Summary
Presentiamo tecniche per isolare, coltivare, caratterizzare e differenziare le cellule progenitrici muscolari primarie umane (hMMP) ottenute dal tessuto della biopsia muscolare scheletrica. Gli hMPC ottenuti e caratterizzati attraverso questi metodi possono essere utilizzati per affrontare successivamente le domande di ricerca relative alla miogenesi umana e alla rigenerazione muscolare scheletrica.
Abstract
L'uso di tessuti e cellule primarie è ideale per lo studio di processi biologici e fisiologici come il processo rigenerativo muscolare scheletrico. Ci sono sfide riconosciute nel lavorare con le cellule staminali adulte primarie umane, in particolare le cellule progenitrici del muscolo umano (hMC) derivate da biopsie muscolari scheletriche, tra cui un basso rendimento cellulare dal tessuto raccolto e un ampio grado di eterogeneità dei donatori parametri di crescita e di morte tra le culture. Pur incorporando l'eterogeneità nella progettazione sperimentale è necessaria una dimensione del campione più grande per rilevare effetti significativi, ci permette anche di identificare i meccanismi che sono alla base della variabilità nella capacità di espansione di hMPC, e quindi ci permette di comprendere meglio l'eterogeneità nella rigenerazione muscolare scheletrica. Nuovi meccanismi che distinguono la capacità di espansione delle colture hanno il potenziale per portare allo sviluppo di terapie per migliorare la rigenerazione muscolare scheletrica.
Introduction
Il muscolo scheletrico è il più grande sistema di organi nel corpo umano, che rappresenta il 30-40% di tutta la massa corporea1. Oltre al suo ruolo ben riconosciuto nella locomozione, il muscolo scheletrico mantiene la temperatura corporea e la postura e svolge un ruolo centrale nell'omeostasi nutritiva di tutto il corpo. La ricerca che coinvolge partecipanti umani, animali e modelli di coltura cellulare sono tutti preziosi per affrontare le domande relative alla biologia muscolare scheletrica e alla rigenerazione. L'isolamento e la coltura delle cellule progenitrici muscolari primarie umane (hMCC) fornisce un modello robusto che consente di applicare tecniche e manipolazioni della coltura cellulare a campioni umani. Un vantaggio dell'uso di hMPC è che mantengono il fenotipo genetico e metabolico da ciascun donatore2,3. La manutenzione del fenotipo del donatore consente ai ricercatori di esaminare la variazione inter-individuale nel processo miogenico. Ad esempio, abbiamo impiegato il nostro metodo di caratterizzazione hMPC per identificare le differenze legate all'età e al sesso nella capacità di espansione della popolazione di hMPC4.
Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere in dettaglio le tecniche per isolare, cultura, caratterizzare e differenziare gli HMP Dal tessuto della biopsia muscolare scheletrica. Basandosi su un lavoro precedente che descriveva gli HMPC e identificava i potenziali produttori di superfici cellulari per l'isolamento hMPC5,6, questo protocollo colma una lacuna critica nella conoscenza collegando l'isolamento alla caratterizzazione degli hMPC. Inoltre, le istruzioni dettagliate fornite in questo protocollo rendono l'isolamento e la caratterizzazione hMPC accessibili a un vasto pubblico scientifico, comprese quelle con un'esperienza precedente limitata con gli HMPC. Il nostro protocollo è tra i primi a descrivere l'uso di un citometro di imaging per tracciare le popolazioni cellulari. I citometri di imaging di nuova progettazione sono all'avanguardia, ad alta produttività e a base di microlamiche, consentendo l'imaging delle cellule vive, il conteggio delle celle e l'analisi della fluorescenza multicanale di tutte le celle in ogni pozzo di un vaso di coltura in pochi minuti. Questo sistema consente una rapida quantificazione dei cambiamenti dinamici nella proliferazione e nella vitalità di un'intera popolazione cellulare con solo una minima interruzione della cultura. Ad esempio, siamo in grado di eseguire misure oggettive di confluenza nei giorni successivi in vitro per determinare la cinetica di crescita di ogni cultura derivata da diversi donatori. Molti protocolli in letteratura, in particolare quelli che comportano la differenziazione dei MPC, richiedono alle cellule di raggiungere un livello definito di confluenza prima di iniziare la differenziazione o il trattamento7. Il nostro metodo consente una determinazione oggettiva della confluenza di ogni pozzo in un vaso di coltura che consente ai ricercatori di iniziare il trattamento in modo imparziale e non soggettivo.
In passato, una delle principali limitazioni dell'uso di HMPC primarie era la bassa resa che limitava il numero di cellule disponibili per gli esperimenti. Noi e altri abbiamo mostrato che la resa di MPC dal tessuto della biopsia muscolare scheletrica è di 1/15 MPC per milligrammo di tessuto (Figura 1)8. Poiché il nostro protocollo consente quattro passaggi delle cellule prima della purificazione con la fluorescenza activated cell sorting (FACS), le nostre rese hMPC crioconservate, derivate da piccole quantità di tessuto biopsia (50-100 mg), sono sufficienti per affrontare gli obiettivi di ricerca dove sono necessari più esperimenti. Il nostro protocollo FACS produce una popolazione MPC pura (Pax7 positiva) di 80 dollari, quindi il nostro protocollo è ottimizzato sia per la resa che per la purezza.
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Protocol
Questo protocollo è stato approvato dall'Institutional Review Board della Cornell University. Tutti i partecipanti sono stati esaminati per le condizioni di salute sottostanti e hanno dato il consenso informato.
1. Ottenere tessuto muscolare umano tramite la biopsia muscolare scheletrica
- Identificare il muscolo laterale vasto tramite palpazione, punti di riferimento anatomici e contrazione attiva del muscolo.
- Palpate il vasto lateralis facendo stringere al partecipante il muscolo quadricipite e trovare la pancia del muscolo, circa 1/3 del modo dalla rotula all'anca, e solo ventrolateral al femore.
