Hög upplöst avbildning av Kärndynamik i levande celler under Enaxiell drag belastning
Summary
Med hjälp av en tidigare utformad enhet för att tillämpa mekanisk påfrestning på anhängare celler, beskriver detta papper en omdesignad underlaget geometri och en anpassad apparat för hög upplöst Single-cell Imaging av ansträngda celler med en 100x olja nedsänkning mål.
Abstract
Extracellulär mekanisk stam är känd för att framkalla cell fenotypisk respons och har fysiologisk relevans i flera vävnads system. För att fånga effekten av tillämpad extracellulär drag belastning på cell populationer in vitro via biokemiska analyser, har en enhet tidigare utformats som kan tillverkas enkelt och är tillräckligt liten för att passa inuti vävnad kultur inkubatorer, samt ovanpå och Mikroskop stadier. Emellertid, den tidigare utformningen av Polydimetylsiloxan underlaget tillät inte hög upplöst subcellulär avbildning via oljeimmersion mål. Detta arbete beskriver en omdesignad geometri av Polydimetylsiloxan underlaget och en anpassad avbildning inställning som tillsammans kan under lätta hög upplöst subcellulär avbildning av levande celler under tillämpad stam. Denna underlaget kan användas med samma, tidigare konstruerade enheten och därmed har samma fördelar som anges ovan, förutom att tillåta hög upplöst optisk avbildning. Utformningen av Polydimetylsiloxan underlaget kan förbättras genom att införliva ett rutnät som kommer att under lätta spårning av samma cell före och efter applicering av stam. Representativa resultat visar hög upplöst time-lapse Imaging av fluorescensmarkerade märkta kärnor inom ansträngda celler fångas med hjälp av den metod som beskrivs här. Dessa nukleära dynamik data ger insikter i mekanismen genom vilken tillämpade drag hållfasthet främjar differentiering av oligodendrocyte stamceller.
Introduction
Celler och vävnader i kroppen utsätts för olika mekaniska LED trådar, inklusive drag stammar. Emellertid, effekterna av dessa signaler på biologi neurala celler har ännu inte studerats utförligt och förstås fullt ut. I centrala nerv systemet, källor av mekanisk stam inkluderar utvecklings tillväxt1,2,3,4, fysiologiska processer såsom ryggmärgs böjning, blod och cerebrospinalvätska Pulsation, och patologiska tillstånd såsom trauma, Axon svullnad, gliaceller ärr bildning, eller tumör tillväxt5,6,7,8. Det är värt att undersöka hur drag hållfasthet påverkar differentieringen av oligodendrocyter och den efterföljande myelinisering av axoner, vilket är en kritisk process i ryggradsdjur centrala nerv systemet. Med hjälp av en specialdesignad stam enhet och elastomer multispot-plattor har tidigare arbeten9,10 visat att statisk enaxial stam kan öka oligodendrocytdifferentiering genom globala förändringar i gen uttryck 10. för att ytterligare förstå mekanismerna för stammechanotransduktion i dessa celler, måste den tidigare experimentella apparaten omformas enligt beskrivningen här, för att möjliggöra hög upplöst fluorescensavbildning av nukleär dynamik i levande celler under stam. Specifikt, en enda brunn Polydimetylsiloxan plattan är utvecklad, och Imaging konfigurationen är omgjorda för att möjliggöra tid-lapse Imaging av levande celler under stam med hjälp av en 100x olja nedsänkning lins. För att eliminera de negativa optiska effekterna av Polydimetylsiloxan i ljuset vägen, celler avbildas inte genom Polydimetylsiloxan plattan, men i omvänd position, genom täckglaset som täcker cell utrymmet. Med hjälp av denna nya Imaging design, hundratals högupplösta time-lapse filmer spelas in, av enskilda cell kärnor inom intakt anhängare celler, där kromatin är märkt med märkning Histon H2B till grönt fluorescerande protein. Dessa filmer visar att drag hållfasthet inducerar förändringar i kromatin struktur och dynamik som är förenliga med utvecklingen av oligodendrocyte differentiering.
Live cell Imaging under tillämpad stam är tekniskt utmanande och kräver en anordning design som är kompatibel med Mikroskop systemet. Den anpassade designen som beskrivs här utgör ett billigt alternativ till kommersiella lösningar. Dess dimensioner möjliggör dess installation på Mikroskop stadier och levande cell avbildning vid hög rumslig upplösning under tillämpad stam. Den Imaging setup är utformad för att under lätta levande cell Imaging med en 100x olja nedsänkning lins med högsta klarhet, genom täckglaset, inte genom skiktet av Polydimetylsiloxan plattan som annars minskar bild kvaliteten och är vanligt i de flesta bild uppställningar under belastning. Enheten, med en monterad platta som innehåller celler, kan också enkelt förvaras i inkubator. Denna enhet är utformad för att tillämpa enaxiell stam till substrat som underlättar vid häftande cell kultur och bibehålla en stabil och enhetlig belastning under flera dagar. Den inställning som beskrivs här kan användas för hög upplöst avbildning av olika anhängare cell typer under stam, vilket gör den tillämplig på mechanotransduction studier inom många områden av cellmechanobiology.
Protocol
Representative Results
Discussion
En enhet har tidigare1 utformats för applicering av extracellulär drag belastning på anhängare celler. Utformningen av polydimetylsiloxanunderlaget i detta arbete var tillräckligt för biokemiska analyser, liksom lågupplösta bilder av utsträckta celler. I detta arbete har under stratum omformats, och en ny avbildning konfiguration som underlättar hög upplöst subcellulär levande cell Imaging infördes. Fördelarna med detta system är många: det kan byggas in-Lab med hjälp av enkla ko…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alla författare tacksamt erkänner finansiering stöd från National Research Foundation i Singapore genom Singapore-MIT Alliance för forskning och teknik (SMART) bio Systems och Micromekanik (BioSyM) tvärvetenskaplig forskar grupp. Författarna Dr. Jagielska och Dr van Vliet också tacksamt erkänna finansiering och stöd från Saks-Kavanaugh stiftelsen. Författarna tackar William Ong och Dr Sing Yian Chew från Nanyang Technological University, Singapore, för att ge råtta oligodendrocyte progenitorceller för vissa experiment som beskrivs i detta arbete, och författarna tackar Dr G. V. Shivashankar från Mechanobiology Institute, National University of Singapore, Singapore, för diskussioner om fluktuationer i kärn krafts området.
Materials
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS – Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold – Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 – Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
- Bray, D. Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture. Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Developmental Biology. 389, (1983).
- Van Essen, D. C. A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system. Nature. , (1997).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).
- Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Research. , 103-115 (2011).
- Fisher, E., et al. Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains. Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).
- Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (2018).
- Zeiger, A. S., et al. Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting. Physical Biology. 13, 1-16 (2017).
- Jagielska, A., et al. Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0 (2007).
- Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells. Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).
- Makhija, E., et al. Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).
