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Genetics

शुद्धिकरण और प्रत्यारोपण के लिए एक पेशीकरण कोशिका व्युत्पन्न Exosomes के ड्यूचेनने पेशी Dystrophic चूहों में कार्डिएक समारोह में सुधार करने के लिए

Published: April 10, 2019 doi: 10.3791/59320
Automatic Translation
*1,2, *1, *1,2, 2, 1, 1
1Vascular Biology Center, Medical College of Georgia, Augusta University, 2Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल वर्तमान सामांय पेशीजनक प्रजनक कोशिकाओं से व्युत्पंन exosomes प्रत्यारोपण द्वारा ड्यूचेनने पेशी dystrophy चूहों में कार्डिएक समारोह में सुधार करने के लिए प्रस्तुत ।

Abstract

ड्यूसीन पेशी Dystrophy (DMD) कार्यात्मक dystrophin प्रोटीन की कमी के कारण एक एक्स-लिंक्ड अप्रभावी आनुवंशिक रोग है । रोग ठीक नहीं किया जा सकता है, और रोग की प्रगति के रूप में, रोगी फैली cardiomyopathy, अतालता, और कोंजेस्टिव दिल की विफलता के लक्षण विकसित करता है । DMDMDX उत्परिवर्ती चूहों dystrophin व्यक्त नहीं करते हैं, और सामान्यतः dmd के एक माउस मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है । हमारे हाल के अध्ययन में, हमने देखा कि intramyocardial व्यापक प्रकार के इंजेक्शन (WT)-मायोजेनिक प्रजनक कोशिकाओं-व्युत्पन्न exosomes (एमपीसी-Exo) संक्रामक DMD के मायोकार्डियम में dystrophin की अभिव्यक्ति बहालMDX उत्परिवर्ती चूहों, जो जुड़ा हुआ था कार्डियक समारोह में एक क्षणिक सुधार के साथ सुझाव है कि WT-MPC-Exo DMD के कार्डियक लक्षणों को राहत देने के लिए एक विकल्प प्रदान कर सकते हैं । यह लेख एमपीसी-Exo शुद्धि और DMD के दिलों में प्रत्यारोपण की तकनीक का वर्णन करता हैMDX उत्परिवर्ती चूहों ।

Introduction

ड्यूचेनने पेशी dystrophy (DMD) एक एक्स-लिंक्ड अप्रभावी, प्रगतिशील neuromuscular रोग DMD जीन में एक उत्परिवर्तन और कार्यात्मक dystrophin1के नुकसान के कारण होता है । Dystrophin मुख्य रूप से कंकाल की मांसपेशी और मायोकार्डियम में व्यक्त की है, और कम चिकनी मांसपेशी, अंत: स्रावी ग्रंथियों और ंयूरॉंस2,3में व्यक्त की है । Dmd ३,५०० प्रति ५,००० नवजात लड़कों को दुनिया भर में4,5एक की घटना के साथ पेशी dystrophy का सबसे आम प्रकार है । व्यक्तियों को आम तौर पर प्रगतिशील मांसपेशियों परिगलन, जल्दी किशोरावस्था से स्वतंत्र चलने के नुकसान का विकास, और दिल की विफलता और श्वसन विफलता6के कारण अपने जीवन के तीसरे दशक में दूसरी मौत ।

फैली cardiomyopathy, अतालता और कोंजेस्टिव दिल विफलता dmd7,8के आम हृदय अभिव्यक्तियाँ हैं । रोग ठीक नहीं किया जा सकता, सहायक उपचार लक्षणों में सुधार या दिल की विफलता की प्रगति में देरी हो सकती है, लेकिन यह दिल समारोह9,10में सुधार करने के लिए बहुत मुश्किल है ।

DMD रोगियों के लिए इसी तरह, एक्स से जुड़े पेशी dystrophy (MDX) चूहों dystrophin प्रोटीन में कमी कर रहे हैं और cardiomyopathy के वर्तमान लक्षण11, और इसलिए व्यापक रूप से dmd जुड़े cardiomyopathy अनुसंधान में इस्तेमाल कर रहे हैं. आदेश में प्रभावित मांसपेशियों में dystrophin बहाल करने के लिए, allogeneic स्टेम सेल थेरेपी dmd12,13,14के लिए एक प्रभावी उपचार साबित हो गया है । Exosomes, 30-150 एनएम झिल्ली पीव विभिंन प्रकार के सेल द्वारा स्रावित, कोशिका से सेल संचार में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के माध्यम से आनुवंशिक सामग्री परिवहन, जैसे दूत आरएनए (mrna) और गैर कोडिंग rna15,16,17 ,18,19,20,21.

