando a 100.000 x g durante 120 minutos a 4 ° C para precipitar exosomes.
- Resuspenda o pellet exossomo contendo em salina tamponada fosfato (PBS) e encher o tubo inteiro ultra-fino com PBS. Execute ultracentrifugação desta suspensão a 100.000 x g para 120 min a 4 ° C para eliminar as proteínas contaminantes.
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender o exossomo em 100 µ l PBS. Loja a-80 ° C para uso futuro.
- Para análise de microscopia eletrônica, coloque 3 µ l de suspensão de exosomal sobre uma grade de cobre revestido formvar microscópio de 200 malha por 5 min à temperatura ambiente. Continue com acetato de uranilo padrão manchando23. Examine a grade semi seca por microscopia eletrônica de transmissão.
2. Intramiocárdica exossomo entrega
Nota: Usamos seis ratos em cada grupo.
- ANESTHETIZE camundongos DBA/2J-DMDMDX (> 10 meses de idade, do sexo masculino; peso corporal (PC) > 18 g) com injeção intraperitoneal (i.p.) de 100 mg/kg de ketamina combinada com 10 mg/kg de xilazina BW BW e confirme a profundidade da anestesia com pitada de dedo do pé.
- Corrigi cada rato em posição supina sobre uma plataforma cirúrgica usando fita para fixar cada membro e coloque uma sutura 3-0 horizontalmente abaixo os dentes superiores para prender o maxilar superior no lugar.
- Aplica o creme depilatório para o lado esquerdo do peito do rato para remover o pelo da pele.
- Realizar intubação endotraqueal através da cavidade oral, usando um cateter 24G e ventilar o mouse com o ar ambiente a uma taxa de 195 respirações por minuto usando um ventilador de roedor (ver a Tabela de materiais).
- Desinfecte a pele com álcool de 75% e 10% de iodopovidona.
- Fazer uma 10\u201215 mm oblíqua incisão da borda esquerda do esterno para a axila esquerda, cortar o peitoral maior e peitoral menor por uma tesoura e, em seguida, fazer uma toracotomia esquerda através do quarto espaço intercostal. Insira cuidadosamente as bandas afastador para espalhar a cavidade torácica para uma largura de 10 mm. Tome cuidado para não danificar o pulmão esquerdo.
- Use duas pinças reta para remover o pericárdio, separá-los e colocá-los para trás as pontas retrator para expor o coração. Injetar MPC-Exo (50 μg em 30 µ l de PBS) ou 30 µ l PBS (como um controle) intramyocardially em parede anterior do ventrículo esquerdo, usando uma agulha de insulina 31 G em um site.
- Use suturas de nylon 6-0 para fechar a cavidade torácica, os músculos peitoral e pele em sequência.
- Recupere os ratos. Uma vez que a respiração espontânea, rítmica está presente, remova os ratos do ventilador e os tubos. Observar e registrar a condição de ratos após a cirurgia.
3. ecocardiografia
Nota: Um único observador cegado aos grupos experimentais executa ecocardiografia e análise de dados.
- Dois dias após o transplante de PBS/exossomo, anestesia os ratos com isoflurano 1\u20122%.
- Consertar um mouse em posição supina, usando a fita e aplique o gel acústico pré-aquecido na área no lado esquerdo.
-
Avalie a função ventricular esquerda pela ecocardiografia como descrito anteriormente,16,24.
- Obter o esternal eixo longo de ventrículo esquerdo (LV) em duas dimensões (modo B) e em seguida girar a sonda de ultra-som 90º para obter uma visão de curto-eixo de LV ao nível do músculo papilar.
- Gravar imagens ecocardiográficas de modo-M e medida esquerda ventricular diastólica final diâmetro (LVEDD), volume final-sistólica ventricular esquerda (LVESD), volume final diastólico ventricular esquerdo (LVEDV) e volume final-sistólica ventricular esquerda (LVESV).
Nota: Encurtamento fracionário (% de FS) = [(LVEDD − LVESD) / LVEDD] x 100 e a fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE %) = [(LVEDV − LVESV) / LVEDV] x 100.
4. imuno-histoquímica
- Dois dias após o transplante de PBS/exossomo, anestesiar os ratos (consulte a etapa 2.1) e abrir o esterno para expor a cavidade torácica. Dissecar a veia cava inferior e perfundir o coração com o ápice do ventrículo esquerdo com 3 mL de PBS, seguido de 3 mL de paraformaldeído 4% à temperatura ambiente, utilizando um cateter de borboleta com uma agulha de 25 G, ligada a uma seringa de 5 mL.
- Incorporar corações fixas em parafina e cortados em seções de espessura 5 μm.
- Deparaffinize slides em xilol e hidratar-se em soluções de etanol na seguinte ordem: 100% xileno (3 min), 100% de xileno (3 min), 100% de etanol (1 min), 100% de etanol (1 min), 95% de etanol (1 min), 80% de etanol (1 min), H2O (1 min).