- Utilizzare un nastro di misura di carta per contrassegnare un'area con un marcatore chirurgico a circa 4-6 pollici dalla parte superiore della rotula che rappresenta la pancia del muscolo.
- Rasare i capelli vicino all'area contrassegnata e quindi pulire con un antisettico grado chirurgico che viene utilizzato prima delle procedure mediche (Ad esempio: 2% gluconato di cloressidina (CHG)/ 70% alcool isopropile (IPA)) .
- Anestesizzare il sito di biopsia con 1% lidocaina.
NOT: Evitare di iniettare la lidocaina nel muscolo scheletrico. - Fare un percorso di incisione di 4x5 mm nel sito contrassegnato.
- Dopo che l'area è stata aerizzata, spingere un ago Bergstrom con trocar attraverso la fascia nel ventre del muscolo (circa 2-3 cm).
- Disegna il tessuto muscolare nell'ago di Bergstrom ritirando il trocar di taglio di 2-3 cm, mentre un assistente applica l'aspirazione ritirando uno stantuffo di siringa da 60 mL attaccato.
- Chiudere la camera di taglio.
- Ruotare la base dell'ago della biopsia un quarto di giro e ripetere la sequenza di apertura dell'ago, l'aspirazione e la chiusura dell'ago.
NOT: Ogni volta che l'ago è chiuso, un taglio del tessuto muscolare dovrebbe essere ottenuto all'interno dell'ago Bergstrom. Durante la raccolta del campione, l'ago rimarrà nella coscia nella stessa posizione verticale mentre viene ruotato longitudinalmente fino a 360 gradi per ottenere ogni campione. Questa sequenza può essere ripetuta 3/4 volte. - Espellere il tessuto biopsia raccolto dall'ago in un spogliatoio sterile non aderente.
- Esaminare il tessuto e rimuovere eventuali tessuti adiposi e fibrotici visibili utilizzando lame sterili di bisturi o pinzette.
- Collocare una porzione di tessuto di 50-100 mg in un tubo sterile contenente un mezzo nutritivo indipendente da CO2(ad esempio, Hibernate A).
NOT: Il peso del tessuto è determinato come segue. In primo luogo, il tubo con tappo contenente il mezzo nutritivo su una scala e una tara. Successivamente posizionare il tessuto nel tubo, ricapitolare il tubo, quindi pesare il tubo contenente il tessuto nel mezzo nutritivo. - Conservare il tubo contenente il tessuto e il mezzo nutritivo a 4 gradi centigradi fino all'elaborazione.
NOT: Il tessuto della biopsia deve essere elaborato entro 48 h dalla raccolta.
2. Isolare le cellule del progenitore muscolare umano dal tessuto della biopsia
- Tessuto di biopsia tritata.
- Trasferire il tessuto muscolare dal mezzo nutritivo in un piatto Petri sterile in un armadio di sicurezza biologica o un luogo di lavoro sterile simile.
- Utilizzare lame di bisturi sterili per macinare il tessuto in pezzi da 1 mme 3.
- Lavare il tessuto di biopsia macinato per rimuovere i detriti residui.
- Trasferire il tessuto muscolare in un tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di salina tampone fosfato (PBS) e consentire al tessuto di stabilirsi per gravità.
- Aspirare il supernatante facendo attenzione a non disturbare il tessuto muscolare.
- Aggiungere 10 mL di PBS al tessuto lavato e lasciare che il tessuto muscolare si reinseda per gravità.
- Aspirare il supernatante facendo attenzione a non disturbare il tessuto muscolare.
- Aggiungere 10 mL di basso glucosio Dulbecco modificato Aquila media (DMEM) e consentire al tessuto di reinsediarsi per gravità.
- Aspirare il supernatante facendo attenzione a non disturbare il tessuto muscolare.
- Incubare il tessuto nel supporto digerito.
- Risospendere il tessuto muscolare in 3 mL di supporti di digeribili (2 mg/mL collagenae D in DMEM a basso glucosio).
NOTA: Le soluzioni di stock di collagenase D possono essere preparate a 20 mg/mL in DMEM a basso glucosio e conservate a -80 gradi centigradi, quindi diluite 1:10 in DMEM a basso contenuto di glucosio al momento dell'uso. - Incubare il tubo contenente il tessuto muscolare in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 30 min.
- Triturare la sospensione del tessuto muscolare ogni 10 min utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL o un'ampia pipetta di foro.
- Aggiungete 83 l di supporti di gerdigeri supplementari e 24 l di soluzione di dispase (acetato di calcio da 0,76 mm, acetato di sodio 1,39 mM, 13,91 mg/mL dispase II in DMEM a basso glucosio). Riportare la sospensione al bagno d'acqua a 37 gradi centigradi.
- Triturare la sospensione del tessuto muscolare ogni 5-10 min con un'ampia punta pipet di foro.
- Continuare la triturazione fino a raggiungere un liurrio uniforme e per non superare di oltre 1,5 h per prevenire la digestione eccessiva.
NOT: Una sufficiente mincing del tessuto e l'attività enzimatica di collagenasi e dispasi possono avere un impatto sulla digestione del campione. Un liquame uniforme dovrebbe essere in grado di passare attraverso una normale punta di pipetta con un'occlusione minima dopo 1,5 h. Se un liquame uniforme non viene raggiunto dopo 1,5 h, verificare che la macidicazione del tessuto sia sufficiente e che il tessuto sia macinato alle dimensioni appropriate (passaggio 2.1.2). Inoltre, l'attività degli enzimi dovrebbe essere testata come molto al lotto variazione nell'attività enzimatica si verifica.
- Risospendere il tessuto muscolare in 3 mL di supporti di digeribili (2 mg/mL collagenae D in DMEM a basso glucosio).
- Pellet e bloccare nei supporti di recupero.
- Aggiungere 6 mL di mezzi di crescita (GM; 79% Siero Bovino del Prosciutto fetale, 1% di penicillina/streptomicina, fattore di crescita fibroblasto di base 5 ng/mL [bFGF], pH 7,4, passato attraverso un filtro da 0,22 m) al liquame muscolare.