हमारे पिछले अध्ययनों से पता चला है कि इस तरह के C2C12 सेल लाइन के रूप में पेशीजनक प्रजनक कोशिकाओं (MPC) से व्युत्पंन exosomes, dystrophin एमआरएनए को प्रत्यक्ष कार्डियक इंजेक्शन22के बाद की मेजबानी cardiomyocytes हस्तांतरण कर सकते हैं, यह दर्शाता है कि allogeneic वितरण MPC-व्युत्पन्न exosomes (एमपीसी-Exo) सकर्मतापूर्वक MDX चूहों में DMD जीन अभिव्यक्ति को बहाल कर सकते हैं । यह लेख MPC-Exo शोधन और प्रत्यारोपण तकनीकों पर केंद्रित है ।

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Protocol

पशुओं को अनुमोदित प्रोटोकॉल और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग की चिकित्सा कॉलेज ऑफ जॉर्जिया के Augusta विश्वविद्यालय में समिति के पशु कल्याण नियमों के अनुसार संभाला गया ।

1. अलगाव और MPC-व्युत्पन्न Exosomes का शुद्धिकरण

  1. बीज 5 x 106 C2C12 कोशिकाओं के साथ एक 15 सेमी सेल संस्कृति पकवान 20 मिलीलीटर पूरा Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (dmem) युक्त 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (fbs), १०० U/एमएल पेनिसिलिन जी और १०० μg/ ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर सेटे ।
  2. एक झूल बाल्टी रोटर का उपयोग कर 4 डिग्री सेल्सियस पर १००,००० एक्स जी के लिए fbs के ultracentrifugation द्वारा exosome-घट मध्यम तैयार करते हैं । गोली छोड़ दें ।
  3. जब monolayer कोशिकाओं संस्कृति डिश में ८०% संगम तक पहुंच exosome-समाप्त मध्यम के साथ पूरा DMEM बदलें ।
  4. सेल कल्चर से सुपरनैंट को इकट्ठा करने के लिए एक ट्रान्सफर पिपेट का प्रयोग करें डिश हर ४८ ज को कुल तीन बार के लिए । ५० मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में supernatant लीजिए, और 10 मिनट के लिए १५० एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज शेष कोशिकाओं को हटाने के लिए ।
  5. सेल मलबे को खत्म करने के लिए एक ०.२२ μm फिल्टर के माध्यम से supernatant फिल्टर । इस फिल्टर मध्यम अल्ट्रा स्पष्ट ट्यूबों में झूल बाल्टी रोटर का उपयोग कर १००,००० x g पर १२० मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस exosomes हाला ।
  6. फॉस्फेट buffered खारा (PBS) में exosome युक्त गोली Resuspend और PBS के साथ पूरे अल्ट्रा स्पष्ट ट्यूब भरें । Contaminating प्रोटीन को समाप्त करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १२० मिनट के लिए १००,००० x g पर इस निलंबन के ultracentrifugation प्रदर्शन ।
  7. Supernatant छोड़ें और १०० μL PBS में exosome गोली resuspend । भविष्य में उपयोग के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  8. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए २०० मेष formvar कोटेड कॉपर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप ग्रिड पर 3 μL exosomal निलंबन की जगह । मानक यूरेनिल एसीटेट धुंधला23के साथ जारी रखें । इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी संचरण द्वारा अर्द्ध शुष्क ग्रिड की जांच करें ।

