일축 인장 스트레인 하에서 살아있는 세포의 핵 역학에 대 한 고해상도 이미징
Summary
이전에 설계 된 장치를 사용 하 여 부착 세포에 기계적 변형을 적용 하는이 백서는 새롭게 디자인 된 하 층 구조와 100 배 오일 침 지 대물 렌즈를 사용 하 여 변형 된 셀의 고해상도 단일 셀 이미징을 위한 맞춤형 장치를 설명 합니다.
Abstract
세포 외 기계적 변형은 세포 표현 형 반응을 유도 하는 것으로 알려져 있으며, 여러 조직 시스템에서 생리 적 관련성을 갖는다. 생 화 확 적인 분석을 통해 시험관 내 세포 집단에 적용 된 세포 외 인장 균 주의 효과를 포착 하기 위해, 장치는 이전에 간단 하 게 제작 될 수 있고 조직 배양 인큐베이터 내부에 들어갈 정도로 작아 설계 되었으며, 뿐만 아니라 상단에 현미경 단계. 그러나, 실록 하 층의 이전 디자인은 기름 침수 목표를 통해 고 분해능 세포 화상 진 찰을 허용 하지 않았습니다. 이 작업은 실록 하위 계층의 재설계 된 형상과 함께 적용 된 스트레인 하에서 라이브 셀의 고해상도 세포 이미징을 용이 하 게 할 수 있는 사용자 정의 이미징 설정을 설명 합니다. 이 하위 계층은 동일한 이전에 설계 된 장치와 함께 사용할 수 있으며, 따라서 고해상도 광학 이미징을 허용 하는 것 외에도 위에 나열 된 것과 동일한 이점이 있습니다. 실록 하 층의 설계는 스트레인의 적용 전후에 동일한 셀을 추적 하는 것을 용이 하 게 하는 그리드를 통합 함으로써 개선 될 수 있다. 대표적인 결과는 여기에 설명 된 방법을 사용 하 여 포착 된 변형 된 세포 내에서 형광 표지 된 핵의 고해상도 타임 랩 스 이미징을 보여줍니다. 이러한 핵 역학 데이터는 적용 된 인장 변형이 oligodendrocyte 전구 세포의 분화를 촉진 하는 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 합니다.
Introduction
바디에 있는 세포 그리고 조직은 장력 긴장을 포함 하 여 각종 기계적인 단서를 복종 됩니다. 그러나, 신경 세포의 생물학에 대 한 이러한 단서의 효과 아직 광범위 하 게 공부 하 고 완전히 이해 하지. 중추 신 경계에서 기계적 변형의 원인으로는발달 성장1,2,3,4, 척수 벤딩, 혈액 및 뇌 척 수액과 같은 생리 학적 과정이 포함 됩니다. 맥 동 및 외상, 축 삭 부 종, 신경 교 흉터 또는 종양 성장5,6,8과 같은 병리학 적 상태. 인장 변형이 oligodendrocytes의 분화와 축 삭의 후속 초 화에 영향을 미치는 방법을 조사 하는 것이 가치가 있다,이는 척추 동물 중추 신 경계에서 중요 한 과정 이다. 사용자 정의 설계 된 스트레인 디바이스와 엘라 스토 머 멀티 웰 플레이트를 사용 하 여, 이전 작품9,10 은 정적 일축 변형이 유전자 발현 의 글로벌 변화를 통해 oligodendrocyte 분화를 증가 시킬 수 있음을 보여주었다 10.이 세포에서 스트레인 기계 전달의 메커니즘에 대 한 이해를 돕기 위해, 이전 실험 장치는 여기에 기술 된 바와 같이 재설계 되어야 하며, 생활에서의 핵 역학의 고해상도 형광 이미징을 가능 하 게 합니다. 셀을 변형 합니다. 구체적으로는 단일 웰 실록 플레이트가 개발 되 고 이미징 구성이 재설계 되어 100 배 오일 침 지 렌즈를 사용 하 여 균 주 하에서 라이브 셀의 타임 랩 스 이미징이 가능 하도록 설계 되었습니다. 빛 통로에서 실록의 부정적인 광학적 효과를 없애기 위해, 세포는 실록 판을 거치지 않고, 거꾸로 위치 하 고, 커버 글래스를 통해 세포 구획을 덮는 것을 이미지화 한다. 이 새로운 이미징 디자인을 사용 하 여, 수백 개의 고해상도 타임 랩 스 영화가 기록 됩니다, 여기서 염색 질은 녹색 형광 단백질에 히스톤 H2B 태그에 의해 표시 되는, 온전한 부착 세포 내에서 개별 세포 핵. 이러한 영화는 인장 변형이 oligodendrocyte 분화의 진행과 일치 하는 크로마 틴 구조 및 역학의 변화를 유도 한다는 것을 증명 한다.