- Pipette la sospensione attraverso un colino cellulare 70 m in un tubo conico 50 mL. Sciacquare il colino con altri 4 mL di GM.
NOT: Il campione può essere trasferito nuovamente in un tubo conico da 15 mL per facilitare la visualizzazione del pellet. Un volume di lavaggio maggiore può essere utilizzato se le rese cellulari successive sono basse. - Centrifuga a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente (RT).
- Aspirare il supernatante di essere sicuro di non interrompere il pellet. Scorrere il tubo per risospendere il pellet nel supporto rimanente. Se le celle non devono essere coltivate immediatamente procedere al passaggio 2.4.5 per le istruzioni sull'archiviazione a lungo termine, altrimenti procedere al passaggio 3.1.6.
NOT: Se si desidera una coltura immediata, GM nelle piastre di coltura cellulare deve essere pre-incubato (passaggi 3.1.1 e 3.1.2) prima che inizi l'elaborazione della biopsia. - Aggiungere 1,5 mL di supporti di congelamento della coltura delle cellule di ripristino (Tabella dei materiali) al pellet recuperato.
- Trasferire i liquami in un crioviale. Mettere il crioviale in un refrigeratore di velocità controllato con isopropanolo durante la notte a -80 gradi centigradi. Conservare il crioviale a -80 gradi centigradi fino a quando non è pronto per la cultura.
NOT: I crioviali contenenti liquami possono essere conservati in azoto liquido per un deposito a lungo termine (superiore a 1 mese). L'uso di un refrigeratore a velocità controllato da isopropanolo consente alle cellule di essere congelate riproducibilmente ad una velocità di 1 oC/ min con conseguente tasso ottimale di recupero delle cellule, come dimostra la fattibilità dopo il congelamento e una maggiore probabilità di attaccamento ai vasi di coltura cellulare9. In alternativa, può essere utilizzato un becher contenente isopropanolo RT, posto in un congelatore a -80 gradi centigradi.
3. Coltivare le cellule del Progenitore Muscolare Umano
- Scongelare il liquame muscolare.
- Prima dello scongelamento e della semina di hMCC, piastre di coltura cellulare pre-equilibrate in GM. Riempire i pozzi rimanenti con 500 gradi di supporto di base sterile (cioè F12) per evitare l'evaporazione durante la coltura a lungo termine.
NOT: Per le biopsie tra 50 g e 100 g, sono appropriati quattro pozzetti di una piastra di 24 pozzetti. Se il tessuto biopsia è inferiore a 50 g, due pozzi possono essere più appropriati. Detriti residui e basso numero di cellule impedisce l'uso di una tecnica di conteggio cellulare in questa fase; pertanto, l'esatta densità di seminazione non è determinata e varia leggermente dalla biopsia alla biopsia. - Incubare i vasi di coltura cellulare con GM a 37 gradi centigradi nel 5% di CO2 per 1 h prima della semina.
- Togliere i crioviali dal congelatore -80 gradi centigradi e metterli in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi; il liquido nel tubo deve essere completamente immerso in acqua.
- Quando lo scongelamento è quasi completo (5 minuti), trasferire il crioviale in uno sterile cappuccio laminare. Trasferire il liquame muscolare dal tubo crioviale e aggiungere a un tubo conico da 15 mL contenente 6 mL di GM preriscaldato ad una velocità di 1 mL/min.
- Centrifugare il liquame muscolare a 300 x g per 5 min a RT.
NOT: Una centrifuga a benna oscillante può rendere più facile visualizzare piccoli pellet in questo passaggio, ma non è essenziale. - Aspirare il supernatante di essere sicuro di non interrompere il pellet. Scorrere il tubo per risospendere il pellet nel supporto rimanente e risospendere in 1 mL di GM.
- Trasferire 250 l del pellet risospeso (ora considerato una sospensione hMPC) a ciascuno dei 4 pozzetti della piastra di coltura cellulare pre-incubata di 24 pozzetti.
- Prima dello scongelamento e della semina di hMCC, piastre di coltura cellulare pre-equilibrate in GM. Riempire i pozzi rimanenti con 500 gradi di supporto di base sterile (cioè F12) per evitare l'evaporazione durante la coltura a lungo termine.
- Cultura e passaggio hMPC.
- Mantenere le colture hMPC in GM a 37 gradi centigradi nel 5% di CO2.
NOT: Le scorte di GM senza bFGF (ad esempio, F12, antibiotici, FBS) sono preparate in lotti e conservate a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 settimane. bFGF viene aggiunto a GM il giorno dell'uso. I supporti contenenti bFGF possono essere conservati per 48 h a 4 gradi centigradi. - Ventiquattro ore dopo l'isolamento, aspirato il GM, lavare delicatamente il recipiente di coltura 2x con GM preriscaldato, e aggiungere GM fresco.
NOTA: 24 h devono fornire hMPC tempo sufficiente per allegare; non devono essere rimossi gli hMPC dopo il lavaggio. Questo passaggio rimuoverà anche i detriti rimanenti generati durante la raccolta delle cellule, rendendo il vaso più suscettibile alla scansione accurata della confluenza utilizzando un citometro di imaging (sezione 5 di seguito). Dopo questa modifica iniziale del supporto, GM viene modificato ogni 48 h. - Passare hMPC quando si raggiunge il 70% di confluenza o quando sono rimasti sullo stesso piatto di coltura per 10 giorni, a seconda di quale si verifica per primo.
NOTA: 70% confluenza è di circa 55.000 cellule / cm2. - Per il passaggio, aggiungere 250 l di prova preriscaldato a ogni pozzo di una piastra di coltura cellulare 24-well e incubare per 5 min.
- Toccare il recipiente di coltura cellulare su una superficie aziendale per staccare gli hMPC. Un microscopio leggero può essere utilizzato per verificare che gli hMPC si siano staccati.
