Hoge-resolutie beeldvorming van kern dynamiek in levende cellen onder Éénassige trekspanning
Summary
Met behulp van een eerder ontworpen apparaat om mechanische belasting toe te passen op aanhangende cellen, dit document beschrijft een vernieuwde substratum geometrie en een aangepaste apparaat voor hoge-resolutie single-cell beeldvorming van gespannen cellen met een 100x olie onderdompeling doelstelling.
Abstract
Extracellulaire mechanische stam is bekend dat cel fenotypische reacties te lokken en heeft fysiologische relevantie in verschillende weefsel systemen. Om het effect van toegepaste extracellulaire trekspanning op cel populaties in vitro te vangen via biochemische assays, een apparaat is eerder ontworpen die kan eenvoudig worden vervaardigd en is klein genoeg om te passen in weefselkweek incubators, evenals op de top van Microscoop stadia. Echter, het vorige ontwerp van de Polydimethylsiloxaan substratum niet mogelijk hoge-resolutie subcellulaire beeldvorming via olie-onderdompeling doelstellingen. Dit werk beschrijft een herontworpen geometrie van de Polydimethylsiloxaan substratum en een aangepaste Imaging Setup die samen kunnen vergemakkelijken hoge-resolutie subcellulaire beeldvorming van levende cellen, terwijl onder toegepaste stam. Deze substratum kan worden gebruikt met dezelfde, eerder ontworpen apparaat en, dus, heeft dezelfde voordelen zoals hierboven vermeld, in aanvulling op het toestaan van hoge-resolutie optische beeldvorming. Het ontwerp van de Polydimethylsiloxaan substratum kan worden verbeterd door het opnemen van een raster dat zal vergemakkelijken het bijhouden van dezelfde cel voor en na de toepassing van de stam. Representatieve resultaten tonen een hoge-resolutie time-lapse beeldvorming van fluorescerende gelabelde kernen binnen gespannen cellen gevangen met behulp van de methode hier beschreven. Deze kern dynamiek gegevens geven inzicht in het mechanisme waarmee de toegepaste trekspanning de differentiatie van oligodendrocyte voorlopercellen bevordert.
Introduction
Cellen en weefsels in het lichaam worden onderworpen aan verschillende mechanische signalen, met inbegrip van trekspanningen. Echter, de effecten van deze signalen op de biologie van neurale cellen zijn nog niet uitvoerig bestudeerd en volledig begrepen. In het centrale zenuwstelsel, de bronnen van mechanische stam omvatten ontwikkelings groei1,2,3,4, fysiologische processen zoals het ruggenmerg buigen, bloed en hersenvocht pulsatie, en pathologische aandoeningen zoals trauma, axon zwelling, glial littekens, of tumorgroei5,6,7,8. Het is de moeite waard te onderzoeken hoe trekspanning invloed op de differentiatie van oligodendrocyten en de daaropvolgende myelination van axonen, dat is een kritisch proces in de gewervelde centrale zenuwstelsel. Met behulp van een op maat ontworpen stam apparaat en elastomere multiwell platen, vorige werken9,10 hebben aangetoond dat statische éénassige stam kan oligodendrocyte differentiatie te verhogen via de mondiale veranderingen in genexpressie 10. om verder inzicht te krijgen in de mechanismen van stam mechanotransduction in deze cellen, moet het vorige experimentele apparaat opnieuw worden ontworpen zoals hier beschreven, om een hoge-resolutie fluorescentie beeldvorming van kern dynamiek in het leven mogelijk te maken cellen onder spanning. Concreet, een single-well Polydimethylsiloxaan plaat is ontwikkeld, en de Imaging configuratie is vernieuwd om voor de time-lapse beeldvorming van levende cellen onder spanning met behulp van een 100x olie onderdompeling lens. Om de negatieve optische effecten van Polydimethylsiloxaan in het licht pad te elimineren, worden cellen niet door de Polydimethylsiloxaan plaat gebeeld, maar in de omgekeerde positie, door het afdekglas dat het compartiment van de cel bedekt. Met behulp van deze nieuwe Imaging design, honderden High-Resolution time-lapse films worden opgenomen, van de individuele celkern binnen intact aanhangende cellen, waar Chromatin wordt gekenmerkt door tagging histone H2B aan groene fluorescerende eiwitten. Deze films tonen aan dat de trekspanning veranderingen in Chromatin structuur en dynamica veroorzaakt die in overeenstemming met de vooruitgang van oligodendrocyte differentiatie zijn.
Live Cell Imaging onder toegepaste stam is technisch uitdagend en vereist een apparaat ontwerp dat compatibel is met de Microscoop systeem. Het aangepaste ontwerp hier beschreven biedt een goedkoop alternatief voor commerciële oplossingen. Zijn afmetingen stellen de installatie op Microscoop stadia en live-cel beeldvorming bij hoge ruimtelijke resolutie tijdens de toegepaste stam. De Imaging Setup is ontworpen om te vergemakkelijken levende cel beeldvorming met behulp van een 100x olie onderdompeling lens met de hoogste duidelijkheid, door het deksel glas, niet door de laag van Polydimethylsiloxaan plaat die anders vermindert de beeldkwaliteit en is gebruikelijk in de meeste Imaging setups onder spanning. Het apparaat, met een gemonteerde plaat met cellen, kan ook gemakkelijk worden opgeslagen in de incubator. Dit apparaat is ontworpen om éénassige stam toe te passen op Substrata dat de aanhangende cel cultuur te vergemakkelijken en handhaven van een stabiele en uniforme spanning over meerdere dagen. De hier beschreven opstelling kan voor de High-Resolution beeldvorming van diverse aanhangende cel types onder spanning worden gebruikt, die het maakt van toepassing op mechanotransduction studies op vele gebieden van cel Mechanobiology.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een apparaat heeft eerder1 is ontworpen voor de toepassing van de extracellulaire trekspanning op aanhangende cellen. Het ontwerp van de Polydimethylsiloxaan substratum in dat werk was voldoende voor biochemische analyses, evenals de lage-resolutie beeldvorming van uitgerekte cellen. In dit werk werd de substratum herontworpen, en een nieuwe Imaging configuratie die een hoge-resolutie subcellular Live Cell Imaging vergemakkelijkt werd geïntroduceerd. De voordelen van dit systeem zijn talrijk: het…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alle auteurs dankbaar erkennen steun van de financiering van de National Research Foundation van Singapore via de Singapore-MIT Alliantie voor onderzoek en technologie (SMART) biosystemen en micromechanica (BioSyM) interdisciplinair Onderzoekgroep. Auteurs Dr. Jagielska en Dr. van Vliet erkennen ook de financiering en steun van de Saks-Kavanaugh Foundation. De auteurs bedanken William Ong en Dr zingen Yian kauwen van Nanyang technologische universiteit, Singapore, voor het verstrekken van Rat oligodendrocyte voorlopercellen voor een aantal experimenten beschreven in dit werk, en de auteurs bedanken Dr. G. V.. Mechanobiology Institute, Nationale Universiteit van Singapore, Singapore, voor discussies over nucleaire gebied schommelingen.
Materials
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS – Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold – Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 – Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
- Bray, D. Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture. Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Developmental Biology. 389, (1983).
- Van Essen, D. C. A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system. Nature. , (1997).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).
- Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Research. , 103-115 (2011).
- Fisher, E., et al. Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains. Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).
- Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (2018).
- Zeiger, A. S., et al. Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting. Physical Biology. 13, 1-16 (2017).
- Jagielska, A., et al. Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0 (2007).
- Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells. Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).
- Makhija, E., et al. Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).