2. Intramyocardial Exosome वितरण

नोट: हम प्रत्येक समूह में छह चूहों का इस्तेमाल किया ।

  1. एनेस्थेटाइज़ DBA/2J-DBAMDX चूहों (पुरुष; आयु > 10 महीने; शरीर के वजन (BW) > 18 ग्राम) के intraperitoneal (आइपीए) इंजेक्शन के साथ १०० मिलीग्राम/किलो की ketamine के साथ संयुक्त 10 मिलीग्राम/किग्रा xylazine के bw, और पैर की अंगुली चुटकी द्वारा संवेदनाहरण की गहराई की पुष्टि करें ।
  2. प्रत्येक अंग को सुरक्षित करने के लिए टेप का उपयोग करके एक शल्य मंच पर स्पिन स्थिति में प्रत्येक माउस को ठीक करें और जगह में ऊपरी जबड़े को पकड़ने के लिए ऊपरी दांतों के नीचे क्षैतिज रूप से एक 3-0 सीवन रखें ।
  3. त्वचा से फर हटाने के लिए माउस छाती के बाईं ओर डिपिलेटरी क्रीम लागू करें ।
  4. एक 24 ग्राम कैथेटर का उपयोग कर मौखिक गुहा के माध्यम से endotracheal इंटुबैषेण प्रदर्शन, और १९५ सांस/मिनट की दर से कमरे हवा के साथ माउस हवाना एक रोडेंट वेंटिलेटर का उपयोग ( सामग्री की मेजदेखें) ।
  5. ७५% शराब के साथ त्वचा कीटाणुरहित और 10% पोविटोन आयोडीन ।
  6. बाईं बगल के बाएं स्टरनल एज से एक 10 \ u201215 mm तिरछा चीरा बनाओ, एक कैंची से पेक्टोरालिस मेजर और पेक्टोरलिस माइनर में कटौती, तो चौथे पसलियों के बीच अंतरिक्ष के माध्यम से एक छोड़ thoracotomy बनाते हैं । धीरे से 10 मिमी की चौड़ाई के लिए वक्ष गुहा को फैलाने के लिए पुनः ट्रैक्टर बैंड डालें । बाएं फेफड़े को नुकसान से बचने के लिए ध्यान रखना ।
  7. दो सीधे चिमटी का प्रयोग pericardium को हटाने के लिए, उंहें अलग खींच, और उंहें आकुंचक युक्तियां दिल बेनकाब करने के पीछे जगह है । MPC-Exo (30 μL PBS में ५० μg) या 30 μL PBS (एक नियंत्रण के रूप में) एक साइट पर 31 ग्राम इंसुलिन सुई का उपयोग कर बाईं वेंट्रिले की पूर्वकाल दीवार में intramyocardially इंजेक् ट ।
  8. 6-0 नायलॉन टांके का उपयोग करने के लिए वक्ष गुहा, पेटोरैलिस मांसपेशियों और त्वचा अनुक्रम में बंद करें ।
  9. चूहों की वसूली । एक बार लयबद्ध, सहज श्वास मौजूद है, चूहों वेंटिलेटर से निकालें, और extubate. निरीक्षण और सर्जरी के बाद चूहों हालत रिकॉर्ड.

3. इकोकार्डियोग्राफी

नोट: प्रयोगात्मक समूहों के लिए अंधा एक एकल पर्यवेक्षक इकोकार्डियोग्राफी और डेटा विश्लेषण करता है ।