- Trasferire le sospensioni trypsin/hMPC a 5 mL di GM in un tubo conico da 15 mL.
- Centrifugare la sospensione hMPC a 300 x g per 5 min a RT.
- Rimuovere le sospensioni hMPC dalla centrifuga e posizionare sul ghiaccio nella sterile cappa di flusso laminare.
NOT: Mantenere gli hMPC sul ghiaccio durante il passaggio si traduce in una minore aggregazione delle cellule. - Aspiratore supernatante da hMPC e resospendi delicatamente pellet in 1 mL di GM.
- Contare le celle utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare automatizzato.
NOT: Una diluizione 1:5 della sospensione cellulare al buffer di conteggio cellulare è generalmente appropriata. - HMCC di semi su piatti di coltura rivestiti di collagene contenenti GM preriscaldato ad una densità di 3.500 cellule per cm2. Una combinazione di piastre da 10 cm e piastre da 24 pozze è l'ideale. Le piastre a 24 pozzi possono essere scansionate quotidianamente su un citometro di imaging per monitorare la crescita.
- Seguire la stessa procedura (a partire dal passaggio 3.2.4.) per i passaggi successivi.
NOT: La salute e la purezza delle cellule possono essere monitorate attraverso i passaggi utilizzando un marcatore di senescenza cellulare (ad esempio, la galactosidasi) e l'immunostaining per Pax7.
- Mantenere le colture hMPC in GM a 37 gradi centigradi nel 5% di CO2.
- Criopreservare gli hMPC.
- Criopreserve cellule in eccesso per un uso successivo per rendere il volume di coltura più gestibile.
- Per la crioconservazione, seguire la procedura di provepinizzazione descritta nei passaggi 3.2.4.-3.2.9.
- Durante la centrifuga cellulare, preparare una miscela del 20% (ad esempio, 200 l) di zolfo dimetilo (DMSO) e dell'80% (ad es., 800 .L. GM. Pipette up and down 20x per garantire un'adeguata miscelazione. Lasciare riposare il composto sul ghiaccio.
- In base al numero di celle, diluire la sospensione hMPC a 2 x 106/mL in GM.
- Unire le sospensioni hMPC e la miscela d'OGM sterile del 20% 50/50. Il supporto di crioconservazione finale è una combinazione di DMSO (10%) e GM (90%) contenente 1 x 106 hMPC/mL.
- Posizionare 1 mL della sospensione hMPC preparata nel passaggio 3.3.5 in tutti i crioviali come il numero iniziale di celle consente. Quindi mettere gli hMPC con aliquota in un refrigeratore a velocità controllato da isopropanolo in un congelatore a -80 gradi durante la notte.
NOT: In questa fase, in genere si ottengono tra 5 e 15 milioni di cellule, il 30-60% delle quali è identificato come hMPCs dal FACS.
4. Isolamento pax7- Cellule progenitrici del soggetto muscolare umano tramite Citometria di flusso
- Per preparare gli HMPC da colture vive (passaggio 3.2.11), provare a fare clic su un numero sufficiente di recipienti di coltura per 1 x 106x 106 celle totali. Preparare le sospensioni delle celle come descritto nei passaggi 3.2.4.3.2.9.
- Preparare hMPC da culture crioconservate (passaggio 2.4.6 o 3.3.6).
- Selezionare un tubo contenente 1 x 106 passaggi o quattro HMPC per ciascun donatore.
NOT: L'utilizzo del passaggio di quattro HMPC consente un'adeguata resa cellulare pur mantenendo il potenziale di proliferazione fino al passaggio sei (Figura 2). - Scongelare rapidamente le cellule rimuovendole dal congelatore a -80 gradi centigradi e collocandole in un bagno d'acqua a 37 gradi con il liquido nel tubo completamente sommerso.
- Quando lo scongelamento è quasi completo (5 min), trasferire gli hMPC in un cofano sterile a flusso laminare e trasferire il contenuto della sospensione cellulare in 6 mL di GM preriscaldato in un tubo conico da 15 mL ad una velocità di 1 mL/min.
- Preparare le sospensioni delle celle come descritto nei passaggi 3.2.7-3.2.9.
- Risospendere ogni pellet in 3 mL di buffer FACS (500 mL PBS, 12,5 mL di siero di capra normale, 2 mL 0,5 M EDTA, pH 7,4, passato attraverso un filtro di 0,22 m).
- Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 min a RT.
- Aspiratore da hMPC e resospende delicatamente il pellet in 250 l di tampone FACS; posto sul ghiaccio.
- Collocare 100 celle in un tubo di microcentrifuga da 1,7 ml e lasciare sul ghiaccio per essere utilizzati come controlli vivi/morti (passaggio 4.5.1).
NOTA: I 100 ul di cellule da utilizzare per i controlli vivi / morti possono derivare dall'assunzione di un piccolo volume (20 ul) di cellule risospese da ogni donatore da ordinare o da cellule bancarie.
NOTA: È importante non prendere più di 20 ul di cellule risospese da un singolo donatore. Portare il volume fino a 100 ul con buffer FACS se è disponibile < 100 ul di celle.
- Selezionare un tubo contenente 1 x 106 passaggi o quattro HMPC per ciascun donatore.
- HMPC macchia per marcatori di superficie delle celle.
- Preparare il seguente cocktail anticorpale (le quantità mostrate sono per ogni coltura, scalabilità verticale in modo appropriato): 5 CD56 (molecola di adesione delle cellule neurali [NCAM]; PE-Cy7-coniugato) e 5 CD29 l (1-integrin; AlexFluor488-coniugato). La diluizione finale dell'anticorpo è 1:50.
- Aggiungere 10 l del cocktail anticorpo ad ogni sospensione hMPC e incubare sul ghiaccio per 30 min al buio.
- Aggiungere 10 mL di tampone FACS a ogni miscela di cocktail di sospensioni/anticorpi.
- Centrifugare ogni tubo a 300 x g per 5 min a RT.