- Corrigi cortes histologicos com paraformaldeído 4% para 8 min à temperatura ambiente.
- Mergulhe os slides em citrato de sódio (0,01 M, pH 6.0) e executar a recuperação do antígeno, usando um recuperador de antígeno.
- Permeabilize seções por 1h à temperatura ambiente com 1% polietileno glicol éter de tert-octilfenil em PBS.
- Bloquear secções com 5% de soro de cabra em PBS por 1h à temperatura ambiente.
- Incubar as seções com diluídos anticorpo primário (anticorpo antidistrofina) em PBS (1: 100) durante a noite a 4 ° C e, em seguida, lave tres vezes com PBS por 5 min.
- Incube seções com diluídos anticorpo secundário (Alexa Fluor 488 Conjugado IgG de antibode coelho) em PBS (1: 400) por 45 min à temperatura ambiente.
- Controle da autofluorescência usando uma têmpera de autofluorescência kit (veja a Tabela de materiais).
- Meio de montagem de uso contendo DAPI (consulte a Tabela de materiais) para montar as lâminas.
- Observe os slides sob um microscópio confocal.
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Representative Results
Um fluxograma para isolamento e purificação de exosomes de C2C12 células é mostrado na Figura 1A. Para confirmar a presença de exosomes, foram realizadas análises de microscopia eletrônica de transmissão. Imagem de microscopia eletrônica de transmissão (Figura 1B) mostra a morfologia das vesículas de exosomes de C2C12 derivado forma brilhante e redonda. Análise ocidental do borrão confirmou a presença de marcadores exossomo, incluindo CD63 e TSG101 (Figura 1C).
Observamos uma área de edema translúcido depois Intramiocárdica PBS/MPC-Exo injeção na parede anterior do ventrículo esquerdo de camundongos MDX (Figura 2), indicando a sucesso injeção no miocárdio.
Para determinar que se cardíaca MPC-Exo entrega restaura a expressão de proteína distrofina em corações MDX, realizamos imunofluorescência mancha para distrofina e imagem com um microscópio confocal. Observamos a restauração parcial da expressão de distrofina com localização de membrana em alguns dos cardiomyocytes(Figura 3). Para determinar se o transplante de MPC-Exo melhora a função cardíaca em camundongos MDX, medimos função cardíaca por ecocardiografia 2 dias após Intramiocárdica PBS / MPC-Exo entrega. Como mostrado na Figura 3B, MPC-Exo tratamento melhorado movimento de parede anterior em comparação com PBS, sugerindo que o transplante de MPC-Exo melhorada função cardíaca em camundongos MDX.
Figura 1 : Exossomo purificação e caracterização por microscopia eletrônica. (A) o diagrama mostra cada etapa de isolamento e purificação de MPC-Exo. (B) a imagem mostra vesículas redondas e em forma de taça, sob microscopia eletrônica. Barra de escala = 100 nm. (C) análise de borrão ocidental confirmou a presença de marcadores exossomo CD63 e TSG101. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Injeção Intramiocárdica de PBS ou MPC-Exo. Um edema translúcido foi observado na parede ventricular esquerda anterior após Intramiocárdica PBS/exossomo de entrega. (A) PBS injeção. (B) injeção de MPC-Exo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Entrega Intramiocárdica de MPC-Exo parcialmente recupera a expressão da distrofina em corações MDX e melhora a função cardíaca, medida pela ecocardiografia. (A) Confocal imunofluorescência manchando as seções do coração de camundongos MDX 2 dias após Intramiocárdica PBS / MPC-Exo entrega. Azul = DAPI, verde = anticorpo antidistrofina. (B) medições ecocardiográfica da função cardíaca após 2 dias de tratamento de PBS/MPC-Exo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método de isolar exosomes puro é essencial para estudar a função de exosomes. Uma das técnicas comuns de isolamento do exossomo é Polietilenoglicóis (PEGs) mediada por precipitação17,18,25. Exosomes pode ser precipitado em PEGs e peletizado por centrifugação de baixa velocidade. PEG-mediada purificação é muito conveniente e de baixo custo, não necessita de nenhum equipamento avançado, mas há preocupação com a pureza da exosomes, desde que outras lipoproteínas podem ser precipitadas juntos e são difíceis de remover. Ultrafiltração é um método de rotina para a separação do exossomo, baseado no peso molecular e de limites de tamanho de exclusão26. Isolamento de ultrafiltração é mais rápido do que a separação de ultracentrifugação baseada, mas pode causar danos estruturais de grandes vesículas. A presença de diversos epítopos na membrana dos exosomes, tais como CD9, CD63 e CD8127, fornece um método alternativo de isolar exosomes por immunoaffinity interações entre esses resumos e anticorpos vinculados a grânulos magnéticos. Embora immunoisolation tem uma alta especificidade28, esta técnica tem desvantagens de isolar apenas um subconjunto da população total do exossomo e pode distorcer os resultados do experimento. Portanto, parece ser mais apropriado para este estudo em função do exossomo ultracentrifugação.