  1. दो दिनों के बाद PBS/exosome ट्रांसप्लांटेशन, 1 के साथ चूहों anesthetize \ u20122% आइसोफ्लूराने.
  2. टेप का उपयोग कर लापरवाह स्थिति में एक चूहा ठीक है, और बाईं छाती क्षेत्र पर preheated ध्वनिक जेल लागू होते हैं ।
  3. पहले वर्णित16,24के रूप में इकोकार्डियोग्राफी द्वारा वाम वेंट्रिकुलर समारोह का आकलन करें ।
    1. दो आयामों (बी मोड) में बाएँ वेंट्रिकले (एल. वी.) का एक प्रकार का तारा लंबे अक्ष दृश्य प्राप्त करें, और फिर अल्ट्रासाउंड जांच ९० ° को एक LV लघु अक्ष पेशी स्तर पर देखने प्राप्त करने के लिए घुमाएं ।
    2. रिकॉर्ड एम-मोड इकोकार्डियोग्राफिक छवियों और माप बाएँ वेंट्रिकुलर अंत डायस्टोलिक व्यास (LVEDD), बाएँ वेंट्रिकुलर एंड सिस्टोलिक वॉल्यूम (LVEDD), बाएँ वेंट्रिकुलर अंत-डायस्टोलिक वॉल्यूम (LVEDD), और बाएँ वेंट्रिकुलर एंड सिस्टोलिक वॉल्यूम (LVEDD).
      नोट: भिन्नात्मक लघुकरण (FS%) = [(LVEDD − LVEDD)/LVEDD] x १००, और बाएँ वेंट्रिकुलर इजेक्शन अंश (LVEDD%) = [(LVEDD − LVEDD)/LVEDD] x १००.

4. Immunohistochemistry

  1. दो दिनों के बाद PBS/exosome ट्रांसप्लांटेशन, anesthetize चूहों (चरण २.१ देखें) और वक्ष गुहा को बेनकाब करने के लिए खुला उरोस्थि काट. अवर वेना कावा को काटना, और 3 मिलीलीटर पीबीएस के साथ बाईं वेंट्रिकले एपेक्स के माध्यम से दिल शवद, कमरे के तापमान पर 4% पैराफार्मलडिहाइड के 3 मिलीलीटर के बाद, एक 25 ग्राम सुई एक 5 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी के साथ एक तितली कैथेटर का उपयोग कर ।
  2. पैराफिन में फिक्स्ड दिल एंबेड, और 5 μm मोटी वर्गों में कटौती ।
  3. Xylene में स्लाइड प्रस्थान और निंनलिखित क्रम में इथेनॉल समाधान में reहाइड्रेट: १००% xylene (3 मिनट), १००% xylene (3 मिनट), १००% इथेनॉल (1 मिनट), १००% इथेनॉल (1 मिनट), ९५% इथेनॉल (1 मिनट), ८०% इथेनॉल (1 मिनट), एच2ओ (1 मिनट) ।
  4. कमरे के तापमान पर 8 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ ऊतक वर्गों को ठीक करें ।
  5. सोडियम साइट्रेट में स्लाइड विसर्जित (०.०१ मीटर, पीएच ६.०) और एक antigen retriever का उपयोग कर antigen पुनर्प्राप्ति करते हैं ।
  6. 1% पॉलीथीन ग्लाइकोल tert-pbs में octylphenyl ईथर के साथ कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए पारबिलज वर्गों ।
  7. कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए PBS में 5% बकरी सीरम के साथ ब्लॉक वर्गों ।
  8. (1:100) PBS में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी (विरोधी dystrophin एंटीबॉडी) के साथ सेक्बेट वर्गों 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर, फिर 5 मिनट के लिए PBS के साथ तीन बार धो लें ।
  9. पतला माध्यमिक एंटीबॉडी (Alexa Fluor ४८८ संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश IgG) PBS (1:400) में कमरे के तापमान पर ४५ मिनट के लिए के साथ सेते वर्गों ।
  10. ऑटोफ्लोरेसेंस शमन किट ( सामग्रियों की तालिकादेखें) का उपयोग करके नियंत्रण autofluorescence ।
  11. DAPI युक्त बढ़ते माध्यम का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) स्लाइड् स माउंट करने के लिए ।
  12. किसी संनाभि सूक्ष्मदर्शी के नीचे स्लाइड्स देखें ।

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Representative Results

C2C12 कोशिकाओं से exosomes आइसोलेट और शुद्ध करने के लिए एक प्रवाह चार्ट चित्रा 1एमें दिखाया गया है । Exosomes की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए, हम संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण किया । संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवि (चित्रा 1बी) C2C12 व्युत्पन्न exosomes के उज्ज्वल और गोल आकार पीव की आकृति विज्ञान से पता चलता है. वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण exosome मार्कर की उपस्थिति की पुष्टि की, CD63 और TSG101 सहित (चित्रा 1सी) ।

हम एक पारभासी edema क्षेत्र मनाया के बाद intramyocardial पीबीएस/MPC-Exo इंजेक्शन MDX चूहों के बाएँ वेंट्रिकल की दीवार में (चित्रा 2), मायोकार्डियम में सफल इंजेक्शन का संकेत.