- Risospendere il pellet in 300 o l di tampone FACS e trasferirlo in un tubo di polistirolo inferiore rotondo da 5 mL.
- Mantenere le sospensioni sul ghiaccio e protette dalla luce.
- Preparare le perline di compensazione.
NOTA: I controlli positivi per ogni anticorpo e un controllo negativo (perline non macchiate) devono essere preparati utilizzando perline di compensazione. I controlli del tallone di compensazione devono essere eseguiti sul citometro di flusso prima che i campioni vengano ordinati. Questi controlli consentono di determinare quanto il fluorocro da ogni anticorpo può essere rilevato nel canale dell'altro in modo che la compensazione possa essere applicata.- Perline di compensazione Vortex.
- In tre tubi di microcentrifuga da 1,7 mL, aggiungere una goccia (50 l) di perline di compensazione.
- Aggiungere 1 l'effetto di ogni anticorpo al tubo appropriato, o nessuno al controllo negativo.
- Incubare al buio per 15 min.
- Aggiungere 1,5 mL di buffer FACS a ciascun tubo e vortice.
- Centrifugare ogni tubo a 300 x g in una centrifuga da banco per 5 min a RT.
- Aspirato reato e resospendere il pellet in 200 l di tampone FACS.
NOT: Il pellet può essere molto difficile da visualizzare; attenzione deve essere presa quando aspirare il super-natante. - Posizionare le sospensioni in un tubo di polistirolo inferiore rotondo da 5 mL e quindi mantenere il tubo sul ghiaccio e protetto dalla luce.
- Preparare i controlli vivi e morti.
- Dividere i 100 lofoni dal passo 4.2.8 in due tubi di microcentrifuga da 1,7 ml (uno per il controllo in tempo reale e uno per il controllo morto).
- Posizionare il tubo di controllo morto in un blocco di riscaldamento preriscaldato a 70 gradi centigradi per >10 min. Durante questo periodo, mantieni il controllo in tempo reale sul ghiaccio.
- Centrifugare ogni tubo a 300 x g in una centrifuga da banco per 5 min a RT.
- Aspirare supernatante e risospendere il pellet in 150 l di tampone FACS.
- Combinare i controlli vivi/morti in un unico tubo di polistirolo inferiore rotondo da 5 mL.
- Eseguire la colorazione di vitalità.
- Aggiungete 1 -L di 7 aminoactinomicicina D (7-AAD) a tutti i tubi contenenti cellule da ordinare e al controllo vivo/morto.
- Aggiungete la GM alle piastre rivestite di collagene a 250 gradi (250 gradi centigradi) e a 10 cm (8 mL/pozzo) e lasciate eclabire in un'incubatrice a coltura cellulare a 37 gradi centigradi nel 5% di CO2.
- Ordinare gli hMPC tramite citometria di flusso.
- Ordinare gli hMPC su un citometro a flusso con un ugello di 100 m ad una pressione di 20 psi. Determinare hMPCS in tempo reale in base alla dispersione laterale e in avanti, nonché la negatività 7-AAD (l'ordinamento dei parametri e un ordinamento rappresentativo può essere visualizzato nella figura 3).
- Le celle positive per PE-Cy7 (780/60 nm) e AlexFluor488 (530/30 nm) rappresentano lecelle CD56e/CD29 e quindi sono cellule positive Pax7 (hMPC). Ordinare le cellule doppie positive in tubi di raccolta contenenti un cuscino da 300 l di tampone FACS.
NOT: La purezza delle colture ordinate può essere determinata dall'immunostaining per Pax7 seguito dall'analisi della citometria a valle (Figura 4). - Eliminare tutte le altre celle.
- Trasferire le celle ordinate in un tubo conico da 15 mL.
- Ruotare la sospensione hMPC a 300 x g per 5 min a RT.
- Aspirare con attenzione il supernatante e risospendere in 1 mL di GM.
- Contare le celle utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare automatizzato.
NOT: Mentre il numero di celle può essere dedotto come il numero di eventi che sono ordinati positivamente, questo conteggio è stato trovato per sopravvalutare il numero di celle di 10-40% rispetto ai metodi di conteggio delle celle tradizionali. - Eseguire il seedare gli hMPC come descritto nel passaggio 3.2.11.
NOT: La verifica della purezza della popolazione di hMPC può essere determinata mediante immunostaining per Pax7 e analisi tramite citometria di flusso.
5. Caratterizzare le colture della cellula progenitrice muscolare umana (hMPC) utilizzando un cytometro di imaging
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Utilizzare il citometro di imaging (Tabella dei materiali) per eseguire scansioni di confluenza.
- Selezionare Crea nuova scansione, quindi immettere/selezionare categoria piastra, Profilo piastra e ID piastra. Il citometro di imaging può ospitare 96, 24 e 6 lastre di pozzo.
- In Applicazioneselezionare Confluenza > Confluenza 1.
- Selezionare un pozzetto da visualizzare utilizzando il navigatore a destra dello schermo.
- Trovare un piano di messa a fuoco in cui le celle appaiono bianche rispetto allo sfondo e selezionare registra manuale o consentire al citometro di imaging di selezionare il piano di messa a fuoco selezionando registra auto.
NOT: Per le 96 piastre di pozzo suggerite nella Tabella deiMateriali, una posizione approssimativa è di 4,3 unità. - Utilizzare il mouse per evidenziare tutti i pozzi che devono essere scansionati. L'intera area del pozzo verrà scansionata automaticamente. Selezionare Avvia scansione.
- Selezionare le impostazioni di analisi ottimali per la piastra e il tipo di cella.
NOT: Per gli hMPC, le seguenti impostazioni sono ottimali: intensità : 6, intensità satura, 0, diametro, 8, spessore minimo, 3, dimensione minima del cluster e 500 e precisione: elevata. - Selezionare Avvia analisi.