적용 된 스트레인 하에서의 살아있는 세포 화상 진 찰은 기술적으로 도전적이 고 현미경 시스템과 호환이 되는 장치 디자인이 필요 합니다. 여기에 설명 된 사용자 정의 디자인은 상업용 솔루션에 대 한 저렴 한 대안을 제시 합니다. 그것의 차원은 적용 한 긴장 도중 높은 공간 해결책에 있는 현미경 단계 및 살아있는 세포 화상 진 찰에 그것의 설치를 가능 하 게 합니다. 이미징 설정은 이미지 품질을 저하 시키는 실록 plate의 레이어를 거치지 않고 커버 글래스를 통해 가장 높은 선명도를 가진 100 배 오일 침 지 렌즈를 사용 하 여 라이브 셀 이미징이 가능 하도록 설계 되었으며 대부분의 경우 이미징 설정을 변형 합니다. 장치는 세포를 포함 하는 거치 된 격판덮개로, 또한 인큐베이터에서 쉽게 저장 될 수 있습니다. 이 장치는 부착 세포 배양을 용이 하 게 하 고 여러 날에 걸쳐 안정적이 고 균일 한 변형을 유지 하는 서브 지층에 일축 변형을 적용 하도록 설계 되었습니다. 여기에 설명 된 설정은 균 주 하에서 다양 한 부착 세포 유형의 고해상도 이미징에 사용 될 수 있다, 그것은 세포 기계 생물학의 많은 분야에서 기계 전달 연구에 적용.
Protocol
Representative Results
Discussion
장치는 이전에 부착 세포에 세포 외 인장 긴장의 응용 프로그램을 위해 설계 되었습니다. 그 일에 있는 실록 하 층의 디자인은 생화학 분석을 위해 충분 했습니다, 기지개 한 세포의 저해상도 화상 진 찰 뿐 아니라. 이 작품에서, 하 층은 재설계 되었고, 고해상도의 세포 성 살아있는 세포 이미징을 용이 하 게 하는 새로운 이미징 구성이 도입 되었다. 이 시스템의 장점은 여러 가?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
모든 저자는 연구 및 기술 (스마트) 바이오 시스템 및 마이크로 역학 연구 그룹에 대 한 싱가포르-MIT 얼라이언스를 통해 싱가포르 국립 연구 재단의 자금 지원을 기꺼이 인정 합니다. 저자, 야기 엘 스 카 박사와 반 블 릿 박사는 또한 Saks-카바 나 프 재단의 기금과 지원을 감사 하 게 인정 합니다. 저자는이 작품에 설명 된 몇 가지 실험에 대 한 쥐 oligodendrocyte 전구 세포를 제공 하기 위해, 싱가포르 난 양 기술 대학교에서 윌리엄 Ong 박사 노래 Yian 씹는 감사 합니다, 저자는 박사 g. v. Shivashankar 감사 원자력 지역 변동에 대 한 논의에 대 한 싱가포르, 싱가포르의 국립 대학, 기계 생물학 연구소.
Materials
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS – Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold – Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 – Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
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