कार्डिम MPC-exo वितरण MDX दिल में dystrophin प्रोटीन अभिव्यक्ति पुनर्स्थापित करता है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए, हम एक संनाभि माइक्रोस्कोप के साथ dystrophin के लिए immunofluorescent धुंधला, और इमेजिंग प्रदर्शन किया । हम cardiomyocytes में से कुछ में झिल्ली स्थानीयकरण के साथ dystrophin अभिव्यक्ति की आंशिक बहाली मनाया (चित्रा 3ए) । यह निर्धारित करने के लिए कि MPC-Exo के ट्रांसप्लांटेशन MDX चूहों में कार्डियक फंक्शन में सुधार करता है, हम 2 दिनों के intramyocardial PBS/ के रूप में चित्रा 3बीमें दिखाया गया है, mpc-EXO उपचार pbs के साथ तुलना में पूर्वकाल दीवार आंदोलन में सुधार, सुझाव है कि mpc-exo ट्रांसप्लांटेशन MDX चूहों में कार्डिएक समारोह में सुधार ।

Figure 1
चित्रा 1 : इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा Exosome शोधन और लक्षण वर्णन । (क) आरेख एक अलगाव और MPC-exo के शुद्धिकरण के प्रत्येक कदम को दर्शाता है । (इ) चित्र इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के अंतर्गत गोल तथा कप के आकार के पुलों को दर्शाता है । स्केल बार = १०० nm. (ग) वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण में exosome मार्कर CD63 और TSG101 की उपस्थिति की पुष्टि की गई है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : PBS या MPC-Exo के Intramyocardial इंजेक्शन । Intramyocardial PBS के बाद बाईं वेंट्रिकुलर पूर्वकाल दीवार में एक पारभासी edema देखा गया/ (क) पीबीएस इंजेक्शन । (ख) एमपीसी-एक्सो इंजेक्शन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : MPC-Exo के Intramyocardial डिलीवरी आंशिक रूप से MDX दिल में dystrophin अभिव्यक्ति ठीक हो, और हृदय समारोह में सुधार इकोकार्जियोग्राफी द्वारा मापा । (क) अन्तःकेंद्री पीबीएस/एमपीसी-exo डिलीवरी के बाद 2 दिनों के MDX चूहों के हृदय वर्गों के लिए संनाभि इमयूनोफ्लोरोसेंट दाग । नीला = DAPI, Green = विरोधी dystrophin एंटीबॉडी. (ख) पीबीएस/एमपीसी-exo उपचार के 2 दिनों के बाद कार्डियक फंक्शन का इकोकाडयोग्राफिक मापन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

शुद्ध exosomes अलग करने की विधि exosomes के समारोह का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है । Exosome अलगाव के लिए आम तकनीकों में से एक पॉलीथीन glycols (खूंटे) औसत वर्षा17,18,25है । Exosomes खूंटे में उपजी जा सकता है, और कम गति केंद्रापसारक द्वारा pelleted । खूंटी-मध्यस्थता शुद्धि बहुत सुविधाजनक है, कम लागत, यह किसी भी उन्नत उपकरणों की जरूरत नहीं है, लेकिन वहाँ exosomes की पवित्रता के बारे में चिंता का विषय है के बाद से अन्य लिपोप्रोटीन एक साथ उपजी हो सकता है और दूर करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं. Ultraफ़िल्ट्रेशन exosome जुदाई के लिए एक नियमित विधि है, आणविक वजन और बहिष्करण आकार सीमा26पर आधारित है । Ultraफ़िल्ट्रेशन अलगाव ultracentrifugation आधारित जुदाई की तुलना में तेजी है, लेकिन यह बड़े vesicles के लिए संरचनात्मक क्षति का कारण बन सकता है । Exosomes की झिल्ली पर विभिंन epitopes की उपस्थिति, जैसे CD9, CD63 और CD8127, इन epitopes और चुंबकीय मोतियों से बंधे एंटीबॉडी के बीच प्रतिरक्षा संबंधों से exosomes अलग करने का एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करता है । हालांकि immunoisolation एक उच्च विशिष्टता28है, इस तकनीक का नुकसान है केवल अलग कुल exosome जनसंख्या का एक सबसेट और प्रयोग के परिणामों को विकृत कर सकते हैं । इसलिए, अल्ट्राएन्ट्रीफ्यूगेशन exosome समारोह पर इस अध्ययन के लिए और अधिक उपयुक्त लगता है ।