NOT: Controllare visivamente le immagini per assicurarsi che l'utente e il citometro di imaging siano d'accordo sul perimetro delle cellule. Se esiste una discrepanza di grandi dimensioni, eseguire nuovamente la scansione della piastra utilizzando un piano di messa a fuoco diverso o impostazioni di analisi diverse. La scansione della confluenza può essere utilizzata per confrontare la crescita tra le culture, il tempo di somministrazione di un trattamento, o per monitorare le cellule e decidere quando avviare la differenziazione. Se si desidera differenziare, i dettagli sono forniti nella sezione 6.
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Utilizzare il citometro di imaging per contare le cellule.
- Preparare una soluzione di colorazione contenente 12 mL di F12 del Prosciutto, 6 -L di Hoechst 33342 e 24 L di iodide propidio.
- Aspirare i supporti e sostituire con una soluzione di colorazione, incubare a 37 gradi centigradi per 15 min.
- Soluzione di colorazione Aspirate e sostituzione con la F12 di Ham.
NOT: È importante utilizzare un supporto con bassi livelli di fenolo rosso per ottenere immagini chiare. In alternativa, è possibile utilizzare PBS. - Caricare la piastra sul citometro di imaging e in Applicazione, selezionare Viabilità cellulare > Live - Morto - Totale. Il canale dal vivo sarà un'immagine di campo luminoso, il canale morto sarà il propidium Iodide, e il canale totale sarà il Hoechst 33342.
- Impostare il campo Canale live su luminoso e fare clic su Registra auto in Impostazione messa a fuoco.
- Sotto il canale Totale, impostare il canale su blu. Utilizzare Trova messa a fuoco per mettere a fuoco i nuclei o utilizzare le frecce su e giù per impostare manualmente la messa a fuoco. Fare clic su Imposta offset per selezionare lo stato attivo.
- Sotto il canale Dead, imposta il canale su rosso. Usa Trova stato attivo per mettere a fuoco le celle morte o usa le frecce su e giù per impostare manualmente la messa a fuoco. Fare clic su Imposta offset per selezionare lo stato attivo.
- Selezionare Avvia scansione per avviare la scansione.
- Selezionare i parametri di analisi appropriati per la piastra e il tipo di cella. Selezionare Avvia analisi per avviare l'analisi. Una volta completata l'analisi, verificare visivamente che l'analisi conti in modo appropriato le celle (ad esempio, per il canale totale, verificare che ogni nucleo venga riconosciuto come nucleo e che il citometro di imaging non conti alcun punto sullo sfondo come nuclei). Se la scansione e l'analisi sono soddisfacenti, riportare la piastra all'incubatrice, altrimenti rieseguire la scansione o modificare i parametri di analisi.
6. Differenziazione delle cellule del Progenitore Muscolare Umano (hMPC) a Miotubi
- Determinare la confluenza hMPC utilizzando il protocollo nella sezione 5.1. Per differenziare gli hMP in miotubi, è ideale per le cellule essere confluenti dell'80-85% come determinato dalla funzione di confluenza sul citometro di imaging (vedi sezione 5). Se si utilizzano hMPC di più di un donatore unico, la scansione della confluenza consente alle cellule di donatori diversi di iniziare la differenziazione nel momento in cui raggiungono la confluenza.
NOT: Conunazione dell'80%, ci sono circa 66.000 cellule/cm2. - Lavare le cellule 2x con mezzi di differenziazione (97% Diham F12, 2% siero equine, 1% penicillina / streptomiacina, pH 7.4, passato attraverso un filtro di 0,22m).
- Mantenere le cellule in supporti di differenziazione per tutto il tempo che l'esperimento impone mentre si passa i supporti ogni giorno.
- Valutare direttamente la formazione di miotubi mediante immunostaining per la catena pesante embrionale della miosina, che è in genere rilevabile dopo 7-10 giorni di differenziazione.
NOT: Il tempo necessario per formare miotubi può differire leggermente a seconda del donatore e del numero di cellule quando è stata avviata la differenziazione; pertanto, si raccomanda di monitorare individualmente le colture di ciascun donatore.
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Representative Results
I risultati rappresentativi della citometria di flusso dell'isolamento da hMPC dal tessuto muscolare umano possono essere visualizzati nella Figura 1. Gli hMPC possono essere identificati mediante i primi eventi basati sulla dispersione laterale e sulla dispersione in avanti per eliminare le cellule morte o i detriti, seguiti dalla selezione solo delle cellule che sono negative per 7-AAD e quindi sono vitali. La selezione delle celle positive per entrambi i marcatori di superficie della cella CD56 e CD29 rappresenta la popolazione hMPC. Una biopsia di 60 mg fornisce solo circa 75-250 h50 hMPC.
Una scansione di confluenza rappresentativa è illustrata nella figura 2A. I contorni verdi nella Figura 2B sono stati generati dal citometro di imaging e mostrano come il citometro di imaging ha determinato la confluenza in base alle impostazioni di analisi selezionate. In entrambe le immagini mostrate, la confluenza determinata dal citometro di imaging concorda con la confluenza determinata visivamente dall'utente. Tuttavia, queste immagini evidenziano anche che il citometro di imaging non è perfetto. Ad esempio, la freccia rossa evidenzia un'imperfezione nella piastra che viene conteggiata come celle. Se un gran numero di queste imperfezioni sono presenti sulla piastra, la confluenza risultante non rappresenterà con precisione la confluenza delle cellule. La figura 2C mostra una rappresentazione di tutti e tre i canali utilizzati per contare le celle (campo luminoso, blu e rosso) e l'immagine unita. La figura 2D mostra l'eterogeneità tra i donatori. Scoprire e caratterizzare con precisione questa eterogeneità è un'applicazione chiave del citometro di imaging. La figura 2E mostra che le misurazioni della confluenza e i conteggi dei nuclei da donatori unici sono altamente correlati.