Neste trabalho, apresentamos um método para a purificação de exosomes por ultracentrifugação sequencial. Depois de remover as restantes células do sobrenadante por centrifugação a 150 x g, a detritos celulares, corpos apoptotic e vesículas maiores que 220 nm foram removidos, passando o sobrenadante através de um filtro de 0,22 μm. Exosomes foram então peletizados a 100.000 x g por ultracentrifugação inicial. Para remover a contaminação possível proteína, realizamos uma segunda 100.000 x g ultracentrifugação após resuspending a pelota exossomo em PBS. Conforme nossa experiência, a vantagem de ultracentrifugação sequencial é a produção de exosomes com pureza elevada e custo-eficiência, entretanto, tem a desvantagem de baixo rendimento.
Para permitir o exosomes injetado cobrir a maior parte do ventrículo esquerdo e evitar o escapamento, realizamos uma injeção Intramiocárdica, usando uma agulha de insulina de 31 mil com a ponta dobrada a cerca de 20 °. Esta técnica é fundamental para o sucesso na entrega da maioria dos exosomes no miocárdio e maximiza a exposição de exosomes injetado ao anfitrião cardiomyocytes. Além disso, recomendamos que injetando exosomes na região central da parede anterior do ventrículo esquerdo. Depois de concluída a injeção, geralmente mantemos a agulha no local da injeção, durante 1 min evitar o vazamento de líquido. Injeções bem sucedidas foram confirmadas pela presença de um edema translúcido ao redor do local da injeção.
Em nosso estudo, encontramos que o transplante alogênico de MPC-Exo transitoriamente pode restaurar a expressão de distrofina no coração e melhorar a função cardíaca em MDX ratos22, que podem fornecer novas estratégias para alívio dos sintomas em pacientes DMD. Uma vez que observamos a expressão de proteína distrofina recuperados em corações de rato MDX, supomos que este é o mecanismo para função melhorada do coração, no entanto, não podemos excluir outros mecanismos, tais como anti-inflamatório; um relatório recente demonstrou que exosomes derivado de células-tronco mesenquimais melhorar o microambiente do miocárdio enfartado, contribuindo para a angiogênese e anti-inflamatório29, além disso, Aminzadeh et al30 informou recentemente que cardiosphere-derivado de células (conjuntos) e sua exosomes transitoriamente poderia restaurar a expressão de comprimento total de distrofina em camundongos DMD. Considerando que a DMD é uma doença sistêmica, envolvendo vários órgãos, a entrega local do miocárdio do exossomo não é adequada para o tratamento da insuficiência respiratória devido a miopatia do diafragma. Assim, a administração sistémica de exosomes, tais como injeção intravenosa, tem potencial terapêutico, no entanto, o grande desafio é desenvolver uma estratégia eficaz para o direcionamento de exosomes para vários tecidos musculares. Mais importante, exossomo tratamento tem apenas um efeito transitório sobre parcialmente restaurando a expressão de distrofina e melhorar a função cardíaca. Tratamento de DMD mais eficaz, a longo prazo é necessário.
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Disclosures
Todos os autores declara que eles não têm nenhum conflito de interesses.
Acknowledgments
Tang foram parcialmente suportado pela associação americana do coração: GRNT31430008, NIH-AR070029, HL086555-NIH NIH-HL134354.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Filter | Fisherbrand | 09-720-004 | |
| 15 cm Cell Culture Dish | Thermo Fisher Scientific | 157150 | |
| 24 G catheter | TERUMO | SR-OX2419CA | |
| 31 G insulin needle | BD | 328291 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | AAJ19943K2 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| 6-0 suture | Pro Advantage by NDC | P420697 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Anti-Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | |
| Antigen retriever | Aptum Biologics | R2100-US | Antigen recovery |
| Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 | |
| C2C12 cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Centrifuge | Unico | C8606 | |
| Change-A-Tip High Temp Cauteries | Bovie Medical Corporation | HIT | |
| Confocal microscopy | Zeiss | Zeiss 780 Upright Confocal | |
| DBA/2J-mdx mice | The Jackson Laboratory | 013141 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| Goat serum | MP Biomedicals, LLC | 191356 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Henry Schein | 056344 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Mouse Retractor Set | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Rodent ventilator | Harvard Apparatus | 55-7066 | |
| SW-28 Ti rotor | Beckman | 342207 | |
| The Vevo 2100 Imaging Platform | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 2100 | Ultrasound System |
| Ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344058 | |
| Xylazine (XylaMed) | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 1XYL003 8XYL006 |
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