इस पत्र में, हम क्रमिक ultracentrifugation द्वारा exosomes शोधन के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । १५० एक्स जीपर केन्द्रापसारक द्वारा supernatant से शेष कोशिकाओं को हटाने के बाद, सेल मलबे, अपोप्तोटिक निकायों और २२० एनएम से बड़ा पीव एक ०.२२ μm फिल्टर के माध्यम से supernatant पारित द्वारा हटा दिया गया । Exosomes तो १००,००० x जी में प्रारंभिक ultracentrifugation द्वारा pelleted थे । संभव प्रोटीन संदूषण को दूर करने के लिए, हम एक दूसरे १००,००० एक्स जी ultracentrifugation प्रदर्शन के बाद एक पीबीएस में exosome गोली resuspending । हमारे अनुभव के अनुसार, क्रमिक अल्ट्राएन्ट्रीफ्यूगेशन का लाभ उच्च शुद्धता और लागत दक्षता के साथ exosomes का उत्पादन है, तथापि, यह कम उपज का नुकसान है ।

आदेश में इंजेक्शन exosomes बाईं वेंट्रिकल के सबसे कवर करने के लिए और रिसाव से बचने के लिए अनुमति देने के लिए, हम के बारे में 20 ° पर टिप तुला के साथ एक 31 ग्राम इंसुलिन सुई का उपयोग कर एक intramyocardial इंजेक्शन का प्रदर्शन किया । इस तकनीक मायोकार्डियम में सबसे exosomes के सफल प्रसव के लिए महत्वपूर्ण है और इंजेक्शन exosomes के प्रदर्शन के लिए cardiomyocytes मेजबान अधिकतम । इसके अलावा, हम बाईं वेंट्रिकले की पूर्वकाल दीवार के मध्य क्षेत्र में exosomes इंजेक्शन लगाने की सलाह देते हैं । इंजेक्शन के पूरा होने के बाद, हम आम तौर पर तरल रिसाव को रोकने के लिए 1 मिनट के लिए इंजेक्शन साइट पर सुई पकड़ । सफल इंजेक्शन इंजेक्शन साइट के आसपास एक पारभासी edema की उपस्थिति से पुष्टि की गई ।