Nella figura 3 sono disponibili linee guida per l'identificazione degli HMPC in base alla procedura FACS descritta in questo protocollo. Il Gating basato sulla dispersione in avanti e laterale consente la separazione delle cellule vitali dai detriti (Figura3A). Un confronto tra dispersione in avanti e in avanti tra dispersione per area è stato utilizzato per distinguere gli eventi che rappresentano singole celle (l'area boxed nella figura 3B). Le cellule vitali sono caratterizzate da una mancanza di incorporazione della macchia di vitalità 7-AAD (Figura 3C). Infine, le celle positive sia per CD56 che per CD29 vengono identificate come hMPC (Figura 3D). Per convalidare la procedura FACS descritta in questo protocollo, la selezione delle cellule positive Pax7 può essere determinata dall'immunostainse delle cellule con un anticorpo specifico di Pax7 e misurando l'espressione su un citometro a flusso. Figura 4 confronta il numero di hMPC come determinato dall'immunostaining Pax7 (Figura 4A) rispetto alla procedura FACS (Figura 4B) dettagliata in questo protocollo dalla stessa popolazione di cellule. La figura 5 utilizza l'immunostaining e l'analisi Pax7 tramite citometria di flusso per mostrare l'arricchimento delle cellule che esprimono Pax7 nella popolazione totale dopo la FACS (Figura5A rispetto alla figura 5B) e la manutenzione del numero di Pax7 esprimere le celle dopo il passaggio (Figura 5B rispetto alla figura 5C).
Gli hMPC possono essere differenziati per formare miotubi seguendo la sezione 6. Per determinare se gli HMP, isolati, mantengono le cellule di capacità miogenica, possono essere immunostainse con un anticorpo specifico per la catena pesante embrionale della miosina e visualizzate utilizzando la microscopia fluorescente. Immagini rappresentative di miosina embrionale heavy catena micesia positivo può essere visto Figura 6.
Figura 1 : immagini di citometria di flusso rappresentative per hMPC ordinate direttamente dal tessuto della biopsia muscolare. (A) Area di dispersione laterale (asse y) rispetto alla strategia di gating dell'area di dispersione in avanti (asse x) utilizzata per identificare tutte le celle in un campione di donatore. (B) 7-AAD colorità di viabilità (asse y) rispetto a dispersione in avanti (asse x) per identificare le celle vive. (C) Profilo marcatore di ordinamento di selezione negativo (-CD11b, -CD31, -CD45, -GlyA [asse y]) rispetto al marcatore di selezione CD34. (D) Marcatore di selezione negativo CD34 (asse y) rispetto al marcatore di selezione positivo CD29. (E) Per quanto mi liriva Marcatore di selezione positivo CD56 (asse y) rispetto al marcatore di selezione positivo CD29 (asse x). (F) Rendimenti da tre diverse biopsie muscolari scheletriche. FSC- dispersione in avanti; SSC - dispersione laterale; HMC, cellule progenitrici del muscolo umano.
Figura 2 : Il potenziale di proliferazione degli HMPC derivati dai donatori umani viene mantenuto dopo 6 passaggi. (A) Scansione della confluenza rappresentativa. (B) Scansione rappresentativa della confluenza con contorni verdi che mostrano come il citometro di imaging determinasse la confluenza. La freccia rossa mostra un'imperfezione sulla piastra. (C) Rappresentante brightfield, Hoechst 33342 (blu) e propidium Iodide (rosso) colorazione e un'immagine unita di questi tre canali. Le barre di scala- 1 mm. (D) I nuclei contano da 6 donatori unici evidenzia l'eterogeneità hMPC. (E) La confluenza e il numero di nuclei sono altamente correlati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : parametri di ordinamento della citometria di flusso rappresentativo per l'isolamento hMPC. (A) Area di dispersione laterale (asse y) rispetto alla strategia di gating dell'area di dispersione in avanti (asse x) utilizzata per identificare tutte le celle in un campione di donatore. (B) Altezza della dispersione in avanti (asse y) e area di dispersione in avanti (asse x) per squalificare i doppi della popolazione di ordinamento. (C) Altezza della dispersione in avanti (asse y) rispetto all'incorporazione di 7-AAD per identificare le celle vitali. (D) PE-Cy7 (CD56) rispetto alla colorazione AF488 (CD29) con Q2 che rappresenta cellule a doppio risultato (HMP). Il colore rappresenta la densità degli eventi.
Figura 4 : Confronto tra positività CD29/CD56 e positività Pax7 nel passaggio di 4 hMPC dello stesso donatore. (A) Conteggio (asse y) e espressione Pax7 (asse x). (B) Per quanto mi risse in due Marcatore di selezione positivo CD56 (asse y) e marcatore di selezione positivo CD29 (asse x). NCAM - molecola di adesione delle cellule neurali; hMPC - cellula progenitrice muscolare umana.
Figura 5 : la positività Pax7 è mantenuta in HMCC derivati dallo stesso donatore su più passaggi. (A) Espressione Pax7 (asse x) di celle che erano state passate 4 volte prima dello smistamento FACS. (B) Espressione Pax7 (asse x) di hMPCs 1 passaggio dopo lo smistamento FACS per la positività CD29 e CD56 (5 passaggi totali). (C) Espressione Pax7 (asse x) di hMPCs 2 passaggi dopo lo smistamento FACS per la positività CD29 e CD56 (6 passaggi totali).
Figura 6 : colorazione dei miotubi derivati dall'hMPC per catena pesante di miosina embrionale. Immagini microscopiche rappresentative di HMPC differenziati co-macchiati con macchia di DNA (Hoechst 33342, blu) e catena pesante embrionale di miosina (verde) (n . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Gli HMCC primari sono un importante modello di ricerca utilizzato per comprendere la biologia muscolare scheletrica e il processo rigenerativo. Inoltre, gli HMPC hanno il potenziale per essere utilizzati per la terapia. Tuttavia, ci sono sfide riconosciute nell'utilizzo di hMPC primari e terapeutici, compresa la comprensione limitata delle cellule derivate dagli esseri umani10. C'è anche un grande grado di variazione nella capacità di espansione tra le colture dei donatori, che limita il potenziale di utilizzo degli HMPC e può influenzare i risultati della ricerca11. Ad esempio, è stato recentemente dimostrato che gli hMPC isolati utilizzando il metodo descritto in questo protocollo producevano cellule che variavano in capacità di espansione e questo era guidato da un profilo trascrizionale che non si allineava con il sesso o l'etàdi 11anni .