हमारे अध्ययन में, हमने पाया कि allogeneic एमपीसी-Exo ट्रांसप्लांटेशन transiently दिल में dystrophin अभिव्यक्ति बहाल करने और MDX चूहों22में कार्डिएक समारोह में सुधार कर सकते हैं, जो dmd रोगियों में लक्षण राहत के लिए नई रणनीति प्रदान कर सकते हैं । चूंकि हम MDX माउस दिल में dystrophin प्रोटीन अभिव्यक्ति बरामद मनाया, हम मानते है कि यह बेहतर दिल समारोह के लिए तंत्र है, तथापि, हम ऐसे विरोधी सूजन के रूप में अंय तंत्र, बाहर नहीं कर सकते; हाल ही में एक रिपोर्ट का प्रदर्शन किया है कि मध्योतक स्टेम सेल व्युत्पंन exosomes की जीवाणुजनन और विरोधी सूजन29, इसके अलावा, aminzadeh एट अल30 के लिए योगदान infarcted मायोकार्डियम के microenvironment में सुधार हाल ही में बताया कि कार्डियोस्फीयर व्युत्पंन कोशिकाओं (CDCs) और उनके exosomes संक्रमण DMD चूहों में पूरी लंबाई dystrophin की अभिव्यक्ति को बहाल कर सकता है । विचार है कि DMD एक प्रणालीगत कई अंगों को शामिल रोग है, exosome के स्थानीय मायोकार्डियल प्रसव डायाफ्राम myopathy के कारण श्वसन विफलता के इलाज के लिए उपयुक्त नहीं है । इस प्रकार, अंतःशिरा इंजेक्शन के रूप में exosomes के प्रणालीगत प्रशासन, चिकित्सकीय क्षमता है, तथापि, बड़ी चुनौती के लिए एक से अधिक मांसपेशियों के ऊतकों को exosomes लक्ष्यीकरण के लिए एक प्रभावी रणनीति विकसित करना है । इससे भी महत्वपूर्ण बात, exosome उपचार आंशिक रूप से dystrophin अभिव्यक्ति बहाल करने पर केवल एक क्षणिक प्रभाव है, और दिल समारोह में सुधार. अधिक प्रभावी, दीर्घकालिक DMD उपचार की जरूरत है ।

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Disclosures

सभी लेखकों का एलान है कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

तांग आंशिक रूप से अमेरिकी हार्ट एसोसिएशन द्वारा समर्थित थे: GRNT31430008, nih-AR070029, एनआईएच-HL086555, NIH-HL134354 ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm Filter Fisherbrand 09-720-004
15 cm Cell Culture Dish Thermo Fisher Scientific 157150
24 G catheter TERUMO SR-OX2419CA
31 G insulin needle BD 328291
4% paraformaldehyde  Affymetrix AAJ19943K2
50 mL Centrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 339652
6-0 suture Pro Advantage by NDC P420697
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A-11008
Antibiotic Antimycotic Solution Corning  30-004-CI
Anti-Dystrophin antibody Abcam ab15277
Antigen retriever  Aptum Biologics R2100-US Antigen recovery
Autofluorescence Quenching Kit  Vector Laboratories SP-8400
C2C12 cell line ATCC CRL-1772
Centrifuge Unico C8606
Change-A-Tip High Temp Cauteries Bovie Medical Corporation HIT
Confocal microscopy Zeiss Zeiss 780 Upright Confocal
DBA/2J-mdx mice The Jackson Laboratory 013141
DMEM Corning  10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning  35-011-CV
Goat serum  MP Biomedicals, LLC 191356
Isoflurane Patterson Veterinary 07-893-1389
Ketamine Henry Schein 056344
Mounting Medium with DAPI  Vector Laboratories H-1500
Mouse Retractor Set Kent Scientific SURGI-5001
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether Fisher Scientific BP151-100
Rodent ventilator Harvard Apparatus 55-7066
SW-28 Ti rotor Beckman 342207
The Vevo 2100 Imaging Platform FUJIFILM VisualSonics Vevo 2100 Ultrasound System 
Ultracentrifuge Beckman 365672
Ultra-Clear Tubes Beckman 344058
Xylazine (XylaMed) Bimeda-MTC Animal Health Inc. 1XYL003 8XYL006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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आनुवंशिकी अंक १४६ Exosome ड्यूचेनने पेशी dystrophy मेयोजेनिक संतति कोशिका अनुक्रमिक ultracentrifugation Exosome प्रत्यारोपण इकोकार्नोग्राफी हार्ट फंक्शन
शुद्धिकरण और प्रत्यारोपण के लिए एक पेशीकरण कोशिका व्युत्पन्न Exosomes के ड्यूचेनने पेशी Dystrophic चूहों में कार्डिएक समारोह में सुधार करने के लिए
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Su, X., Shen, Y., Jin, Y., Jiang,… More

Su, X., Shen, Y., Jin, Y., Jiang, M., Weintraub, N., Tang, Y. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. J. Vis. Exp. (146), e59320, doi:10.3791/59320 (2019).

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