Qui, presentiamo un metodo efficiente e ad alto rendimento per isolare gli HMPC in quantità sufficienti per una serie di applicazioni a valle, tra cui la differenziazione in miotubi, modellando così il processo miogenico in vitro. Il nostro metodo si basa su FACS per isolare lecellule CD56-/CD29, che in precedenza sono state identificate come rappresentano una popolazione arricchita di Pax7 che esprime12. Sono state descritte anche altre strategie di smistamento delle celle altrettanto valide5,6.
L'aspetto più importante del nostro isolamento hMPC e metodo culturale è l'attenta monitoraggio delle singole culture. L'eterogeneità basata sui donatori comprende il numero di HMPC ottenuti da ogni biopsia, il loro tempo per avviare la proliferazione in vitro e il loro tasso di espansione della popolazione. Pertanto, se le differenze nella formazione del miotubo dopo un trattamento sono la questione dell'individuo di interesse, le colture hMPC dovrebbero essere trasferite al trattamento basato su un livello di confluenza determinato a priori e valutato oggettivamente utilizzando il citometro di imaging.
Il nostro metodo per isolare e coltura hMPCs è stato ottimizzato per ottenere rese di cellule in milioni per esperimenti in vitro da relativamente poco tessuto biopsia di partenza (50-100 mg). Il principale vantaggio di questo approccio è che più saggi ed esperimenti possono essere eseguiti su hMPC dello stesso donatore, consentendo il mantenimento del fenotipo del donatore attraverso gli esperimenti, introducendo al contempo poca variabilità inter-sperimentazione. Il nostro metodo differisce dai metodi pubblicati di recente che si concentrano sull'estrazione della popolazione più pura di Pax7 che esprime cellule direttamente dal tessuto biopsia dove il focus è lo xenotrapianto8. La sfida con questi metodi precedenti, tuttavia, è che richiedono un peso del tessuto iniziale di maggiore di un grammo. Pertanto, non sono pratici per la ricerca che coinvolge biopsie muscolari scheletriche umane. Una limitazione del nostro metodo è che il potenziale di xenotrapianto non è stato valutato. Tuttavia, questo tipo di procedura non era una delle applicazioni a valle originali previste. Le direzioni future di questo metodo possono includere la valutazione della capacità di innesto degli HMPC, dopo aver subito la nostra procedura di isolamento, per determinare se esiste un potenziale per l'uso di questa procedura negli studi di trapianto di MPC.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano la Cornell University, Biotechnology Resource Center Imaging Facility per il loro aiuto con lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza. Ringraziamo anche Molly Gheller per il suo aiuto con il reclutamento dei partecipanti ed Erica Bender per aver condotto le biopsie muscolari scheletriche. Infine, ringraziamo i partecipanti per il loro tempo e la partecipazione allo studio. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute on Aging of the National Institutes of Health con il award number R01AG058630 (a B.D.C. e A.E.T.), da una Glenn Foundation for Medical Research e dalla American Federation for Aging Research Grant for Junior Faculty (a B . D.C.), e dal Consiglio del Presidente per cornell Women (a.E.T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-Cl | Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels |
| 10 cm cell culture plate | VWR | 664160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 15 mL Falcon tube | Falcon | 352196 | 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols |
| 24 well cell culture plate | Grenier Bio-One | 662 160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | Viability stain for identifying living cells during FACS sorting |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 | BioLegend | 303016 | Conjugated antibody for FACS |
| Black 96-well cell culture plate | Grenier Bio-One | 655079 | 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S |
| Celigo S | Nexcelcom Bioscience | Imaging cytometer used to track hMPC cultures | |
| Cell Strainer | VWR | 352350 | Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing |
| Collagen Type I (Rat Tail) | Corning | 354236 | Collagen for coating cell culture plates |
| Collagenase D | Roche | 11 088 882 001 | Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue |
| Dimethyl Sulfoxide | VWR | WN182 | Used for cryopreservation of hMPCs |
| Dispase II | Sigma Life Sciences | D4693 | A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder | Gibco | 31600-034 | Low glucose DMEM for muscle biopsy processing |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 21600-010 | PBS for muscle biopsy processing |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | J.T. Baker | 4040-01 | Required for FACS buffer |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 89510-186 | Fetal bovine serum used for hMPC growth media |
| Ham's F12 | Gibco | 21700-026 | Base media for hMPCs |
| Heat Inactivated Equine Serum | Gibco | 26-050-070 | Horse serum used to make hMPC differentiation media |
| Hemocytometer | iNCyto | DHC-N0105 | Used to count cells |
| Hibernate A | Gibco | A1247501 | Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Life Technologies | H21492 | DNA stain for identifying all cells using the Celigo S |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P-4 | Used for controlled rate freezing of hMPCs |
| Moxi buffer | Orflo | MXA006 | Buffer for automated cell counter |
| Moxi Cassettes | Orflo | MXC002 | Cassesttes for automated cell counter |
| Moxi z Mini Automated Cell Counter | Orflo | Automated cell counter | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | Commerically available controlled rate cell freezing container |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Goat serum used in FACS buffer |
| PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 | BD Pharmingen | 557747 | Conjugated antibody for FACS |
| Penicillin/Streptomycin 100x Solution | Corning | 30-002-CI | Antibiotics added to culture media |
| Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S |
| Recombinant Human basic fibroblast growth factor | Promega | G5071 | Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Gibco | 12648-010 | Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | Added to Ham's F12 |
| Sterile Round Bottom 5 mL tubes | VWR | 60818-565 | Tubes used for FACS |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | Compensation beads fort calibrating flow FACS settings |
References
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